Montagem modular baseada em CRISPR para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF

A triagem genética imparcial do genoma completo é uma abordagem poderosa para identificar genes envolvidos em um determinado processo biológico e elucidar seu mecanismo. Portanto, é amplamente utilizado em vários campos da pesquisa biológica. Aproximadamente 60% dos genes de Drosophila são conservados em humanos ^1,2 e ~ 75% dos genes de doenças humanas têm homólogos em Drosophila³. A triagem genética é dividida principalmente em dois tipos: perda de função (LOF) e ganho de função (GOF). As telas genéticas LOF em Drosophila desempenharam um papel crítico na elucidação de mecanismos que governam quase todos os aspectos da biologia. No entanto, a maioria dos genes de Drosophila não possui fenótipos LOF^{óbvios 4} e, portanto, a triagem GOF é um método importante para estudar a função desses genes ^4,5.

O sistema binário GAL4 / UAS é comumente usado para expressão gênica específica do tecido em Drosophila⁶. Nesse sistema, o tecido expressa especificamente o ativador de transcrição de levedura GAL4 que se liga ao elemento responsivo GAL4 (UAS) e, assim, ativa a transcrição dos componentes genéticos a jusante (por exemplo, cDNA e ORF) ⁶ . Para realizar triagens GOF em todo o genoma em Drosophila, precisamos construir uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma e, posteriormente, uma biblioteca transgênica de UAS-cDNA/ORF em Drosophila.

A construção de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma por métodos convencionais a partir de clones de cDNA/ORF disponíveis publicamente é demorada e trabalhosa, pois cada gene requer projetos individualizados, incluindo design e síntese de primers, reação em cadeia da polimerase (PCR) e purificação em gel, sequenciamento, digestão de restrição e assim por diante ^7,8. Portanto, a construção de tal biblioteca de plasmídeos é uma etapa limitante da taxa na criação de uma biblioteca transgênica UAS-cDNA / ORF em todo o genoma em Drosophila. Recentemente, resolvemos com sucesso esse problema desenvolvendo um novo método, a montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass)⁹. O núcleo do CRISPRmass é manipular as sequências vetoriais compartilhadas de uma biblioteca de plasmídeos por meio de uma combinação de tecnologia de edição de genes e tecnologia de clonagem contínua.

Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRmass, que inclui reações massivamente paralelas em tubos de ensaio de duas etapas seguidas de transformação bacteriana. O CRISPRmass é um método simples, rápido, eficiente e econômico que, em princípio, pode ser usado para a construção de alto rendimento de várias bibliotecas de plasmídeos.

Estratégia CRISPRmass
O procedimento de CRISPRmass começa com reações paralelas em tubo de ensaio de duas etapas antes da transformação de Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). A etapa 1 é a clivagem dos esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF por Cas9 / sgRNA. Um local de clivagem ideal é adjacente à extremidade 5 'do cDNA / ORF. Os produtos de clivagem não precisam ser purificados. A etapa 2 é a inserção de um módulo UAS específico do vetor nos plasmídeos linearizados de cDNA/ORF Cas9/sgRNA pela montagem de Gibson (doravante denominada reação de etapa única), resultando em plasmídeos UAS-cDNA/ORF. As sequências terminais 5 'e 3' de um módulo UAS se sobrepõem às dos plasmídeos cDNA / ORF linearizados, permitindo a reação de etapa única.

Os produtos de reação de etapa única são diretamente submetidos à transformação de E. coli . Teoricamente, apenas as colônias UAS-cDNA/ORF desejadas podem crescer em placas Luria-Bertani (LB) que contêm antibióticos de seleção correspondentes ao gene de resistência a antibióticos do módulo UAS. O módulo UAS é composto por um módulo UAS central, um gene de resistência a antibióticos distinto daquele dos plasmídeos cDNA ou ORF e as sequências terminais 5 'e 3'. Um módulo UAS central compreende 10 cópias de UAS, um promotor mínimo de Hsp70, uma sequência attB para integração genômica mediada por phiC31 e um marcador de transformação mini-branco para Drosophila⁷.

1. Determinação do local ideal de clivagem de Cas9 / sgRNA a montante do cDNA / ORF

1. Preparação de plasmídeos de cDNA ou ORF com estrutura vetorial idêntica
   1. Compre clones de cDNA / ORF que estão disponíveis em recursos públicos, como o centro de recursos do genoma de Drosophila (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, a coleção de genes de mamíferos de camundongos (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) e a biblioteca de expressão lentiviral CCSB humana¹². Neste protocolo, tomamos como exemplo os clones de cDNA/ORF baseados em vetores pOT2, que estão disponíveis na DGRC Gold Collection.
   2. Extraia o DNA do plasmídeo usando um kit de mini-preparação de plasmídeo. Medir a concentração de plasmídeos com um espectrofotómetro.
2. Desenho de sgRNAs
   1. Visite o site do CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Clique no botão Colar alvo e, em seguida, insira a sequência de DNA de interesse. A sequência de interesse é uma região de 20-100 pb localizada no esqueleto do vetor pOT2 a montante da extremidade cDNA / ORF 5 '.
   2. Escolha a espécie Drosophila melanogaster. Clique no botão Localizar sites de destino. Escolha candidatos a sgRNA com uma eficiência prevista superior a 80%.
3. Preparação de sgRNAs
   1. Ordem oligos purificados por PAGE, um primer direto (5 '-TAATACGACTCACTATAGG (N) ₂₀GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3 ′) onde (N) ₂₀ é a sequência alvo de um sgRNA, e um sgRNA scaffold reverse primer sgRNA-REV (5 ′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3 ′).
      NOTA: Recomende o uso de oligonucleotídeos de alta qualidade purificados por PAGE.
   2. Preparar um molde de DNA por PCR para transcrição in vitro (IVT) de sgRNA. Configure uma reação de PCR de 100 μL da seguinte forma: 5 μL de modelo pX330 (plasmídeo Addgene 42230, um presente de Feng Zhang; 0,1 ng/μL), 5 μL de primer direto (10 μM), 5 μL de sgRNA-REV (10 μM), 50 μL de 2x mistura mestre de PCR de alta fidelidade e 35 μL de água tratada com dietil pirocarbonato (DEPC) em um tubo de PCR.
   3. Realizar a PCR utilizando as seguintes condições de termociclagem: 1 ciclo a 98 °C durante 30 s; 5 ciclos de 98 °C por 10 s, 51 °C por 10 s, 72 °C por 5 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 72 °C durante 15 s; 1 ciclo de 72 °C durante 2 min. Incube reações em um termociclador.
   4. Separe os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Um fragmento de DNA de ~ 120 pb deve ser visível no gel sob UV. Purifique o fragmento de DNA de ~ 120 pb usando um kit de extração de gel. O fragmento de DNA purificado serve como modelo para a IVT do sgRNA.
   5. Configure uma reação IVT de 5 μL da seguinte forma: 165 ng de fragmento de DNA de gel purificado de ~ 120 pb, 1,65 μL de mistura de tampão NTP, 0,33 μL de mistura de RNA polimerase T7 e água tratada com DEPC. Incubar reações a 37 °C durante 4 h. Siga as instruções manuais de um kit de transcrição in vitro .
   6. Adicione 45 μL de água tratada com DEPC ao produto da reação IVT. Trate os produtos da reação IVT como RNA e use água tratada com DEPC como controle em branco. Meça a concentração de sgRNA com um espectrofotômetro. A concentração de sgRNA diluído é de cerca de 870 ng/μL.
   7. Diluir o produto da reação IVT a 20 ng/μL com água tratada com DEPC. Alíquota e armazene o sgRNA diretamente a -80 °C.
      NOTA: Após a reação IVT, a remoção do molde de DNA pela digestão da DNase não é necessária para medir a concentração precisa de sgRNA, pois a quantidade do molde de DNA é inferior a 0,4% da do sgRNA e o molde de DNA não afeta a reação subsequente de massa CRISPR. Portanto, a purificação do sgRNA não é necessária.
4. Avaliação de sgRNAs
   1. Digerir um plasmídeo cDNA/ORF contendo estrutura de vetor pOT2 com uma enzima de restrição. Separe os fragmentos de DNA resultantes por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Purifique o substrato de DNA com um kit de extração de gel.
      NOTA: Um fragmento de DNA resultante contendo as sequências de direcionamento de sgRNA do esqueleto do vetor pOT2 serve como substrato de DNA de Cas9 / sgRNAs. Os locais de clivagem de Cas9 / sgRNAs estão localizados assimetricamente no substrato de DNA e, portanto, a clivagem do substrato de DNA por Cas9 / sgRNAs produz dois fragmentos de DNA de tamanhos diferentes, o que os torna mais fáceis de distinguir do substrato de DNA não clivado na reação de digestão.
   2. Configure uma reação de clivagem Cas9 de 5 μL da seguinte forma: 0,2 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,5 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,015 pmol de substrato de DNA, 0,5 μL de tampão Cas9 10x e água tratada com DEPC. Incubar as reações a 37 °C durante 1 h.
   3. Separe os produtos de clivagem por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Carregue o substrato de DNA intacto como um controle negativo para o substrato de DNA digerido.
      NOTA: Aqui, substrato de DNA intacto refere-se ao substrato de DNA que não é submetido a reações de digestão por Cas9 / sgRNAs. A clivagem do substrato de DNA por Cas9 / sgRNAs produz dois fragmentos de DNA de tamanhos diferentes, o que os torna mais fáceis de distinguir do substrato de DNA não clivado na reação de digestão.
   4. Analise os padrões de clivagem por um sistema de imagem digital (Figura 2). Selecione o sgRNA mais eficiente para experimentos CRISPRmass subsequentes. A Figura 2 mostra que todos os quatro sgRNAs exibem alta eficiência de clivagem e podem ser usados para CRISPRmass. Selecione o sgRNA sublinhado para experimentos subsequentes.
      NOTA: Quanto menor for o substrato de DNA não clivado, mais eficiente será o sgRNA para a digestão de Cas9 / sgRNA do substrato de DNA.

2. Construção de um módulo UAS

NOTA: Um módulo UAS compreende um UAS central e cerca de 20-40 bp das sequências terminais 5 'e 3' sobrepostas às extremidades 5 'e 3' do local de clivagem da espinha dorsal, respectivamente (Figura 1). As sequências terminais 5 'e 3' do módulo UAS são determinadas pelo local de clivagem da espinha dorsal do vetor pOT2.

1. Clone o módulo UAS específico do vetor pOT2 no local EcoRI do vetor pCR8GW, resultando no plasmídeo pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (Arquivo Suplementar 1). Liberar o módulo UAS específico do vetor pOT2 por digestão do plasmídeo pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 com EcoRI a 37 °C por 1 h.
2. Separe os produtos de clivagem por eletroforese em gel de agarose a 0,7%. Purifique o módulo UAS de 6178 pb com um kit de extração de gel. Diluir o módulo UAS a 23 ng/μL para experimentos subsequentes. Este fragmento de 6178 pb serve como um módulo UAS para a construção de plasmídeos UAS-cDNA/ORF a partir de clones de cDNA/ORF baseados em vetor pOT2.

3. Construção em larga escala de plasmídeos UAS-cDNA/ORF por CRISPRmass

NOTA: CRISPRmass é padronizado como reações massivamente paralelas em tubo de ensaio de duas etapas antes da transformação de E. coli (Figura 1).

1. Etapa 1 da reação do tubo de ensaio
   1. Clivar os esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF por Cas9 / sgRNA. Disponha os tubos de 0,2 mL em um bloco de resfriamento de alumínio sobre gelo e etiquete os tubos com cuidado. Prepare a mistura principal da seguinte maneira.
      1. Para uma única reação, adicione 0,16 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,4 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,24 μL de tampão 10x Cas9, 1,2 μL de água tratada com DEPC. Para reações N, adicione (N + 1) x 0,16 μL de 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N + 1) x 0,4 μL de 20 ng / μL de sgRNA, (N + 1) x 0,24 μL de 10x tampão Cas9, (N + 1) x 1,2 μL de água tratada com DEPC.
   2. Vórtice, misture bem e gire para baixo. Alíquota de 2 μL de master mix para cada tubo. Adicione 0,4 μL de 0,019 μM de plasmídeo cDNA/ORF a cada tubo. Incubar reações de clivagem a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: Dilua cada plasmídeo a 0,019 μM com água tratada com DEPC. Se a concentração de um plasmídeo for inferior a 0,019 μM, adicione DNA de plasmídeo diretamente à reação de clivagem. Use tubos sem RNase e água tratada com DEPC. A execução dessas etapas em grande escala levará várias horas. Salvo indicação em contrário, manter os reagentes e as reações no gelo.
2. Etapa 2 de reação do tubo de ensaio
   1. Insira um módulo UAS específico do vetor da etapa 2 nos plasmídeos cDNA/ORF linearizados Cas9 por meio do conjunto de reação de etapa única. Configure uma reação de etapa única de 1,4 μL para cada amostra. Disponha os tubos de 0,2 mL em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo e rotule os tubos com cuidado.
      1. Prepare a mistura principal da seguinte maneira. Para uma única reação, adicione 0,07 μL de módulo UAS de 0,006 μM e 0,7 μL de master mix de montagem de reação de etapa única. Para reações N, adicione (N+1) x 0,07 μL de módulo UAS de 0,006 μM e (N+1) x 0,7 μL de master mix de montagem de reação de etapa única.
   2. Vórtice, misture bem e gire para baixo. Alíquota de 0,77 μL da mistura principal para cada tubo. Adicione 0,7 μL de plasmídeo cDNA/ORF linearizado Cas9 a cada tubo. Incubar reações a 50 °C durante 1 h.
      NOTA: A purificação de produtos de reação de montagem de etapa única não é necessária. A execução dessas etapas em grande escala leva várias horas. Salvo indicação em contrário, manter os reagentes e as reações no gelo.
3. Transforme produtos de reação de montagem de etapa única em E. coli em larga escala.
   1. Pré-resfriamento de 10 μL a 4 °C. Pré-resfriamento de tubos de 1,5 mL em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo.
   2. Descongele células competentes de E. coli no gelo por 5 min. Alíquota de 10 μL de células competentes para cada tubo pré-resfriado de 1,5 mL.
      NOTA: Use células de E. coli competentes disponíveis comercialmente com uma eficiência de transformação de pelo menos 1 x 10⁸ UFC / μg de pUC19 DNA.
   3. Adicione 1 μL de produto de reação de montagem de etapa única a 10 μL de células competentes, agite suavemente para misturar e coloque no gelo por 30 min.
   4. Incubar os tubos em banho-maria a 42 °C durante 1 min e, em seguida, refrigerar imediatamente no gelo durante 2 min.
   5. Adicione 100 μL de meio SOC (pré-aquecido a 37 ° C) em cada tubo à temperatura ambiente e incube em uma incubadora agitada (250 rpm) a 37 ° C por 1 h.
   6. Aquecer até 37 °C as placas LB que contêm um antibiótico correspondente ao gene de resistência aos antibióticos do módulo UAS. Espalhe as células nas placas e incube a 37 °C durante a noite.
      NOTA: A execução dessas etapas em grande escala leva várias horas. Salvo indicação em contrário, manter os reagentes e as reações no gelo.
4. Verifique os plasmídeos UAS-cDNA/ORF construídos pelo CRISPRmass
   1. Escolha uma única colônia e inocule-a em 4,5 mL de meio líquido LB suplementado com a seleção apropriada de antibióticos correspondentes ao gene de resistência a antibióticos do módulo UAS. Incubar durante a noite a 37 °C agitando a 250 rpm.
   2. Extraia o DNA do plasmídeo usando um kit de mini-preparação de plasmídeo. Configure uma reação de digestão de restrição de 20 μL da seguinte forma: 300-500 ng/μL de plasmídeo, enzima(s) de restrição apropriada(s), tampão de digestão de restrição e água ultrapura. Incubar as reações a 37 °C durante 1 h.
   3. Separe os fragmentos de DNA por eletroforese em gel de agarose a 0,8% e analise por um sistema de imagem digital (Figura 3).

Aplicamos o CRISPRmass para gerar uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma usando 3402 clones de cDNA/ORF com esqueleto vetorial pOT2 da DGRC Gold Collection. Analisamos aleatoriamente apenas uma colônia para cada construção UAS-cDNA/ORF, e a análise de restrição subsequente com PstI indicou que 98,6% das construções UAS-cDNA/ORF foram criadas com sucesso9. A justificativa para o uso de PstI para análise de restrição de construções UAS-cDNA/ORF com estrutura vetorial pOT2 é a seguinte. Existem dois locais PstI no módulo UAS para os clones de cDNA/ORF baseados em vetor pOT2, e há um local PstI no backbone do vetor pOT2. Assim, a digestão de uma construção UAS-cDNA/ORF baseada em vetor pOT2 com PstI produz um fragmento específico do módulo UAS de 408 pb e um fragmento específico do conjunto do módulo vetorial UAS de 5649 pb. Os fragmentos de PstI de 408 pb e 5649 pb indicam que as construções UAS-cDNA/ORF para clones de cDNA/ORF baseados em vetor pOT2 são criadas com sucesso, e os resultados representativos são mostrados na Figura 3.

Figura 1: Fluxograma da construção da biblioteca UAS-cDNA/ORF usando CRISPRmass. O pipeline CRISPRmass para a construção de uma biblioteca UAS-cDNA/ORF. (1) A reação do tubo de ensaio da primeira etapa. Os esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF são clivados por Cas9 / sgRNA. O local de clivagem está em backbones vetoriais adjacentes a montante da extremidade cDNA / ORF 5 '. Os produtos de clivagem, sem purificação, são submetidos diretamente à segunda etapa da reação do tubo de ensaio. Os sgRNAs utilizados nas reações de clivagem são preparados por transcrição in vitro e podem ser utilizados diretamente sem purificação. Então, 28-40 pb da extremidade 5 ′ do local de clivagem (caixa amarela) é definido como sobreposição final de 5 ′ e 28-40 pb da extremidade 3 ′ do local de clivagem (caixa vermelha) é definido como sobreposição final de 3 ′. A espinha dorsal do vetor carrega o gene de resistência ao antibiótico A (caixa verde). (2) O segundo passo é a reação do tubo de ensaio. Um módulo UAS específico do vetor é unido aos plasmídeos cDNA/ORF linearizados Cas9 logo a montante da extremidade cDNA/ORF5′ por meio de montagem de reação de etapa única, resultando em construções UAS-cDNA/ORF. Os produtos de montagem de reação de etapa única são submetidos diretamente à transformação de E. coli . Os transformantes são selecionados em placas de ágar LB contendo o antibiótico B correspondente ao gene de resistência ao antibiótico B (caixa marrom) do módulo UAS específico do vetor. Apenas as colônias UAS-cDNA/ORF desejadas podem crescer. Um módulo UAS compreende 10 cópias de UAS, um promotor mínimo de Hsp70, uma sequência attB para integração genômica mediada por phiC31, um marcador de transformação mini-branco para transgênese de Drosophila , um gene de resistência a antibióticos B selecionável para seleção positiva e a sobreposição de extremidade 5 'e sobreposição final 3' permitindo a montagem de reação em etapa única. O conjunto de reação de etapa única filtra quaisquer clivagens potenciais de DNA fora do alvo causadas por CRISPR/Cas9. Este número foi modificado de9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Avaliação de sgRNAs direcionados a regiões específicas da estrutura do vetor pOT2 por análise de clivagem Cas9 in vitro . Os sgRNAs sublinhados são selecionados para CRISPRmass. M é o marcador de DNA. Este número foi modificado de9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise de restrição de 20 construções UAS-cDNA/ORF geradas por CRISPRmass. Os construtos foram analisados por digestão de PstI. Os padrões de restrição esperados para todas as construções UAS-cDNA/ORF foram observados. M é o marcador de DNA. Este número foi modificado de9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Construção do plasmídeo pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70. O módulo UAS específico do vetor pOT2 contendo o plasmídeo pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 é construído com base em três plasmídeos, pMartini-Amp, pBS-attB-UAS-Hsp70 e pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a divulgar.