Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.

Resumo

Os organoides retinianos (ROs) são um sistema de cultura tridimensional que imita as características da retina humana que se diferenciaram das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) sob condições específicas. O desenvolvimento e a maturação da sinapse em ROs têm sido estudados imunocitoquímica e funcionalmente. No entanto, a evidência direta da ultraestrutura de contato sináptico é limitada, contendo sinapses de fita especiais e sinapses químicas convencionais. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é caracterizada por alta resolução e uma história respeitável elucidando o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos e várias espécies. É uma ferramenta poderosa para explorar a estrutura sináptica em ROs e é amplamente utilizada no campo de pesquisa de ROs. Portanto, para explorar melhor a estrutura dos contatos sinápticos de RO em nanoescala e obter evidências microscópicas de alta qualidade, desenvolvemos um método simples e repetível de preparação de amostras de RO TEM. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo a preparação da fixação do RO, pós-fixação, incorporação e visualização.

Introdução

A retina, um órgão sensorial visual vital em humanos e mamíferos, exibe uma estrutura laminada distinta caracterizada por três camadas nucleares que abrigam somas de neurônios e duas camadas plexiformes formadas por conexões sinápticas¹, incluindo sinapses convencionais e a sinapse de fita especializada ^2,3. A sinapse da fita desempenha um papel crucial na transmissão de impulsos de vesículas de maneira gradual ^2,3. O processo de visão envolve a transmissão de sinais eletro-ópticos através de vários níveis de neurônios e sinapses, atingindo o córtex visual ^4,5.

Os organoides retinianos (ROs) representam um sistema de cultura tridimensional (3D) derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), mimetizando os estados fisiológicos do tecido retiniano in vitro ^1,6,7. Essa abordagem é promissora para estudar doenças da retina⁸, triagem de drogas⁹ e servir como uma terapia potencial para condições degenerativas irreversíveis da retina, como retinite pigmentosa¹⁰ e glaucoma¹¹. Como um poderoso sistema de condução óptica in vitro, a sinapse dentro das ROs é uma estrutura crucial que facilita a transformação e transferência efetivas^{do sinal 5}.

O desenvolvimento de RO pode ser dividido em três estágios de acordo com suas características morfológicas e perfis de expressão molecular ^6,12. As ROs no estágio 1 (em torno de D21-D60) compreendem células progenitoras neurais da retina, muitas células ganglionares da retina (RGCs) e algumas células amácrinas starburst (SACs), correspondendo à primeira época do desenvolvimento fetal humano. No estágio 2 (em torno de D50-D150), as ROs expressam alguns precursores de fotorreceptores, interneurônios e genes relacionados à sinaptogênese, o que representa uma fase de transição. Os fotorreceptores desenvolvem maturidade no estágio 3 ROs (por volta de D100-D150), correspondendo ao terceiro estágio do desenvolvimento fetal humano ^6,12,13. Notavelmente, em comparação com ROs no estágio 1 e estágio 2, os ROs no estágio 3 têm uma estrutura lamelar distinta cujas sinapses amadureceram¹², incluindo a presença de sinapses de fita¹⁴. Além disso, um estudo recente confirmou que as sinapses maduras existem na transmissão de sinais luminosos, indicando que são funcionais¹³. Assim, os ROs no estágio 3 são frequentemente selecionados para investigar a estrutura sináptica.

A imuno-histoquímica é amplamente aplicada ao estudo da expressão de várias proteínas moleculares. No entanto, a limitação da microscopia óptica reside em sua capacidade de observar apenas um número restrito de células e moléculas específicas por vez, resultando na falta de uma análise abrangente das relações entre as células e o ambiente circundante. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é caracterizada por alta resolução, com resolução limitada de 0,1-0,2 nm, superando o microscópio óptico em ~10-20 vezes¹⁵. Ele compensa os defeitos da microscopia óptica e é usado para elucidar o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos^16,17 e várias espécies 18,19,20,21. O MET permite a distinção direta dos componentes pré-sinápticos e pós-sinápticos^18,20 e até permite a observação abrangente de estruturas subcelulares, como fitas ^2,3, vesículas²² e mitocôndrias²³. Portanto, o MET é uma ferramenta essencial para identificar tipos de sinapses e explorar a ultraestrutura dos contatos sinápticos em ROs em nanoescala.

É crucial observar que a preparação da amostra é de grande importância para a aquisição de micrografias eletrônicas de alta qualidade. Embora alguns estudos tenham realizado ME em ROs 12,13,24, os procedimentos detalhados não são claros. Como a qualidade da imagem de microscopia eletrônica depende em grande parte do efeito da fixação do RO e da permeação do reagente, vários fatores importantes precisam ser considerados durante a preparação. Consequentemente, para melhor investigar os contatos sinápticos em ROs, apresentamos um método com boa reprodutibilidade que mostra os pontos de operação de fixação de RO, incorporação e identificação de locais de observação.

Protocolo

1. Obtenção de ROs de iPSCs²⁵

NOTA: Os ROs foram derivados de iPSCs modificando o procedimento relatado anteriormente.

1. Dissocie iPSCs em ~ 90% de confluência usando uma protease bacteriana (consulte a Tabela de Materiais). Corte as colônias em pedaços e raspe-os com um levantador de células.
2. Após a coleta, ressuspenda os aglomerados de células em 0,25 mL de Matrigel gelado. Após 20 min de incubação a 37 °C, espalhe o gel solidificado com o meio DMEM/F12 (suplemento de N2 a 0,5%, suplemento a B27 a 1%, β-mercaptoetanol a 0,1 mM, substituto de L-glutamina a 0,2 mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 mg/mL). Defina esse tempo como dia 0 de diferenciação.
3. Após 5 dias de cultura flutuante, as células se agrupam para formar cistos celulares. Transfira esses cistos celulares para uma placa de Petri de 100 mm, onde eles agora irão aderir e crescer.
4. No dia 15, use protease bacteriana para dissociar as células aderentes e cultive-as em meio DMEM/F12 (suplemento de B27 a 2%, aminoácidos não essenciais 0,1 mM).
5. No dia 21, troque o meio por 20 mL de meio contendo soro (meio DMEM/F12, 8% de FBS, suplemento de B27 a 2%, 100 mM de taurina e 2 mM de substituto de L-glutamina) e substitua o meio todas as semanas.

2. Fixação anterior de ROs

1. Mova suavemente uma das ROs cultivadas (~ D180, um tamanho de cerca de 1 ~ 2 mm de diâmetro é o ideal) da placa de Petri para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com uma pipeta e marque as informações relevantes sobre as ROs.
   NOTA: Corte as ROs ao meio ou corte o tecido mal estruturado com uma navalha ao microscópio no prato que contém o fixador se as ROs forem muito grandes.
2. Remova o meio de cultura de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com uma pipeta. Adicione 1,5 mL de fixador de paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2% diluído em tampão fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4, e fixe em temperatura ambiente (RT) por 4 h. Armazene os tubos da microcentrífuga a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Esta etapa pode ser pausada por 1 semana, mas recomenda-se reiniciar o mais cedo possível. Se os ROs forem deixados por mais tempo, pode causar autólise das células, levando à destruição da ultraestrutura dos ROs. Devido à fragilidade das ROs, evite operações rotativas, oscilantes, inversões ou severas.

3. Pós-fixação de ROs

1. Remova o fixador de paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2% e lave com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS) em pH 7,4 por 3 x 10 min. Suspenda suavemente as ROs nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL durante o processo de lavagem para enxaguar completamente. Para cada dia adicional de fixação, aumente o número de lavagens em duas para remover o fixador residual o máximo possível.
2. Remova qualquer PBS restante usando uma pipeta e substitua-o por ~ 150 μL de ácido ósmico a 1% (OsO4) até que os blocos de tecido estejam submersos. Coloque os tubos da microcentrífuga em uma caixa escura para protegê-los da luz e se infiltrar em RT por 1 h.
   NOTA: OsO4 é um oxidante forte e deve ser manuseado em uma capela de exaustão.

4. Coloração e desidratação

NOTA: O desumidificador deve ser ligado para secar o ambiente a partir desta etapa.

1. Remova OsO4 usando uma pipeta, lave com PBS 0,01 M (pH 7,4) 3 x 10 min e, em seguida, lave 3 x 10 min com água deionizada.
   NOTA: Para garantir o enxágue completo das ROs, recomendamos suspender as ROs. Aspire OsO4 em um frasco de descarte dedicado.
2. Remova a última lavagem com água deionizada e substitua por ~ 150 μL por tubo (garanta a infiltração total dos blocos de tecido) de acetato de urânio e manche por 1-2 h em RT. Proteja os tubos da microcentrífuga da luz.
3. Retirar o acetato de urânio e substituí-lo por 1 mL de acetona a 50% na hotte, desidratando durante 10 min. Em seguida, use acetona 70%, 80%, 90%, 100% e 100% para desidratação gradiente das ROs sucessivamente. Cada desidratação dura 10 min.
   NOTA: Deixe um pouco de líquido para embeber os ROs para cada troca para evitar a exposição ao ar e à umidade. Além disso, opere rapidamente o mais rápido possível porque a acetona é volátil. Aspirar o acetato de urânio para um frasco de eliminação específico.

5. Infiltração

1. Descarte a acetona e adicione ~ 150 μL da mistura composta por acetona e resina Epon-812 na proporção de 1:1. Leve ao forno a 37 °C por 1 h.
2. Remova a mistura acima e substitua-a por uma mistura composta de acetona e resina Epon-812 na proporção de 1:4. Coloque-o em um forno a 37 ° C durante a noite.
3. Transfira os ROs para os novos tubos contendo ~ 500 μL de resina epóxi pura com cuidado e coloque-os em um forno a 45 ° C por 1 h.

6. Incorporação

1. Prepare os 30-50 mL de resina epóxi pura em um tubo de centrífuga de 50 mL misturando o kit de reagentes de acordo com as instruções do fabricante com antecedência. Gire a resina epóxi pura de cabeça para baixo lentamente por 30 min para reduzir as bolhas de ar introduzidas pelo misturador. Em seguida, deixe em forno a 37 °C por 20 min. Adicione 2/3 do volume de resina epóxi pura à ranhura do molde de incorporação.
2. Use um palito para pegar ROs no molde de incorporação equipado com resina epóxi pura.
3. Preencha a ranhura com resina epóxi pura até que ela se projete ou fique ligeiramente saliente.
4. Ajuste a posição das ROs em ambas as extremidades do molde de incorporação para incorporação direcional. Coloque o molde de embutir em um forno a 45 °C por 1-2 h e depois coloque-o em um forno a 65 °C por 48-72 h.

7. Posicionamento semifino

1. Lixe o excesso de resina epóxi ao redor do tecido das extremidades dos quatro lados mais longos do bloco de incorporação para formar uma face trapezoidal. Instale o bloco de incorporação no suporte de montagem de amostra e aparafuse o parafuso com uma chave de fenda L. Em seguida, instale facas de vidro no suporte da faca e aperte a porca manualmente.
2. Apare o excesso de resina até que a área desejada seja exposta.
3. Encha a calha da faca de vidro com água. Corte fatias semifinas com uma espessura de 1 μm usando um micrótomo semifino e coloque-as em uma lâmina de microscópio com uma agulha.
4. Adicione 50 μL de azul de toluidina a 1% para tingir fatias semifinas e incube por 1 min a 95 °C na placa de aquecimento. Enxágüe com água destilada por 2 min. Use um microscópio óptico comum de 20x para observar a estrutura das seções.

8. Seccionamento ultrafino

1. Instale os blocos de embutir e as facas de vidro conforme descrito na etapa 7.1. Ajuste a distância entre a faca e o bloco de tecido, o nível do líquido da pia e a velocidade de corte. Corte as seções ultrafinas com espessura de ~ 70-100 nm com um micrótomo ultrafino e coloque as fatias na malha de cobre (200 mesh) com o filme de suporte.
2. Pinte seções ultrafinas com citrato de chumbo a 3% por 15 min para aumentar o contraste em um procedimento de coloração dupla.

9. Imageamento de ROs por TEM

1. Inicie o software (consulte a Tabela de Materiais).
2. Clique no botão Modo de memória e marque cada seção ultrafina aproximadamente.
3. Procure estruturas sinápticas.
   1. Distinguir a estrutura laminada de ROs em baixa ampliação.
   2. Localize a camada nuclear externa (ONL), que mostra uma estrutura nuclear com uma densidade eletrônica mais profunda. Posteriormente, navegue até o terminal do fotorreceptor, onde numerosas vesículas se acumulam. Procure os terminais de haste com uma única fita sináptica e os terminais de cone com várias fitas sinápticas.
   3. Vá para a camada plexiforme interna (IPL) e procure uma estrutura semelhante com uma pequena fita.
4. Capture a imagem microscópica.
   1. Clique em Iniciar e insira a potência de ampliação correspondente.
   2. Salve as imagens.

Resultados

O estabelecimento de ROs 3D por meio da diferenciação de iPSC fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos de doenças da retina e a terapia de reposição de células-tronco. Embora outros tenham demonstrado as conexões sinápticas em ROs funcional e imunocitoquimicamente, a evidência direta de sinapses convencionais e de fita é muito limitada. Aqui apresentamos um método para investigar a ultraestrutura de dois tipos de sinapses em ROs por MET. Após 180 dias de cultivo, as ROs foram fixadas, coradas, embutidas e cortadas em fatias ultrafinas. A observação do MET revelou sinapses de fita nos terminais axonais dos fotorreceptores (Figura 1 e Figura 2), que estão distribuídas no OPL. Sob TEM, fitas de bastonetes esférulas ao redor da invaginação sináptica, formando um perfil em forma de ferradura com células horizontais (Figura 1). Os bastonetes normalmente têm apenas uma única fita, mas os cones têm várias fitas (Figura 2). Além disso, foram observadas sinapses químicas clássicas entre células amácrinas no IPL (Figura 3). Sob o TEM, a sinapse química consiste em três partes: a pré-sináptica, a fenda sináptica e a pós-sináptica. As membranas celulares correspondentes às partes pré-sinápticas e pós-sinápticas são ligeiramente mais espessas do que o resto das partes, e a lacuna estreita entre as duas membranas é chamada de fenda sináptica. Existem muitas vesículas sinápticas no citoplasma do local da membrana pré-sináptica. Este estudo confirma a presença de conexões sinápticas completas em ROs 3D derivadas de iPSC. No entanto, deve-se notar que o enxágue incompleto entre as etapas levaria à precipitação de partículas pretas durante o processo de preparação da amostra (Figura 4).

Figura 1: Imagens TEM de sinapses de fita de bastonete em ROs. (A, B) Bastonetes e células horizontais formam um perfil em forma de ferradura. Uma única fita (pontas de setas) foi observada em cada esférula de bastonete no OPL das ROs, cercada por numerosas vesículas. Barras de escala = 0,2 μm. Abreviaturas: ROs = organoides da retina; HC = célula horizontal; OPL = camada plexiforme externa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens TEM de sinapses de fita de cone em ROs. Três sinapses de fita (pontas de setas) eram óbvias em um pedículo de cone no OPL de ROs. Barra de escala = 0,2 μm. Abreviaturas: TEM = microscopia eletrônica de transmissão; ROs = organoides da retina; OPL = camada plexiforme externa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem MET de sinapses químicas em ROs. Uma sinapse química convencional foi observada entre células amácrinas na camada IPL de ROs. A sinapse química consiste em três partes: a pré-sináptica, a fenda sináptica e a pós-sináptica. Existem muitas vesículas sinápticas no citoplasma do local da membrana pré-sináptica. Uma seta denota a direção da transmissão sináptica, indicando a transferência de numerosas vesículas de um processo AC1 para outro perfil AC2. Barra de escala = 0,2 μm. Abreviaturas: TEM = microscopia eletrônica de transmissão; ROs = organoides da retina; IPL = camada plexiforme interna; ACs = células amácrinas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Um exemplo de um problema que pode ocorrer durante o processo de preparação da amostra. Existem muitas partículas pretas (círculos) no pedículo do cone devido ao enxágue incompleto entre as etapas. Setas: sinapse de fita. Barra de escala = 0,2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para observação da ultraestrutura sináptica convencional e de fita em ROs por TEM. Esse protocolo é baseado nos métodos de preparo retiniano descritos anteriormente com algumas modificações²⁰. Para melhorar a taxa de sucesso do tratamento da amostra e a qualidade das micrografias de MET, considere os seguintes pontos-chave. Em primeiro lugar, é importante reconhecer que as ROs se desenvolvem a partir de iPSCs, formando uma massa celular sem vasculatura ^6,26 e células gliais²⁶. Essa ausência pode levar a uma organização menos compacta em comparação com a retina in vivo. Assim, é crucial manusear Ros com cuidado para manter sua estrutura e integridade. Adicione líquidos ao longo da parede do tubo para minimizar a perturbação.

É importante garantir a desidratação completa do tecido na etapa 4 do protocolo e ligar o desumidificador para reduzir a umidade ambiente antes de iniciar a etapa de desidratação. Ao substituir a acetona, opere rapidamente e deixe um pouco de líquido submergir o tecido, evitando a destruição severa da estrutura do tecido RO. O tecido não desidratado se contrai acentuadamente em altas altitudes EM, e a água no tecido dificulta a penetração do agente de inclusão.

Como as ROs se apresentam como esferas transparentes, garanta a direção correta ao cortar fatias semifinas para obter estruturas lamelares intactas. Por fim, as ROs no estágio 3 (por volta de D100-D150) são consideradas maduras e possuem sinapses integrais¹², como resultado, recomenda-se que a investigação de contatos sinápticos, incluindo sinapses de fita e sinapses químicas, seja conduzida nessas ROs.

Embora a prova ultraestrutural limitada das sinapses de RO tenha sido fornecida em estudos anteriores, não há detalhes sobre o procedimento completo de preparação da amostra de RO, bem como a identificação de vários tipos de estruturas sinápticas 12,13,24. Capowski et al. usaram diferentes técnicas para investigar as características das ROs induzidas por diferentes linhagens de hPSC em diferentes estágios, incluindo micrografias eletrônicas mostrando a existência de sinapses de fita carregadas de vesículas no pedículo do cone, que revelaram que as ROs no estágio 3 induzidas por várias linhagens de hPSC são maduras e funcionais¹². Usando TEM e imagens de dois fótons, Cowan et al. confirmaram a formação de estruturas sinápticas funcionais em ROs maduros¹³, mas o tipo de sinapse não foi indicado (sinapses de cone ou bastonete). No entanto, nossos vários lotes de resultados de micrografia mostraram a estrutura da membrana das sinapses da fita com uma clareza e contraste ideais, o que ilustra que nosso método é viável e reprodutível. Além disso, identificamos diferentes tipos de sinapses de acordo com suas diferentes características morfológicas: as sinapses dos cones são geralmente maiores e têm várias fitas, enquanto as sinapses dos bastonetes são geralmente menores, mostrando apenas uma fita; Nas sinapses químicas, as vesículas se acumulam nas estruturas pré-sinápticas e a densidade eletrônica da fenda sináptica é aumentada.

A integridade ultraestrutural dos contatos sinápticos em ROs é vital para sua função. O emprego de MET para investigar esses contatos oferece vantagens amplas e significativas em vários campos, como estudar a patogênese da retina in vitro, realizar triagem de drogas em ROs e avaliar técnicas de diferenciação de ROs, entre outras aplicações. Limitado pela imagem 2D TEM, apenas um aspecto específico da ultraestrutura das ROs é observável, tornando difícil analisar toda a estrutura da sinapse estereoscopicamente. Além disso, a delimitação da diferenciação contribui para células mal posicionadas^13,26, complicando ainda mais o processo de observação. Assim, combinar EM de volume com reconstrução 3D pode superar essas deficiências no futuro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 mm de placa de Petri	Corning	430167
Acetona	Microscopia Eletrônica Ciência	10000
B27 suplemento	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Grades de cobre	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Protease bacteriana
DMEM/F12 meio	Gibco	#11320033
Incorporação do molde	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Epon-812 resina	Microscopia Eletrônica Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldeído	Microscopia Eletrônica Ciência	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Citrato de chumbo	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	Substituto da L-glutamina
Matrigel	Corning	356234
	Suplemento de	80312-3161
	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	Um componente de PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	Um componente de PB/PBS
Aminoácidos não essenciais	Sigma	#M7145
Microscópio óptico	Microscópio biológico binocular de laboratório	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Forno	Bluepard	BPG9040A
Ciência da	Microscopia Eletrônica	157-8
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	#15140-122
Micrótomo semi/ultrafino	Reichert-Jung	396649
Taurina	Sigma	#T0625
Toluidina azul	Microscópios
	HITACHI	H-7500
Acetato de uranilo	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoetanol	Sigma	444203