Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.
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Artigo de método
Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organoides retinianos (ROs) são um sistema de cultura tridimensional que imita as características da retina humana que se diferenciaram das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) sob condições específicas. O desenvolvimento e a maturação da sinapse em ROs têm sido estudados imunocitoquímica e funcionalmente. No entanto, a evidência direta da ultraestrutura de contato sináptico é limitada, contendo sinapses de fita especiais e sinapses químicas convencionais. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é caracterizada por alta resolução e uma história respeitável elucidando o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos e várias espécies. É uma ferramenta poderosa para explorar a estrutura sináptica em ROs e é amplamente utilizada no campo de pesquisa de ROs. Portanto, para explorar melhor a estrutura dos contatos sinápticos de RO em nanoescala e obter evidências microscópicas de alta qualidade, desenvolvemos um método simples e repetível de preparação de amostras de RO TEM. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo a preparação da fixação do RO, pós-fixação, incorporação e visualização.
Introdução
A retina, um órgão sensorial visual vital em humanos e mamíferos, exibe uma estrutura laminada distinta caracterizada por três camadas nucleares que abrigam somas de neurônios e duas camadas plexiformes formadas por conexões sinápticas1, incluindo sinapses convencionais e a sinapse de fita especializada 2,3. A sinapse da fita desempenha um papel crucial na transmissão de impulsos de vesículas de maneira gradual 2,3. O processo de visão envolve a transmissão de sinais eletro-ópticos através de vá....
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Protocolo
1. Obtenção de ROs de iPSCs25
NOTA: Os ROs foram derivados de iPSCs modificando o procedimento relatado anteriormente.
- Dissocie iPSCs em ~ 90% de confluência usando uma protease bacteriana (consulte a Tabela de Materiais). Corte as colônias em pedaços e raspe-os com um levantador de células.
- Após a coleta, ressuspenda os aglomerados de células em 0,25 mL de Matrigel gelado. Após 20 min de incubação a 37 °C, espalhe o gel solidificado com o meio DMEM/F12 (suplemento de N2 a 0,5%, suplemento a B27 a 1%, β-mercaptoet....
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Resultados
O estabelecimento de ROs 3D por meio da diferenciação de iPSC fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos de doenças da retina e a terapia de reposição de células-tronco. Embora outros tenham demonstrado as conexões sinápticas em ROs funcional e imunocitoquimicamente, a evidência direta de sinapses convencionais e de fita é muito limitada. Aqui apresentamos um método para investigar a ultraestrutura de dois tipos de sinapses em ROs por MET. Após 180 dias de cultivo, as ROs foram fixadas, coradas, embutidas.......
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Discussão
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para observação da ultraestrutura sináptica convencional e de fita em ROs por TEM. Esse protocolo é baseado nos métodos de preparo retiniano descritos anteriormente com algumas modificações20. Para melhorar a taxa de sucesso do tratamento da amostra e a qualidade das micrografias de MET, considere os seguintes pontos-chave. Em primeiro lugar, é importante reconhecer que as ROs se desenvolvem a partir de iPSCs, form.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1105503), do Laboratório Estadual de Neurociência (SKLN-202103) e da Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Y21H120019), da Fundação de Ciências Naturais da China (82070981).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 mm de placa de Petri | Corning | 430167 | |
| Acetona | Microscopia Eletrônica Ciência | 10000 | |
| B27 suplemento | Gibco | A3582801 | |
| Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
| Grades de cobre | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | ||
| DigitalMicrograph Software | Gatan, Inc. | Software | |
| Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Protease bacteriana |
| DMEM/F12 meio | Gibco | #11320033 | |
| Incorporação do molde | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | ||
| Epon-812 resina | Microscopia Eletrônica Science | #14900 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
| Glutaraldeído | Microscopia Eletrônica Ciência | 16020 | |
| hiPSC | Shownin Biotechnology Co. Ltd. | RC01001-A | |
| Citrato de chumbo | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | ||
| L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | Substituto da L-glutamina |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Suplemento de | 80312-3161 | ||
| Gibco | 17502048 | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | Um componente de PB/PBS |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | Um componente de PB/PBS |
| Aminoácidos não essenciais | Sigma | #M7145 | |
| Microscópio óptico | Microscópio biológico binocular de laboratório | Xsz-107bnii | |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Forno | Bluepard | BPG9040A | |
| Ciência da | Microscopia Eletrônica | 157-8 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | #15140-122 | |
| Micrótomo semi/ultrafino | Reichert-Jung | 396649 | |
| Taurina | Sigma | #T0625 | |
| Toluidina azul | Microscópios | ||
| HITACHI | H-7500 | ||
| Acetato de uranilo | TED PELLA | CA96049 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | 444203 |
Referências
- Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
- Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F.
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Reimpressões e permissões
