Artigo de método

Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

4.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/66626

⸱

19 de abril de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) usado na construção de células sintéticas. Ele descreve os principais estágios com resultados representativos em diferentes microcompartimentos. O protocolo visa estabelecer as melhores práticas para diversos laboratórios na comunidade de células sintéticas, promovendo o progresso no desenvolvimento de células sintéticas.

Resumo

O sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) tem sido amplamente empregado para facilitar a montagem de baixo para cima de células sintéticas. Ele serve como hospedeiro para o maquinário central do Dogma Central, permanecendo como um chassi ideal para a integração e montagem de diversos sistemas artificiais de mimetismo celular. Apesar de seu uso frequente na fabricação de células sintéticas, estabelecer um sistema CFPS personalizado e robusto para uma aplicação específica continua sendo um desafio não trivial. Neste artigo de métodos, apresentamos um protocolo abrangente para o sistema CFPS, rotineiramente empregado na construção de células sintéticas. Este protocolo engloba os principais estágios na preparação do sistema CFPS, incluindo o extrato celular, a preparação do molde e a otimização da expressão de rotina utilizando uma proteína repórter fluorescente. Além disso, mostramos resultados representativos encapsulando o sistema CFPS em vários microcompartimentos, como gotículas de monocamada, vesículas de emulsão dupla e câmaras situadas sobre bicamadas lipídicas suportadas. Por fim, elucidamos as etapas e condições críticas necessárias para a montagem bem-sucedida desses sistemas CFPS em ambientes distintos. Esperamos que nossa abordagem facilite o estabelecimento de boas práticas de trabalho entre vários laboratórios dentro da comunidade de células sintéticas em constante expansão, acelerando assim o progresso no campo do desenvolvimento de células sintéticas.

Introdução

A síntese de células sintéticas ou artificiais emergiu como um campo altamente proeminente de pesquisa interdisciplinar, atraindo interesse substancial de cientistas nos domínios da biologia sintética, química e biofísica. Esses cientistas estão unidos pelo objetivo comum de construir uma célula viva mínima 1,2,3. O rápido crescimento deste campo tem estado em sintonia com avanços significativos em tecnologias críticas, como manipulação de DNA recombinante4, materiais biomiméticos5 e técnicas de microfabricação para compartimentalização6, incluindo o método Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)7. Os sistemas CFPS abrangem a maquinaria celular essencial para transcrição e tradução, fornecendo a estrutura fundamental para o desenvolvimento e integração de células artificiais multifuncionais.

Embora as técnicas de CFPS sejam frequentemente usadas na montagem de células sintéticas, o desenvolvimento de um sistema CFPS robusto e personalizado para a montagem de vários sistemas de células sintéticas continua sendo um desafio complexo. Atualmente, vários sistemas CFPS estão disponíveis, derivados de organismos modelo procariotos e eucariotos8, cada um especializado para aplicações específicas na síntese de células sintéticas. Além de seus papéis centrais na transcrição e tradução, os sistemas CFPS variam em seus principais componentes e procedimentos de preparação associados. Essas variações, que incluem diferenças em extratos celulares, RNA polimerases, métodos de preparação de moldes e composições de tampão, são em grande parte devidas às distintas trajetórias de desenvolvimento perseguidas por grupos de pesquisa que otimizaram intensamente seus sistemas para obter o máximo rendimento de proteínas.

Entre os vários componentes do sistema CFPS, o extrato celular é um pool enzimático crítico para transcrição e tradução e, portanto, um determinante chave do desempenho do CFPS9. A CFPS baseada em Escherichia coli (E. coli) é o sistema mais comumente utilizado devido ao seu status como o organismo procariótico mais bem compreendido. Além disso, um sistema CFPS totalmente reconstituído composto por proteínas e ribossomos purificados individualmente, conhecido como PURE10, foi desenvolvido pelo grupo de pesquisa de Ueda, que é particularmente adequado para aplicações que exigem um fundo claro. Hoje, até mesmo os sistemas CFPS baseados em E. coli se diversificaram, especialmente em termos de cepas de origem para o extrac11 e métodos de preparação12,13, RNA polimerase14,15, fontes de energia16,17 e sistemas tampão18,19. As cepas mais usadas incluem derivados de cepas K12 e B, como A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 e Rossetta223, juntamente com suas contrapartes geneticamente modificadas.

Inicialmente, cepas de E. coli com atividades reduzidas de RNase e protease foram escolhidas para aumentar a estabilidade do mRNA e a estabilidade de proteínas recombinantes recém-sintetizadas, levando ao aumento da produção final de proteínas24. Posteriormente, os extratos de E. coli foram projetados para facilitar modificações pós-traducionais específicas, incluindo glicosilação25, fosforilação26 e lipidação27, foram desenvolvidos para alcançar as modificações pós-traducionais acima. Além disso, uma série de aditivos, como chaperons moleculares28 e estabilizadores químicos, foram incorporados para auxiliar no dobramento de proteínas-alvo, contribuindo para a diversificação dos sistemas CFPS. A RNA polimerase do bacteriófago T7, conhecida por sua alta processividade, é predominantemente empregada para transcrição, embora outras polimerases como a SP629 também tenham sido utilizadas. A RNA polimerase endógena de E. coli foi adaptada para a prototipagem de circuitos genéticos alavancando fatores sigma30. Por fim, uma variedade de precursores de energia 31,32,33 e diferentes sais e componentes tampão 19,34,35 foram sistematicamente otimizados para aumentar a produtividade.

Além do próprio sistema CFPS, os métodos de encapsulamento, bem como os materiais de compartimentalização, também são vitais para a montagem bem-sucedida de células sintéticas. Vários sistemas que foram desenvolvidos para encapsular com sucesso a reação CFPS incluem gotículas de água/óleo estabilizadas com surfactante, lipídios/polímeros e suas vesículas unilamelares híbridas (com diâmetros variando de 50 nm a vários μm), bem como bicamadas lipídicas suportadas por planos. No entanto, devido ao conteúdo de moléculas complexadas do sistema CFPS, a taxa de sucesso do encapsulamento depende de casos específicos, particularmente para a formação de vesículas. Para melhorar a taxa de sucesso e a eficiência do encapsulamento da CFPS, vários chips de microfluidos foram desenvolvidos para facilitar a formação de gotículas e vesículas36. No entanto, chips e dispositivos adicionais precisarão ser estabelecidos.

Este protocolo delineia um sistema CFPS de E. coli utilizando a cepa BL21 (DE3), que é um hospedeiro comumente empregado para a produção de proteínas recombinantes. O protocolo abrange um relato detalhado da preparação do extrato celular, preparação do molde e otimização da expressão padrão usando uma proteína repórter fluorescente. Além disso, apresentamos resultados exemplares alcançados encapsulando o sistema CFPS em diversos microcompartimentos, incluindo gotículas de monocamada, vesículas de emulsão dupla e câmaras situadas sobre bicamadas lipídicas suportadas. Por fim, expomos os elementos processuais fundamentais e as condições necessárias indispensáveis para o estabelecimento bem-sucedido desses sistemas de CFPS em contextos ambientais distintos.

Protocolo

1. Preparação do extrato

  1. Risque a cepa de E. coli BL21 (DE3) de um estoque de glicerol em uma placa de ágar Luria Bertani (LB) e incube por pelo menos 15 h a 37 ° C.
  2. Preparar uma pré-cultura durante a noite inoculando uma única colónia da placa LB recentemente preparada para um balão de 50 ml de meio Luria Bertani (LB).
  3. Inocular 5 ml de pré-cultura em 500 ml de meio 2xYTPG num Erlenmeyer de 3 L defletido. Cultive-o a 37 °C com agitação vigorosa (entre 220 rpm e 250 rpm) e colha as células quando atingirem a fase intermediária (OD600 ~ 3). Em seguida, coloque as culturas de células em água gelada fria por 10 min e centrifugue a 8.000 × g por 15 min a 4 ° C.
    NOTA: Nesta etapa, a glicose no meio 2xYTPG pode ser omitida para aplicações específicas 9,12.
  4. Ressuspenda os grânulos de células resultantes em 35 mL de tampão S30 A pré-resfriado, seguido de centrifugação a 8.000 × g por 15 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante.
  5. Repita a etapa 1.4 duas vezes.
    NOTA: Os pellets de células podem ser armazenados a -80 °C se não forem usados imediatamente.
  6. Ressuspenda os pellets finais no tampão S30 B (por exemplo, use 1,1 mL de tampão S30 B por 1 g de pellet celular) e interrompa as células em uma passagem pela prensa francesa a 17.000 psi.
    1. Para usar a prensa francesa, siga o manual do usuário e transfira a suspensão da célula para a câmara de ruptura de metal da prensa francesa, garantindo que todos os componentes estejam montados e a válvula inferior da câmara de ruptura esteja fechada.
    2. Transfira a câmara de disrupção montada para a plataforma hidráulica e prenda a trava de segurança.
    3. Ligue a bomba hidráulica e inicie a interrupção.
    4. Controle a válvula de saída para permitir que a suspensão da célula flua para fora do tubo de saída para um novo tubo de 50 mL. Ajuste a velocidade do fluxo para garantir uma interrupção eficiente, idealmente uma gota de cada vez. Mantenha a pressão acima do limite inferior de 15.000 psi.
  7. Centrifugar o lisado resultante a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Repita a centrifugação uma vez e colete o sobrenadante. Adicione 0,3 volume de tampão de pré-incubação ao sobrenadante coletado e incube com agitação suave a 37 ° C por 80 min.
    NOTA: O uso de tampão de pré-incubação pode aumentar o rendimento final, embora tenha sido relatado que um escoamento vazio (sem tampão de pré-incubação) também pode melhorar a eficiência37,38, que depende da cepa de origem correspondente.
  8. Dialisar a mistura de escoamento resultante durante 2 h contra 2 L de tampão S30 C, trocar o tampão de diálise uma vez por 2 L de tampão S30 C fresco e dialisar durante a noite a 4 °C39.
    NOTA: A segunda etapa da diálise noturna pode ser encurtada para aproximadamente 3 h.
  9. Colete a amostra dialisada e centrifugue a 30.000 × g por 30 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante e a alíquota em volumes adequados e congelar imediatamente em azoto líquido.
    NOTA: A amostra congelada pode ser armazenada a -80 °C pelo menos por 6 meses a 1 ano sem perda de eficiência.

2. RNA polimerase T7

  1. Transforme o plasmídeo pAR1219 em células competentes em estrela BL21 (DE3) de E. coli 40.
  2. Inocular 10 ml de uma cultura durante a noite em 1 l de LB de meio (contendo 100 μg/ml de ampicilina). Cultive as células a 37 ° C até que OD600 atinja 0,6-0,8.
  3. Inicie a indução adicionando uma concentração final de 1 mM IPTG. Induzir as células por mais 5 h e colher por centrifugação a 8.000 × g por 15 min a 4 °C. Armazene os pellets celulares a -80 °C por várias semanas.
  4. Ressuspenda os grânulos celulares em 30 mL de tampão T7 A e interrompa as células em uma passagem pela prensa francesa a 15.000 psi. Remover os restos celulares por centrifugação a 20.000 × g durante 30 min a 4 °C.
  5. Adicionar sulfato de estreptomicina gota a gota ao sobrenadante da etapa anterior, atingindo uma concentração final de 4% (p/v). Após uma curta incubação no gelo, centrifugue a 20.000 × g por 30 min a 4 °C.
  6. Filtre o sobrenadante através de uma membrana de filtro de 0,45 μm e carregue a amostra filtrada em uma coluna de troca aniônica forte (volume de coluna de 40 mL), que foi pré-equilibrada com 10 volumes de coluna de tampão T7 B, por meio de um sistema automatizado de cromatografia líquida.
  7. Lave a coluna carregada com 50 volumes de coluna de tampão T7 B e elua a amostra com 10 volumes de coluna de misturas de tampão C T7 com baixo teor de sal (50 mM) e alto teor de sal (500 mM), estabelecendo um gradiente de concentração linear de NaCl de 50 a 500 mM a uma taxa de fluxo de ~ 3 mL / min41.
  8. Colete as frações de pico e analise por SDS-PAGE.
    NOTA: A polimerase T7 exibe uma banda predominante em ~ 100 kDa, enquanto quantidades significativas de impurezas ainda aparecem no gel SDS-PAGE.
  9. Agrupar as fracções que contêm T7 polimerase e dialisar contra 2 L de tampão C T7 durante a noite.
  10. Adicione glicerol para atingir uma concentração final de 10% e concentre a mistura resultante em uma concentração final de 3-4 mg / mL por ultrafiltração42.
    NOTA: Se aparecer precipitação durante o processo de concentração, pare imediatamente e remova os precipitados por centrifugação.
  11. Ajuste a concentração de glicerol para 50%. Alíquota e congelamento rápido da amostra com nitrogênio líquido. Conservar a -80 °C durante um período mais longo.
    NOTA: Uma pequena alíquota também pode ser armazenada a -20 °C por pelo menos 1 mês sem perda de eficiência.

3. Preparação do tampão

  1. Prepare os tampões conforme indicado na Tabela 1 um dia antes do uso.

4. Design e preparação do modelo

  1. Clone o gene de interesse em um vetor baseado em promotor T7 ou gere um produto de PCR linear contendo o gene de interesse.
    NOTA: Consulte a seção de discussão para obter os princípios de design.
  2. Preparar o plasmídeo a partir de uma cultura durante a noite utilizando um kit de extracção de plasmídeos.
    NOTA: Recomendamos selecionar um kit de plasmídeo que inclua uma etapa de precipitação de isopropanol seguida de um procedimento de lavagem com etanol a 70%.
  3. Dissolver o ADN seco num pequeno volume de água ultrapura até atingir uma concentração compreendida entre 200 μg/ml e 500 μg/ml, determinada por um espectrofotómetro de micro volume.
  4. Opcional: Expresse proteínas diretamente de produtos de PCR linear.
    NOTA: Neste caso, é necessária uma etapa de purificação por PCR.

5. Otimização de Mg2+ e K+

  1. Preparar uma mistura principal para o rastreio da concentração de Mg2+ , conforme indicado no quadro 2, ou para o rastreio da concentração de K+ , conforme indicado no quadro 3.
  2. Transfira a mistura principal para tubos de microcentrífugas individuais ou uma placa de 96 poços em forma de V.
  3. Pipetar o volume exato de soluções estoque de Mg2+ ou K+ em tubos de microcentrífugas individuais ou na placa de 96 poços em forma de V e completar as reações de CFPS com água ultrapura. Incubar as reações durante pelo menos 2 h.
    NOTA: Se estiver usando uma placa de 96 poços em forma de V, sele a placa com uma tampa de plástico para evitar a evaporação.
  4. Retire 2 μL da mistura de reação e transfira para uma placa preta de 96 poços para medições de fluorescência por um leitor de placas.
    NOTA: Usamos um leitor de placa fluorescente com a seguinte configuração: excitação/emissão: 485/528, Ganho: 50, Altura de leitura: 7.00 mm. No entanto, seria necessário ajustar seu leitor de placas para gerar uma curva de calibração específica usando proteínas fluorescentes purificadas.

6. Encapsulamento

  1. Gotícula
    1. Prepare um óleo fluorado contendo surfactante (2% PFPE-PEG em HFE7500) ou uma solução de óleo lipídico-mineral dissolvendo o lipídio em óleo mineral (consulte a etapa 6.2.1)
    2. Preparar um volume total de 100 μL de reação CFPS combinando os reagentes correspondentes 2-18 da Tabela 4. Adicione a reação CFPS a 500 μL do óleo previamente preparado em um tubo de 1,5 mL e, em seguida, esfregue o tubo vigorosamente no rack de tubos 50x para formar gotículas finas (água em óleo). Incubar o tubo a 30 °C para realizar a reação.
      NOTA: Chips microfluídicos simples também podem ser usados para gerar gotículas homogêneas43.
  2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs)
    1. Preparando a solução de óleo lipídico-mineral
      1. Adicione 57 μL de clorofórmio em um frasco de vidro de 4 mL e, em seguida, adicione 18 μL de lipídios de 1-palmitoil-2-oleoil-glicerol-3-fosfocolina (POPC) a 25 mg / mL para formar a solução lipídica de clorofórmio, atingindo uma concentração final de 8 mM (use outros lipídios com concentrações finais semelhantes).
        NOTA: Esta etapa de mistura foi para garantir uma mistura homogênea de diferentes lipídios.
      2. Evapore o clorofórmio sob um fluxo de argônio por 15 min e, em seguida, evapore ainda mais sob vácuo por 1 h.
      3. Dissolva os lipídios secos resultantes em 1.500 μL de óleo mineral, atingindo uma concentração final de 400 μM. Incube a mistura durante a noite em temperatura ambiente.
    2. Formando uma camada lipídica interfacial
      1. Adicione 500 μL da solução externa (ver Tabela 5) a um tubo de 1,5 mL e coloque lentamente 250 μL de solução de óleo lipídico-mineral sobre a solução externa. Incube em temperatura ambiente por 30 min para formar uma camada lipídica interfacial estável.
    3. Preparação da solução interna
      1. Misturar todos os reagentes do quadro 6 para formar a solução pré-interior e mantê-la congelada até à utilização. Complete a solução interna adicionando T7RNAP, extrato S30 e molde de DNA na solução pré-interna como reagentes 16-18 listados na Tabela 4.
        NOTA: Aumentar a concentração de sacarose encapsulada acima de 250 mM pode inibir a tradução livre de células44.
    4. Formação de GUVs
      1. Adicione 50 μL de solução interna a um novo tubo de 1,5 mL contendo 500 μL de óleo lipídico-mineral, pipete para cima e para baixo rapidamente e vortex vigorosamente.
      2. Deixe o tubo no gelo por 10 min e adicione lentamente 20 μL da mistura de emulsão ao topo da fase oleosa no tubo de 1,5 mL da etapa 6.2.2.
      3. Centrifugue a 800 × g (use uma velocidade de centrifugação variando de 100 × g a 1000 × g) por 10 min a 4 °C e observe a formação de GUVs no fundo do tubo.
        NOTA: Uma velocidade de centrifugação específica mais alta pode ser usada; no entanto, pode-se considerar que a velocidade de centrifugação pode influenciar o tamanho dos GUVs formados45.
      4. Remova a fase oleosa superior.
      5. Aspire 30 μL de GUVs no fundo do tubo com cuidado. Incubar os GUVs coletados a 30 °C.
        NOTA: A temperatura ideal de incubação varia para diferentes proteínas.
      6. Use a Microscopia Confocal de Varredura a Laser (LSM) para monitorar a expressão de proteínas fluorescentes.
  3. Bicamada lipídica suportada (SLB)
    1. Preparação de câmaras SLB
      1. Limpe as lamínulas de 24 x 24 mm #1,5 da piranha adicionando sete gotas de ácido sulfúrico e duas gotas de peróxido de hidrogênio a 50% no centro de cada lâmina de cobertura. Incubar os reagentes nas lamínulas por pelo menos 45 min; Enxágue abundantemente com água ultrapura.
      2. Monte a câmara de reconstituição fixando um tubo de microcentrífugas de 0,5 ml nas lamínulas limpas com cola ótica curada sob uma lâmpada ultravioleta (365 nm) durante 10 min para formar uma câmara de reação.
    2. Formação de SLB
      1. Dissolver 80 mol% de 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC), 19,95% mol de 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfo-L-serina (DOPS) e 0,05% mol de Atto488-DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina = DOPE), misturar em clorofórmio, secar sob fluxo suave de nitrogênio e aspirar por 1 h para remover completamente o solvente.
      2. Reidrate o filme lipídico seco no tampão A do SLB, resultando em uma concentração lipídica final de 4 mg / mL.
      3. Vórtice e sonicar as amostras resultantes até que fiquem claras.
      4. Diluir 4 mg/ml de SUVs com 130 μL de tampão SLB A, transferir 75 μL da suspensão para as câmaras de reação pré-formadas e incubá-lo num bloco de calor a 37 °C durante 1 min. Adicione 150 μL de tampão SLB A à câmara de reação para posterior incubação por 2 min.
      5. Lave a câmara com 2 mL de tampão SLB B (tampão SLB A sem MgCl2) antes de uma troca de tampão para o tampão S30 C com 0,4% (p / v) BSA para reações CFPS, deixando 100 μL de tampão dentro da câmara para evitar que o SLB formado seque.
      6. Remova o tampão S30 residual C e adicione a mistura de reação CFPS na câmara SLB com cuidado. Incubar a câmara a 30 °C e monitorizar a expressão num microscópio confocal de varrimento a laser.

Resultados

Para cada novo lote de extrato celular e RNA polimerase T7, recomenda-se realizar uma triagem básica das concentrações de Mg2+ e K+ para garantir o desempenho ideal do sistema CFPS. A fluorescência da superpasta GFP pode servir como um indicador do rendimento geral do sistema CFPS sob condições variadas, conforme ilustrado na Figura 1A, B. Além disso, uma comparação paralela do rendimento do sistema CFPS em diferentes compartimentos é mostrada na Figura 1C, demonstrando desempenho consistente em sistemas CFPS encapsulados, embora com uma ligeira diminuição nos GUVs, potencialmente devido à influência da sacarose46. Além disso, as reações de CFPS foram encapsuladas com sucesso em gotículas (Figura 2), GUVs (Figura 3) e sobre SLBs (Figura 4).

A Figura 2A destaca a formação de gotículas de emulsão, evidente quando a solução oleosa se tornou turbulenta. A expressão de proteínas fluorescentes verdes/vermelhas (GFP e mCherry) foi capturada usando uma microscopia confocal de varredura a laser. A Figura 3 mostrou o sucesso do encapsulamento da reação de CFPS dentro de GUVs por meio do processo simples de transferência de emulsão. O canal vermelho indicava os lipídios marcados; o canal verde mostrou a expressão da superpasta GFP; e o canal amarelo representava um corante fluorescente inerte. A Figura 4A mostra a câmara SLB onde a reação CFPS pode ser depositada. Dentro desta câmara, um SLB foi formado no topo da lamínula de vidro, com a mistura de reação CFPS colocada no topo do SLB pré-formado, permitindo a aquisição de imagens por meio de uma microscopia confocal de varredura a laser. Conforme indicado na Figura 4B, o SLB foi visualizado por lipídios marcados, mostrados em verde, enquanto a pequena GTPase Cdc42 expressa fundida com mCherry foi mostrada em magenta. A expressão in-situ de mCherry-Cdc42 foi observável, juntamente com o processo de direcionamento de membrana reversível, ao microscópio. No entanto, o sistema CFPS utilizado foi complementado com maquinário de prenilação, conforme detalhado em publicação recente47.

figure-results-1
Figura 1: Otimização e comparação do sistema CFPS. Triagem da concentração de (A) Mg2+ e (B) concentrações de K+ para o sistema CFPS a granel. (C) Um gráfico de barras mostrando os rendimentos de expressão de proteínas em diferentes compartimentos. A fluorescência da superpasta GFP foi utilizada para determinar o rendimento do sistema CFPS, medido por um leitor de placas ou um microscópio confocal de varredura a laser. Abreviaturas: CFPS = síntese proteica livre de células; GFP = proteína fluorescente verde; sfGFP = superpasta GFP; GUV = vesícula unilamelar gigante; SLB = bicamada lipídica suportada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Síntese de proteínas livres de células em gotículas. (A) Uma foto de reações de CFPS encapsuladas em gotículas de água em óleo estabilizadas com surfactante. (B) Imagens de campo claro e (C,D) fluorescência de CFPS de (C) mCherry e (D) superpasta GFP encapsuladas em gotículas visualizadas por microscopia confocal de varredura a laser. A superpasta GFP é indicada em verde; mCherry é indicado em magenta. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: CFPS = síntese proteica livre de células; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Síntese de proteínas livres de células em GUVs. (A) Uma foto de reações de CFPS encapsuladas em GUVs. (BD) Imagem de fluorescência de CFPS encapsulado dentro de POPC GUVs, expressando superpasta GFP. (B) A bicamada lipídica foi marcada com 0,05% de lipídios Atto647N-DOPE marcados, mostrados em vermelho, (C) um corante inerte mostrado em amarelo e (D) a superpasta GFP foi indicada em verde. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: CFPS = síntese proteica livre de células; GFP = proteína fluorescente verde; GUV = vesícula unilamelar gigante; POPC = 1-palmitoil-2-oleoil-glicerol-3-fosfocolina; DOPE = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Síntese de proteínas livres de células da pequena proteína GTPase-Cdc42 em cima de SLBs. (A) Ilustração esquemática da reconstituição do direcionamento da membrana de Cdc42 e extração de membrana dependente de RhoGDI em SLBs, conforme visualizado por microscopia confocal de varredura a laser. A maquinaria de prenilação foi implementada através de um extrato enriquecido com preniltransferase, que é descrito em pormenor noutro artigo. 47. (B) Uma visão ortogonal da pré e pós-prenilação da mistura de reação em cima do SLB. (C, D) Séries temporais de intensidade mCherry-Cdc42 na membrana (rosa) e em solução (preto) durante (C) direcionamento da membrana e (D) extração da membrana. Barras de escala = 10 μm. (A-D) foram adaptadas de Kai et al.47. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de buffers. NOTA: Adicione β-mercaptoetanol e DTT imediatamente antes de usar. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Esquema de pipetagem para triagem de concentração de Mg2+ . Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Esquema de pipetagem para triagem de concentração de K+ . Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Composição da solução interna. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Composição da solução externa. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 6: Composição da solução pré-interna. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Este manuscrito descreve um sistema modificado de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) projetado para uso em vários microcompartimentos em plataformas de células sintéticas, incluindo gotículas de água em óleo, GUVs e SLBs. Utilizamos a cepa hospedeira de expressão de proteína recombinante padrão de E. coli, BL21 (DE3), como extrato fonte para a construção de sistemas de células sintéticas centradas em proteínas. Essa abordagem rendeu aproximadamente 0,5 mg / mL de proteína em diferentes compartimentos. Embora outras cepas de fonte de extrato personalizadas possam ser usadas, esses sistemas foram otimizados principalmente para um tipo específico de proteína ou atividade metabólica, que pode ser abaixo do ideal para a expressão geral de proteínas. Avanços recentes na análise quantitativa de espectrometria de massa facilitaram estudos-piloto sobre a análise proteômica do lisado celular48,49, particularmente sob várias condições de preparação.

Apesar de obter insights desses estudos, estabelecer uma correlação quantitativa entre esses fatores proteicos identificados e o desempenho geral dos sistemas CFPS continua sendo um desafio. Essa lacuna deixou perguntas sem resposta sobre como avaliar quantitativamente o desempenho de um determinado lote de extrato. Além disso, não houve comparação sistemática e paralela de diferentes cepas de origem relatadas. Neste estudo, utilizamos o meio 2xYPTG para aumentar a produção de biomassa, uma estratégia recomendada para a transição para 2xYPT ao utilizar RNA polimerase endógena para transcrição. Apesar das sugestões de que a polimerase T7 poderia ser integrada ao procedimento de preparação do extrato45, optamos por um protocolo de preparação separado para o extrato S30 e a RNA polimerase T7 para reduzir as altas variações de lote para lote.

A produção da proteína-alvo está intrinsecamente ligada ao processo central de transcrição/tradução. O design adequado e a pureza do modelo são cruciais para uma expressão livre de células bem-sucedida. Além do molde de plasmídeo, o DNA linear de fita dupla gerado por PCR também pode ser empregado, oferecendo adequação para aplicações de triagem e alto rendimento. Ao contrário do design convencional do modelo para expressão in vivo em E. coli, o design do modelo no sistema livre de células de E. coli é simplificado sem a necessidade de considerações de indução de expressão. O único elemento essencial de um modelo de expressão livre de células é uma sequência regulatória T7. No entanto, em alguns casos, a sequência 5' do gene alvo pode influenciar o início da tradução, dependendo da estrutura secundária formada pelo mRNA transcrito correspondente. Se o local de ligação ao ribossomo estiver localizado dentro de uma alça de haste estável do mRNA transcrito, o início da tradução pode ser significativamente prejudicado, levando a uma expressão geral ruim. Da mesma forma, códons raros consecutivos podem dificultar a expressão e devem ser otimizados, semelhante aos estudos in vivo . Isso pode ser alcançado por meio de servidores de código aberto dedicados à otimização de códons50 e previsão de estrutura secundária de mRNA51.

Em relação ao sistema tampão, utilizamos um tampão acetato suplementado com fosfato de creatina e creatina quinase como fontes de regeneração de energia em nossa configuração experimental. Essa configuração produziu um nível de expressão moderado e uma cinética relativamente rápida, atribuível à reação de regeneração de energia de etapa única catalisada pela creatina quinase usando fosfato de creatina. Embora alguns pesquisadores tenham mudado para um sistema tampão de glutamato, citando sua maior semelhança com o ambiente celular52, não observamos diferenças significativas nos rendimentos de expressão de proteínas com nossos protocolos atuais. No entanto, análises proteômicas recentes indicaram que diferentes sistemas tampão em combinação com métodos de processamento de extrato podem influenciar o rendimento final da expressão19. Em relação aos precursores energéticos, diversos substratos têm sido investigados por vários grupos de pesquisa para alcançar custo-efetividade e maiores rendimentos de expressão53,54. No contexto do sistema CFPS apresentado, a creatina fosfato e a creatina quinase foram deliberadamente escolhidas. Essa seleção foi motivada pela eficiência da regeneração de energia alcançável por meio de uma reação de etapa única e pela ausência de interferência com enzimas endógenas herdadas do extrato. Consequentemente, esta configuração estabelece um sistema simples, mas robusto, adequado para vários ambientes de microcompartimentos.

Conforme indicado nos resultados representados, demonstramos a expressão proteica bem-sucedida em três microcompartimentos distintos: gotículas de água em óleo estabilizadas por óleo semifluorado, GUVs formados por transferência de emulsão e no topo de uma bicamada lipídica suportada. A versatilidade da expressão de proteínas em diferentes microcompartimentos destaca a robustez do nosso sistema CFPS para a construção de células sintéticas. Entre esses métodos de encapsulamento, a técnica de gotículas de emulsão foi uma abordagem notavelmente direta para encapsular o sistema CFPS, exigindo apenas agitação ou vórtice. No entanto, essas gotículas tendem a ser instáveis devido à interface precária da água, uma limitação que pode ser resolvida com a adição de lipídios ou surfactantes na fase oleosa. Apesar da praticidade das gotículas estabilizadas de água em óleo, elas não replicam totalmente o ambiente celular natural, que consiste em dois compartimentos aquosos separados por uma membrana celular. Em vez de gotículas, vesículas unilamelares gigantes (GUVs) com tamanhos superiores a 1 mícron foram estabelecidas para imitar as células mais de perto. O sistema CFPS foi encapsulado na bicamada lipídica dessas vesículas, fornecendo maquinário de transcrição e tradução para diversos sistemas de células sintéticas55.

A transferência de emulsão, também conhecida como emulsão dupla, destaca-se como a técnica típica para encapsular reações de CFPS, devido ao seu processo de preparação suave e eficiência de encapsulamento relativamente alta em comparação com métodos sem solventes. No entanto, a geração de vesículas de emulsão dupla pode variar desde etapas simples de centrifugação até o uso de transferência de emulsão assistida por microfluídica, cada método com suas vantagens e desvantagens associadas, conforme resumido em outrolugar 36. O encapsulamento bem-sucedido do sistema CFPS dentro dos GUVs depende do ajuste da osmolaridade e da aplicação da força adequada para atravessar a interface óleo-água. Embora o método de transferência de emulsão descrito aqui seja o mais simples e não exija nenhum equipamento de laboratório específico, a eficiência e a homogeneidade dos GUVs gerados podem variar entre os diferentes lotes. Além disso, todos os métodos de transferência de emulsão devem lidar com o óleo residual no lúmen da interface bicamada formada, necessitando de uma etapa adicional de remoção de óleo56, o que pode representar desafios em projetos cinéticos.

Finalmente, mostramos a expressão bem-sucedida de CFPS no topo de uma Bicamada Lipídica Suportada (SLB), oferecendo uma abordagem valiosa para projetos que requerem síntese de proteínas nas proximidades do ambiente de biomembrana lipídica. Através da utilização do sistema CFPS apresentado, demonstramos sua aplicação bem-sucedida na caracterização do processo de direcionamento reversível da membrana de Cdc4247, uma molécula de proteína central crucial para a polaridade celular. Em resumo, os rendimentos consistentes de expressão do meio e a robustez inerente observados em vários microcompartimentos destacam o potencial deste sistema CFPS na construção de diversos sistemas de células sintéticas. Essa capacidade pode ser estendida para incluir vários modelos centrados em proteínas, avançando em direção à realização de células mínimas.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

M. Y. reconhece o financiamento do Programa de Inovação em Pesquisa e Prática de Pós-Graduação da Província de Jiangsu, China (Grant No. KYCX22_2803). LK agradece o apoio da Pesquisa em Ciências Naturais das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China, China (Concessão nº 17KJB180003), da Fundação de Ciências Naturais da Universidade Normal de Jiangsu, China (Concessão nº 17XLR037), Desenvolvimento de Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu, China, e do programa de Professor Especialmente Nomeado de Jiangsu, China.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sódio)(DOPS)Avanti840035P
1,4-ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)Avanti850457P
3,5-ciclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
Tubos de 50 mLEppendorfEppendorf Tubos Eppendorf de base
50% de peróxido de hidrogênioSigma-Aldrich516813
AcetatoSigma-AldrichA6283
Ágar póSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Células AgitadasMerckMilliporeUFSC05001
Acetato de amônio (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininaSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Balão Erlenmeyer perplexoShuniu250 mL, 1000mL
Albumina de soro bovino (BSA)Tubocentrífugo Roche 10711454001
EppendorfEppendorf Eppendorf Tubes 3810X
Centrífuga rack de tubosEppendorf0030119819
Sistema de imagem de quimioluminescência e epifluorescênciaUvitecAlliance Q9
Advanced ChloroformSigma-Aldrich288306
Microscopia Confocal de Varredura a Laser (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10283
LamínulaThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
creatina quinase (CK)Roche10127566001
Creatina fosfato (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Prato de culturaHuanqiu90 mm
CisteínaSigma-AldrichC5360
Citidina 5'-sal dissódico de trifosfato (CTP)aladdinC101487
membranaEspectroTubo RC padrão MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Kit Purode Ciclo Omega Bio-TekD6492-01
Eletroaquecimento Cultivador de Temperatura PermanenteInstrumentoYiheng DHP-9602
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Biosharp
Leitor de placas fluorescentesBioTekSynergy 2
Óleo fluoradoSuzhou CChip instrumento científico2%HFE7500
Ácido folínicoSigma-Aldrich47612
Prensa francesaG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlicoseSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminaSigma-AldrichG5792
GlicerolSigma-AldrichG5516
GlicinaSigma-AldrichG7126
Guanosina 5'-trifosfato de sódio hidrato de sal (GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinaSigma-AldrichH6034
IsoleucinaSigma-AldrichI5281
Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinaSigma-AldrichL6914
LisinaSigma-AldrichL5501
Acetato de magnésio tetrahidratado (Mg(OAc)2)Sigma-AldrichM5661
Cloreto de magnésio(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MetioninaSigma-AldrichM8439
MicrocentrífugaEppendorf5424 R
Óleo mineralSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Centrífuga multiusoEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Ácido nucleico e Medições de ensaio UV de proteínaIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit para plasmídeo de grau de transfecção DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 placas de poliestireno de poçosSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
FenilalaninaSigma-AldrichP8740
Fosfoenolpiruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polietilenoglicol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Acetato de Potássio(KOAc)Sigma-AldrichP5708
Cloreto de potássio( KCl)Sigma-AldrichP9541
Glutamato de potássio (K-glutamato)Sigma-AldrichG1501
Hidróxido de potássio (KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Piruvato quinase (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
ShakerZhichushakersZQZY-AF8
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma-AldrichS5881
SacarosealaddinS112226
Ácido sulfúricoSigma-Aldrich339741
Seringa FiltrosJinteng0,45 μ m
Tubo de ensaioShuniu20 mL
TGX FastCast Kit de Acrilamida, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TriptonaSigma-AldrichT7293
TriptofanoSigma-AldrichT8941
TirosinaSigma-AldrichT8566
UTP Sal trissódico (UTP)aladdinU100365
bomba de vácuo com sistema de água circuladaZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Misturadores de VórticeKylin-BellVortex QL-861
Sistema de purificação de águaMerckMilliporeÁgua ultrapura direta (Tipo 1)
Extrato de leveduraSigma-Aldrich70161
β-mercaptoetanolSigma-Aldrich444203
biológica1100027

Referências

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187(2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663(2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882(2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8(2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045(2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580(2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686(2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637(2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, Pt B 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, Web Server issue W126-W131 (2007).
  51. RNAfold WebServer. Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna. , Available from: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi (2024).
  52. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495(2019).
  53. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  54. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  55. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  56. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113(2011).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Montagem Bottom UpEngenharia de Prote nasDispositivos Microflu dicosBicamada Lip dica SuportadaVes culas Unilamelares GigantesProte na Rep rter FluorescentePrepara o de Extrato CelularMicroscopia Confocal
Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.