Este protocolo descreve o sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) usado na construção de células sintéticas. Ele descreve os principais estágios com resultados representativos em diferentes microcompartimentos. O protocolo visa estabelecer as melhores práticas para diversos laboratórios na comunidade de células sintéticas, promovendo o progresso no desenvolvimento de células sintéticas.
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Artigo de método
Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) tem sido amplamente empregado para facilitar a montagem de baixo para cima de células sintéticas. Ele serve como hospedeiro para o maquinário central do Dogma Central, permanecendo como um chassi ideal para a integração e montagem de diversos sistemas artificiais de mimetismo celular. Apesar de seu uso frequente na fabricação de células sintéticas, estabelecer um sistema CFPS personalizado e robusto para uma aplicação específica continua sendo um desafio não trivial. Neste artigo de métodos, apresentamos um protocolo abrangente para o sistema CFPS, rotineiramente empregado na construção de células sintéticas. Este protocolo engloba os principais estágios na preparação do sistema CFPS, incluindo o extrato celular, a preparação do molde e a otimização da expressão de rotina utilizando uma proteína repórter fluorescente. Além disso, mostramos resultados representativos encapsulando o sistema CFPS em vários microcompartimentos, como gotículas de monocamada, vesículas de emulsão dupla e câmaras situadas sobre bicamadas lipídicas suportadas. Por fim, elucidamos as etapas e condições críticas necessárias para a montagem bem-sucedida desses sistemas CFPS em ambientes distintos. Esperamos que nossa abordagem facilite o estabelecimento de boas práticas de trabalho entre vários laboratórios dentro da comunidade de células sintéticas em constante expansão, acelerando assim o progresso no campo do desenvolvimento de células sintéticas.
Introdução
A síntese de células sintéticas ou artificiais emergiu como um campo altamente proeminente de pesquisa interdisciplinar, atraindo interesse substancial de cientistas nos domínios da biologia sintética, química e biofísica. Esses cientistas estão unidos pelo objetivo comum de construir uma célula viva mínima 1,2,3. O rápido crescimento deste campo tem estado em sintonia com avanços significativos em tecnologias críticas, como manipulação de DNA recombinante4, materiais biomiméticos5 e técnicas de....
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Protocolo
1. Preparação do extrato
- Risque a cepa de E. coli BL21 (DE3) de um estoque de glicerol em uma placa de ágar Luria Bertani (LB) e incube por pelo menos 15 h a 37 ° C.
- Preparar uma pré-cultura durante a noite inoculando uma única colónia da placa LB recentemente preparada para um balão de 50 ml de meio Luria Bertani (LB).
- Inocular 5 ml de pré-cultura em 500 ml de meio 2xYTPG num Erlenmeyer de 3 L defletido. Cultive-o a 37 °C com agitação vigorosa (entre 220 rpm e 250 rpm) e colha as células quando atingirem a fase intermediária (OD600 ~ 3). Em seguida, coloque as cultura....
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Resultados
Para cada novo lote de extrato celular e RNA polimerase T7, recomenda-se realizar uma triagem básica das concentrações de Mg2+ e K+ para garantir o desempenho ideal do sistema CFPS. A fluorescência da superpasta GFP pode servir como um indicador do rendimento geral do sistema CFPS sob condições variadas, conforme ilustrado na Figura 1A, B. Além disso, uma comparação paralela do rendimento do sistema CFPS em diferentes compartimentos é mostrada na
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Discussão
Este manuscrito descreve um sistema modificado de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) projetado para uso em vários microcompartimentos em plataformas de células sintéticas, incluindo gotículas de água em óleo, GUVs e SLBs. Utilizamos a cepa hospedeira de expressão de proteína recombinante padrão de E. coli, BL21 (DE3), como extrato fonte para a construção de sistemas de células sintéticas centradas em proteínas. Essa abordagem rendeu aproximadamente 0,5 mg / mL de prot.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Agradecimentos
M. Y. reconhece o financiamento do Programa de Inovação em Pesquisa e Prática de Pós-Graduação da Província de Jiangsu, China (Grant No. KYCX22_2803). LK agradece o apoio da Pesquisa em Ciências Naturais das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China, China (Concessão nº 17KJB180003), da Fundação de Ciências Naturais da Universidade Normal de Jiangsu, China (Concessão nº 17XLR037), Desenvolvimento de Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu, China, e do programa de Professor Especialmente Nomeado de Jiangsu, China.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | Avanti | 850375P | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sódio)(DOPS) | Avanti | 840035P | |
| 1,4-ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) | Avanti | 850457P | |
| 3,5-ciclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Tubos de 50 mL | Eppendorf | Eppendorf Tubos Eppendorf de base | |
| 50% de peróxido de hidrogênio | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| Acetato | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Ágar pó | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| Alanin | Sigma-Aldrich | A4349 | |
| Amicon Células Agitadas | MerckMillipore | UFSC05001 | |
| Acetato de amônio (NH4OAc) | Sigma-Aldrich | A7262 | |
| Arginina | Sigma-Aldrich | A4474 | |
| Asparagin | Sigma-Aldrich | A0884 | |
| Aspartat | Sigma-Aldrich | A5474 | |
| ATP | Roche | 11140965001 | |
| Atto 488 DOPE | Sigma-Aldrich | 67335 | |
| Atto 647N DOPE | Sigma-Aldrich | 42247 | |
| Balão Erlenmeyer perplexo | Shuniu | 250 mL, 1000mL | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Tubo | centrífugo Roche 10711454001 | |
| Eppendorf | Eppendorf Eppendorf Tubes 3810X | ||
| Centrífuga rack de tubos | Eppendorf | 0030119819 | |
| Sistema de imagem de quimioluminescência e epifluorescência | Uvitec | Alliance Q9 | |
| Advanced Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Microscopia Confocal de Varredura a Laser (LSM) | ZEISS | LSM 780 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Lamínula | Thermo Scientific | Menzel BB02400500A113MNZ0 | |
| creatina quinase (CK) | Roche | 10127566001 | |
| Creatina fosfato (CP) | Sigma-Aldrich | 10621714001 | |
| Prato de cultura | Huanqiu | 90 mm | |
| Cisteína | Sigma-Aldrich | C5360 | |
| Citidina 5'-sal dissódico de trifosfato (CTP) | aladdin | C101487 | |
| membrana | Espectro | Tubo RC padrão MWCO: 12-14 kD | |
| E.Z.N.A. Kit Puro | de Ciclo Omega Bio-Tek | D6492-01 | |
| Eletroaquecimento Cultivador de Temperatura Permanente | Instrumento | Yiheng DHP-9602 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Biosharp | ||
| Leitor de placas fluorescentes | BioTek | Synergy 2 | |
| Óleo fluorado | Suzhou CChip instrumento científico | 2%HFE7500 | |
| Ácido folínico | Sigma-Aldrich | 47612 | |
| Prensa francesa | G.Heinemann | HTU-DIGI-Press | |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glutamat | Sigma-Aldrich | G5667 | |
| Glutamina | Sigma-Aldrich | G5792 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Guanosina 5'-trifosfato de sódio hidrato de sal (GTP) | Roche | 10106399001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HiPrep Q FF 16/10 | Cytiva | 28936543 | |
| Histidina | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| Isoleucina | Sigma-Aldrich | I5281 | |
| Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Leucina | Sigma-Aldrich | L6914 | |
| Lisina | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Acetato de magnésio tetrahidratado (Mg(OAc)2) | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| Cloreto de magnésio(MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Metionina | Sigma-Aldrich | M8439 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5424 R | |
| Óleo mineral | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems | Bio-Rad | 1645050 | |
| Centrífuga multiuso | Eppendorf | 5810 R | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Ácido nucleico e Medições de ensaio UV de proteína | IMPLEN | NanoPhotometer N60 | |
| NucleoBond Xtra Maxi kit para plasmídeo de grau de transfecção DNA | MACHEREY-NAGEL | 740414.5 | |
| Nunc-Immuno MicroWell 96 placas de poliestireno de poços | Sigma-Aldrich | P8616 | |
| PCR Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler nexus | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Fenilalanina | Sigma-Aldrich | P8740 | |
| Fosfoenolpiruvat (PEP) | GLPBIO | GC44635 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | PMSF-RO | |
| Polietilenoglicol 8000 (PEG 8000) | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Acetato de Potássio(KOAc) | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| Cloreto de potássio( KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Glutamato de potássio (K-glutamato) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| Hidróxido de potássio (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Prolin | Sigma-Aldrich | P8865 | |
| Piruvato quinase (PK) | Sigma-Aldrich | P9136 | |
| Serin | Sigma-Aldrich | S4311 | |
| Shaker | Zhichushakers | ZQZY-AF8 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sacarose | aladdin | S112226 | |
| Ácido sulfúrico | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Seringa Filtros | Jinteng | 0,45 μ m | |
| Tubo de ensaio | Shuniu | 20 mL | |
| TGX FastCast Kit de Acrilamida, 12% | Bio-Rad | #1610175 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | ThermoMixer C | |
| Threonin | Sigma-Aldrich | T8441 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Triptona | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Triptofano | Sigma-Aldrich | T8941 | |
| Tirosina | Sigma-Aldrich | T8566 | |
| UTP Sal trissódico (UTP) | aladdin | U100365 | |
| bomba de vácuo com sistema de água circulada | Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd | SHB- | |
| Valin | Sigma-Aldrich | V4638 | |
| Misturadores de Vórtice | Kylin-Bell | Vortex QL-861 | |
| Sistema de purificação de água | MerckMillipore | Água ultrapura direta (Tipo 1) | |
| Extrato de levedura | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | 444203 |
Referências
- Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
- Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like art....
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Reimpressões e permissões
