Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

Resumo

Descrevemos aqui métodos para induzir e analisar a remodelação olfativa dependente da experiência dos glomérulos sinápticos do lobo antenal no cérebro juvenil de Drosophila .

Resumo

A experiência sensorial olfativa no início da vida induz uma remodelação dramática dos glomérulos sinápticos no cérebro juvenil de Drosophila , que é experimentalmente dependente da dose, temporalmente restrita e transitoriamente reversível apenas em um período crítico curto e bem definido. A direcionalidade da remodelação da conectividade sináptica do circuito cerebral é determinada pelo odorante específico que atua na classe de receptores respondentes dos neurônios sensoriais olfativos. Em geral, cada classe de neurônios expressa apenas um único receptor odorífero e inerva um único glomérulo sináptico olfatório. No modelo genético de Drosophila , toda a gama de glomérulos olfativos foi mapeada com precisão pela capacidade de resposta ao odor e produção comportamental. O odorante de butirato de etila (EB) ativa os neurônios receptores de Or42a que inervam o glomérulo VM7. Durante o período crítico do início da vida, a experiência da EB impulsiona a eliminação da sinapse dependente da dose nos neurônios sensoriais olfativos Or42a. Períodos cronometrados de exposição ao odor EB dosado permitem a investigação da poda de conectividade do circuito dependente da experiência no cérebro juvenil. A imagem de microscopia confocal dos glomérulos sinápticos do lobo antenal é feita com marcadores transgênicos acionados pelo receptor Or42a que fornecem quantificação do número de sinapses e do volume de inervação. O sofisticado kit de ferramentas genéticas de Drosophila permite a dissecação sistemática dos mecanismos celulares e moleculares que medeiam a remodelação do circuito cerebral.

Introdução

A remodelação dos circuitos cerebrais juvenis durante o início da vida representa a última chance de mudanças de conectividade sináptica em larga escala para corresponder ao ambiente altamente variável e imprevisível em que um animal nasce. Como o grupo mais abundante de animais, os insetos compartilham esse mecanismo de remodelação do período crítico fundamental e evolutivamente conservado¹. Os períodos críticos abrem com o início da entrada sensorial, exibem mudanças reversíveis no circuito para otimizar a conectividade e, em seguida, fecham quando as forças de estabilização resistem a uma remodelação adicional². Os insetos são particularmente dependentes de informações sensoriais olfativas e mostram um período crítico olfativo bem definido. Drosophila fornece um excelente modelo genético para investigar esse período crítico dependente da experiência no cérebro juvenil. A experiência com odor durante os primeiros dias após a eclosão impulsiona mudanças marcantes na conectividade do circuito em glomérulos sinápticos identificados individualmente ^3,4. A direção da remodelação depende da experiência específica do odorante de entrada. Alguns odores causam um aumento no volume do glomérulo sináptico por alguns dias após a eclosão (dpe) ^{3 , 5 , 6 , 7} , enquanto outros odores causam uma rápida eliminação das sinapses durante o período crítico de 0-2 dpe, resultando em diminuição do volume de inervação^{8 , 9 , 10}. Especificamente, a experiência com odor de butirato de etila (EB) impulsiona a poda sináptica dependente da dose dos neurônios do receptor olfativo Or42a apenas durante esse período crítico de início de vida⁸. A eliminação da sinapse é completamente reversível pela modulação da entrada de odor EB dentro do período crítico, mas torna-se permanente após o encerramento do período crítico. Essa poda sináptica dependente da experiência olfativa fornece um sistema experimental valioso para elucidar os mecanismos temporalmente restritos subjacentes à remodelação do circuito cerebral juvenil.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usado para induzir e analisar a poda sináptica dependente da experiência EB de neurônios sensoriais olfativos do receptor Or42a durante o período crítico do início da vida. Mostramos que os terminais sinápticos Or42a no glomérulo VM7 do lobo antenal podem ser especificamente marcados por transgenicamente conduzindo um marcador mCD8::GFP amarrado à membrana, diretamente fundido ao promotor Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ ou usando o sistema de expressão binária Gal4/UAS (Or42a-Gal4 conduzindo UAS-mCD8::GFP)¹². As sinapses individuais do neurônio Or42a podem ser marcadas de forma semelhante usando a expressão transgênica direcionada de marcadores de zona ativa pré-sináptica fundidos a uma série de tags fluorescentes (por exemplo, Bruchpilot :: RFP) ⁸ ou um sinal denso em elétrons para análises de sinapses ultraestruturais (por exemplo, miniSOG-mCherry) ⁸. Os terminais sinápticos Or42a podem ser visualizados com uma combinação de microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que a poda dos glomérulos sinápticos de Or42a é dependente da dose de EB, escalando para a concentração da experiência de odor cronometrada. A porcentagem de odor EB dissolvido no óleo mineral usado como veículo pode ser variada, assim como a duração cronometrada da exposição ao odor em animais em estágio de desenvolvimento. Finalmente, mostramos os métodos usados para analisar a extensão da poda dos glomérulos sinápticos medindo a intensidade e o volume da fluorescência da inervação VM7. O número de sinapses também pode ser quantificado contando os pontos sinápticos marcados e medindo os parâmetros da ultraestrutura sináptica usando microscopia eletrônica de transmissão⁸. No geral, o protocolo mostrado aqui é uma abordagem poderosa que permite a dissecação sistemática dos mecanismos celulares e moleculares que medeiam a poda da conectividade sináptica do circuito olfativo da Drosophila durante um período crítico juvenil. A configuração geral de exposição ao odor descrita neste estudo foi utilizada em estudos anteriores usando outros odores e testando outros glomérulos ^3,7.

Protocolo

1. Exposição ao odor

1. Usando um pincel fino, classifique 40-50 animais em estágio de desenvolvimento como pupas escuras faratos (90+ h pós-pupariação a 25 ° C) em frascos de Drosophila de poliestireno de 25 mm x 95 mm contendo alimento padrão de melaço de fubá (Figura 1A).
2. Coloque uma tela de arame de aço inoxidável fina sobre a extremidade dos frascos de Drosophila para conter as moscas e, ao mesmo tempo, permitir um bom fluxo de ar. Prenda as tampas de malha de arame com filme transparente colado na lateral dos frascos para Drosophila .
3. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, coloque 1 mL de óleo mineral 100% (controle do veículo) ou dissolva o odorante de butirato de etila (EB) em óleo mineral em outro tubo para produzir a concentração desejada (por exemplo, 15% (150 μL) ou 25% (250 μL)).
4. Coloque os tubos de controle do veículo ou microcentrífuga odorífera na vertical dentro de um recipiente Glasslock hermético de 3700 mL. Usando fita adesiva, ancore os tubos com segurança no centro das câmaras odoríferas junto com os frascos de Drosophila (Figura 1B).
5. Coloque as câmaras seladas de controle do veículo e odor EB contendo os frascos de pupas de farato de Drosophila encenados em uma incubadora umidificada (70%) com temperatura controlada (25 ° C) em um ciclo claro/escuro de 12 h / 12 h.
6. Remova as moscas recém-fechadas após 4 h de exposição à câmara de odor e transfira rapidamente 20-25 moscas para frascos de Drosophila frescos em câmaras com odor recém-feito ( Figura 1A , B ). Descarte as pupas não fechadas.
7. Mantenha as moscas em suas câmaras de odor seladas nas incubadoras por um total de 24 h. Para uma dosagem mais longa de odor, transfira rapidamente as moscas para novos frascos de Drosophila em câmaras de odor recém-feitas a cada 24 h.
8. Anestesie as moscas em estágio de desenvolvimento, submergindo-as em um prato de etanol a 70% por 1 minuto em preparação para dissecção cerebral imediata e processamento imunocitoquímico.

2. Dissecção cerebral

1. Marque os frascos como controle do veículo (somente óleo mineral 100%) ou exposto ao EB (% EB) rotulando e mantenha essas designações durante toda a duração da dissecção cerebral e processamento subsequente. Processe 10-20 animais para cada genótipo/condição odorante.
2. Usando uma pinça, transfira uma única mosca anestesiada para um pequeno prato de solução salina tamponada com fosfato (PBS) recém-feita13. Mergulhe a mosca em PBS e continue a dissecção cerebral completa com a mosca totalmente submersa.
3. Com uma pinça fina (# 5) afiada em ambas as mãos, coloque a mosca com o lado ventral para cima e segure a parte superior do tórax com uma pinça e a cabeça sob a tromba com a outra pinça. Tome cuidado para não penetrar no cérebro.
4. Remova a cabeça do resto do corpo puxando suavemente em direções opostas com as duas mãos. A cabeça deve se desprender facilmente do tórax; deixar a cabeça isolada para dissecção (Figura 1C).
5. Deslize a pinça usada anteriormente para segurar o tórax sob o lado oposto da tromba. Comece a puxar suavemente a cutícula do exoesqueleto em direções opostas para que ela rasgue entre os olhos para revelar o cérebro.
6. Ao puxar, os lobos ópticos do cérebro podem se separar junto com o exoesqueleto. Para evitar isso, use um puxão lento e constante com as duas pinças enquanto remove a cutícula do exoesqueleto (Figura 1C, meio).
7. Continue a remover a cutícula do exoesqueleto da cabeça. Certifique-se de que todas as partes do exoesqueleto sejam removidas. Remova todos os tecidos ligados ao cérebro, incluindo o corpo adiposo e qualquer traqueia saliente.
8. Para evitar que grude, enxágue uma ponta de pipeta P20 com PBS + 0.2% Triton-X 100 (PBST). Imediatamente após a dissecção, transfira o cérebro para a solução de fixação (4% de paraformaldeído (PFA) + 4% de sacarose) em um tubo tampado (Figura 1C,D).

3. Imunocitoquímica cerebral

1. Fixe o cérebro por 30 min em temperatura ambiente (RT) com rotação de ponta a ponta. Enquanto mantém os cérebros no tubo, pipete e descarte adequadamente o fixador perigoso. Lave rapidamente os cérebros fixos 3x com PBS (Figura 1D).
2. Os cérebros podem ser encontrados presos na tampa dos tubos após a rotação. Para evitar a perda acidental de cérebros, que é um perigo constante em todas as transferências, use um microscópio de dissecção ao pipetar líquidos.
3. Em preparação para a marcação de anticorpos, bloqueie os cérebros fixos por 1 h em RT em PBST + 1% de albumina de soro bovino (BSA) + 0,5% de soro de cabra normal (NGS) com rotação constante de ponta a ponta (Figura 1D).
4. Remova o bloqueio e incube os cérebros com o anticorpo primário selecionado diluído adequadamente em PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Incubar os cérebros durante a noite (14-16 h) a 4 °C com rotação constante.
   NOTA: Exemplos de anticorpos usados: anti-CadN de rato (diluição 1:50)¹⁴ para rotular glomérulos sinápticos e anti-GFP de galinha (1:1000)⁸ para rotular Or42a-mCD8::GFP (Figura 1D).
5. Pipetar o anticorpo primário. Lave os cérebros 3x por 20 minutos cada com PBST. Incubar cérebros com anticorpos secundários diluídos em PBST com 0,2% de BSA + 0,1% de NGS por 2 h em RT com rotação constante.
   NOTA: Alternativamente, incube os cérebros durante a noite (14-16 h) a 4 ° C. Diluir anticorpos em PBST com 0,2% de BSA + 0,1% de NGS; Anticorpos secundários usados aqui: 488 cabra anti-frango (1:250) e 546 cabra anti-rato (1:250).
6. Pipetar os anticorpos secundários. Lave os cérebros 3x por 20 minutos cada com PBST. Termine lavando os cérebros por 20 min com PBS (Figura 1D).
7. Prepare lâminas de microscópio de vidro (75 mm x 25 mm) adicionando duas tiras finas de fita adesiva dupla face à lâmina com ~ 25 mm de distância uma da outra. Isso fornece um espaçador para evitar esmagar os cérebros.
8. Pipeta ~ 10-15 μL de meio de montagem entre as duas tiras de fita para montar os cérebros. Com uma ponta de pipeta P20 pré-enxaguada com PBST, transfira os cérebros marcados para a lâmina do microscópio (Figura 1E).
9. Depois que os cérebros forem transferidos, use um pincel fino para alinhá-los, garantindo que os lobos antenais estejam voltados para cima. Procure o lado que tem a corcunda arqueada, que conterá os lobos antenais.
10. Assim que os cérebros estiverem devidamente orientados, cubra-os com uma lamínula de vidro (nº 1.5H), garantindo que a lamínula esteja presa na fita. Em seguida, preencha as laterais da lamínula com meio de montagem adicional (Figura 1E).
11. Sele as bordas da lamínula com esmalte transparente. Deixe a lâmina secar completamente e guarde-a na geladeira para imagens subsequentes.

4. Imagem confocal

1. Cegue todas as lâminas cerebrais para as condições de genótipo e experiência antes da imagem, marcando a lâmina com um rótulo codificado para decodificação posterior.
2. Use um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de imersão em óleo de 63x. Usamos um microscópio Zeiss 510 META em todas as imagens mostradas aqui (Figura 1F).
3. Use linhas de laser apropriadas para os fluoróforos empregados. Aqui, use um laser de argônio 488 e HeNe 543 para os glomérulos sinápticos do lobo antenal e imagens de neurônios sensoriais olfativos Or42a (Figura 2).
4. Determine o ganho e o deslocamento ideais para ambos os canais, idealmente mantendo o ganho para ambos os canais <750 e deslocamento ≈0. Isso é feito para garantir que a relação sinal-ruído seja ideal, limitando o plano de fundo.
5. Posicione a imagem no centro do cérebro. Ao obter imagens, os glomérulos VM7 residem proximalmente ao orifício deixado no meio do cérebro após a remoção do esôfago durante a dissecção (Figura 2A).
   NOTA: Os glomérulos VM7 estarão sempre próximos à abertura do esôfago. No entanto, a localização e o tamanho exatos variam ligeiramente com base na dissecção cerebral e nas diferenças de montagem, portanto, leve isso em consideração ao obter imagens.
6. Selecione a resolução da imagem e a espessura da fatia óptica. Aqui, a resolução de 1024 x 1024 com uma espessura de fatia de pilha Z de 0,37 μm é usada.
7. Faça uma projeção confocal inteira da pilha Z através do lobo antenal, garantindo a captura da inervação completa do neurônio Or42a dos glomérulos VM7.

5. Medições sinápticas

1. Carregue a imagem cega por genótipo/condição em Fiji (1.54f). Divida os canais da linha de laser clicando em Imagem > Cor > Dividir canais.
2. No canal sensorial olfativo Or42a, determine quais fatias contêm a inervação Or42a percorrendo toda a pilha Z, identificando onde a fluorescência começa e termina.
3. Crie uma projeção de fatias de soma incluindo apenas fatias contendo inervação de neurônios Or42a clicando em Pilhas de > de imagem > Projeto Z > Fatias de soma e inserindo o intervalo desejado.
4. Em Fiji, clique na ferramenta Lasso na barra superior para traçar o contorno da inervação do neurônio Or42a no glomérulo VM7, tratando cada glomérulo do lado do cérebro independentemente (Figura 3).
5. Multiplique a circunferência pelo número de fatias da pilha Z e a espessura de cada fatia para obter o volume de inervação do glomérulo sináptico VM7. Para quantificar o número de sinapses, a ferramenta find maxima pode ser usada junto com a macro find maxima stacks para contar os pontos de sinapse na região delineada ^8,15.

Resultados

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a exposição ao odor do período crítico dependente da experiência olfativa e os métodos de imagem cerebral. O protocolo começa com a correspondência etária das pupas escuras do farato imediatamente antes da eclosão (Figura 1A). As pupas são colocadas em câmaras odoríferas por 4 h e, em seguida, os adultos recém-fechados são colocados em frascos novos no controle do veículo ou nas câmaras odoríferas EB dosadas (Figura 1B). Normalmente expomos ao odor por 24 horas, embora qualquer duração seja possível. Após a exposição ao odor, a dissecção cerebral começa removendo a cabeça do tórax e, em seguida, removendo o exoesqueleto da cutícula com pinça fina (Figura 1C). O cérebro isolado é limpo de quaisquer tecidos associados que possam interferir na imagem e, em seguida, imediatamente fixado em paraformaldeído a 4% e sacarose a 4% em PBS. Uma correção curta de 30 minutos é suficiente para uma boa integridade do tecido cerebral. O protocolo imunocitoquímico começa com um bloqueio de 1 h (por exemplo, BSA, NGS), incubação noturna em anticorpos primários (por exemplo, anti-GFP, -CadN) e, em seguida, uma breve incubação de 2 h em anticorpos secundários (Figura 1D). Os cérebros marcados são montados em lâminas de vidro sob lamínulas seladas com a superfície dorsal do cérebro para cima para obter a melhor imagem dos lobos antenais (Figura 1E). Observe que todas as amostras são cegas para as condições de genótipo e experiência, marcando a lâmina com uma designação codificada para decodificação posterior. Um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de imersão em óleo de 63x é usado para obter imagens dos lobos antenais centrais do cérebro (Figura 1F). Linhas de laser ideais para os fluoróforos usados são selecionadas (por exemplo, Argônio 488 e HeNe 543) para obter imagens da inervação do neurônio sensorial olfativo Or42a de VM7 no contexto dos glomérulos circundantes.

É importante selecionar o ganho ideal, o deslocamento, a resolução da imagem e a espessura da fatia óptica para capturar toda a projeção da pilha Z da inervação do neurônio Or42a nos glomérulos VM7. Todos os genótipos e condições de experiência a serem comparados são fotografados com configurações de microscópio idênticas. As pilhas Z são processadas usando o software ImageJ com alterações dependentes da experiência avaliadas principalmente pelo volume de inervação ^7,14. Existem duas maneiras pelas quais as medições volumétricas foram calculadas. Calcula-se a área de inervação fatia por fatia usando a função de laço ImageJ e, em seguida, multiplica-se cada valor pela espessura de cada fatia (μm)^8,9. O outro usa projeções Z de soma de fatias e multiplica o número de fatias de pilha Z pela espessura da fatia para determinar o volume médio. Ambos os métodos fornecem resultados consistentes. Além das medições de volume, a intensidade de fluorescência também pode ser avaliada com projeção de intensidade máxima de glomérulos VM7¹⁶. A soma ponderada de todos os pixels é avaliada por meio da projeção máxima da fatia de soma do ImageJ, com o número de pixels em cada nível de intensidade somado para calcular a intensidade geral ^8,9. O fundo pode ser subtraído quantificando uma região extra-glomerular de tamanho idêntico. Este método de subtração é mais demorado, mas mais preciso, pois é responsável por níveis variados de marcação de anticorpos de fundo em cada amostra de cérebro para produzir uma quantificação mais representativa dos valores de intensidade de fluorescência de inervação. As medições de intensidade são feitas em uma faixa típica de 18 a 30 fatias ópticas (0,37 μm / fatia) dentro de uma pilha Z, em média para cada cérebro¹⁶. Em quase todos os casos, as medições de intensidade e volume da fluorescência de inervação fornecem resultados consistentes.

Em todas as modalidades de medição, os resultados representativos permanecem inabaláveis; a experiência com odorante EB no início da vida resulta em uma perda significativa da inervação do neurônio Or42a. O glomérulo VM7 pode ser identificado de forma confiável por tamanho, forma e localização entre outros glomérulos olfatórios do lobo antenal mapeados com precisão ( Figura 2A ) e pela expressão direcionada do rótulo de membrana Or42a-mCD8 :: GFP acoplado à marcação glomerular com caderina antineural (CadN; Figura 2B). A exposição cronometrada ao controle do veículo odorífero (óleo mineral) resulta na inervação do neurônio Or42a indistinguível de um animal normal não tratado. Ainda assim, a experiência com odor EB nos primeiros dias após a eclosão (dpe) causa poda de glomérulos sinápticos (Figura 2C). Esse mecanismo de poda é totalmente restrito ao breve período crítico de início de vida ^8,10. Normalmente, agora usamos exposições a odores de 24 horas para avaliar a poda sináptica dos glomérulos VM7 e a diminuição resultante no volume de inervação no cérebro juvenil de Drosophila. Uma exposição de 24 h (0-1 dpe) ao controle do veículo odorífero (óleo mineral) mantém a inervação normal e densa de Or42a-mCD8::GFP (verde) nos glomérulos sinápticos VM7 (círculos tracejados brancos) em ambos os lobos antenais do hemisfério cerebral (Figura 2D, à esquerda). Em contraste marcante, a exposição de 24 h (0-1 dpe) a 25% de odor EB dissolvido no óleo mineral resulta em forte poda da inervação de Or42a-mCD8::GFP (verde) e perda do volume glomerular sináptico (Figura 2D, à direita). Esses resultados são visualmente óbvios e consistentemente claros. Um dos maiores atributos deste protocolo de experiência com odor é a clareza dos resultados da imagem cerebral, que também são extremamente passíveis de quantificações diretas de intensidade e volume de fluorescência de inervação.

A principal vantagem deste protocolo de experiência com odor é a capacidade de aproveitá-lo para o estudo da restrição temporal e dos mecanismos dependentes da dose de odor durante a poda sináptica do período crítico. Para a eliminação da sinapse do neurônio Or42a impulsionada por EB no glomérulo VM7, o mecanismo de remodelação é restrito principalmente ao juvenil precoce (0-2 dpe), sem poda sináptica dependente da experiência detectável na maturidade (7-9 dpe), exceto modulação menor nos níveis mais altos de exposição ao EB⁸. Tal restrição temporal define um período crítico, e a compreensão desse mecanismo de tempo é um objetivo importante. Outro atributo deste protocolo é que a poda sináptica dependente da experiência é dependente da dose de EB (Figura 3). A exposição cronometrada ao controle do veículo odorífero (óleo mineral) com odor EB a 0% resulta na inervação normal do neurônio Or42a do glomérulo sináptico VM7, que é indistinguível de um animal não tratado. O cálculo do volume tridimensional de inervação do neurônio Or42a mostra um tamanho típico de um cérebro juvenil normal (2260 μm³; Figura 3A, à esquerda). Resultados representativos mostram que o aumento da concentração de odorante EB causa poda de glomérulos sinápticos progressivamente maior. Por exemplo, uma exposição de 24 horas (0-1 dpe) a 15% de odorante EB resulta em perda de inervação clara e consistente (Figura 3A, meio). A quantificação do volume de inervação 3D mostra uma redução notável em comparação com os controles do veículo (760 μm³ vs. 2260 μm³). Uma exposição de 24 h (0-1 dpe) a 25% de odor EB causa ainda mais perda de inervação (281 μm³; Figura 3A, à direita). Quantificações representativas para esta faixa de concentrações de odorante EB mostram resultados consistentes para intensidade de fluorescência ( Figura 3B ) e volume de inervação ( Figura 3C ). Essa dependência da dose permite o estudo dos meios para prevenir a poda sináptica, bem como melhorar a poda com menor exposição a odores para demonstrar o aumento da remodelação dos glomérulos sinápticos. Alguns estudos anteriores mostraram o efeito oposto do aumento do volume glomerular usando outros odores com esse protocolo¹⁰. A exposição ao odor EB no período crítico sempre resulta em poda de glomérulos sinápticos marcante e facilmente detectável.

Figura 1: Fluxograma de estudos de exposição a odores no cérebro juvenil de Drosophila . (A) Pupas escuras de farato (90+ h pós-pupariação a 25 ° C) são coletadas e colocadas em câmaras odoríferas. Em condições de odor, 4 h são permitidas para eclosão e, em seguida, as moscas juvenis são transferidas para um frasco fresco. (B) As moscas da mesma idade são divididas em condições de experiência de controle do veículo (100% óleo mineral) ou butirato de etila (EB; % v/v em óleo mineral). Uma malha de arame fino (inserção) permite o acesso ao odor. As moscas são normalmente expostas por mais 20 h para um total de 24 h de exposição, 0-1 dia pós-eclosão (dpe). (C) As moscas são dissecadas removendo primeiro a cabeça e, em seguida, pinças finas são usadas para remover delicadamente o exoesqueleto da cutícula e isolar o cérebro juvenil. O cérebro isolado é limpo de todos os tecidos circundantes e traqueia saliente. (D) Cérebros isolados são fixados, bloqueados e, em seguida, incubados sequencialmente em anticorpos primários e secundários. A gama de anticorpos usados normalmente inclui uma sonda de membrana geral para revelar os glomérulos sinápticos do lobo antenal e uma sonda de membrana específica para os neurônios sensoriais olfativos Or42a. (E) Os cérebros marcados são colocados em um meio de montagem em uma lâmina de microscópio de vidro com espaçadores de fita sob uma lamínula selada. A orientação correta do cérebro (superfície dorsal para cima) é fundamental para a imagem ideal dos lobos antenais. (F) Os cérebros são fotografados usando um microscópio fluorescente confocal de varredura a laser. Todas as amostras são cegas para as condições de genótipo e experiência antes da imagem e análises quantificadas subsequentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Poda de glomérulos sinápticos do período crítico dependente da experiência do odorante. (A) Os glomérulos olfatórios do lobo antenal (AL) são mapeados com precisão. Alguns glomérulos sinápticos representativos são mostrados. A classe de neurônios sensoriais olfativos (OSN) do receptor Or42a inerva especificamente os glomérulos VM7. (B) Neurônios marcados com Or42a-mCD8::GFP (verde) inervam densamente os glomérulos VM7 emparelhados nos lados esquerdo (L) e direito (R) do cérebro, com marcação de anticorpos N-Caderina (CadN) de todos os glomérulos sinápticos AL (magenta). A linha de voo é w¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Representação gráfica esquemática da inervação de Or42a OSN dos glomérulos sinápticos VM7 na condição de controle do veículo (100% óleo mineral; esquerda) e exposição ao butirato de etila (% EB v / v em óleo mineral; direita) durante o período crítico juvenil. A poda de inervação dependente da experiência ocorre apenas com a exposição à EB no início da vida, com sinapses eliminadas e axônios perdidos, resultando em redução do volume de inervação. (D) Imagens confocais representativas da inervação de Or42a OSN dos glomérulos sinápticos VM7 emparelhados (círculos de contorno branco tracejado; Or42a-mCD8::GFP, verde) após o controle do veículo a óleo (esquerda) e 25% de exposição EB (direita) por 24 h (0-1 dpe). A experiência com odor EB impulsiona a poda sináptica e a perda de volume de inervação. Esse mecanismo dependente da experiência é temporalmente restrito e transitoriamente reversível apenas dentro de um período crítico olfativo bem definido nos primeiros dias após a eclosão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificando a intensidade e o volume de fluorescência da inervação dos glomérulos sinápticos dependentes da dose de EB. (A) Inervação marcada com Or42a-mCD8::GFP em um glomérulo sináptico VM7 (verde) exposto de 0-1 dpe ao controle de óleo mineral do veículo odorífero (0% EB, esquerda), 15% EB (meio) ou 25% EB (direita). Abaixo: As mesmas imagens com a inervação glomerular delineada (círculos brancos) e o volume de inervação tridimensional calculado. O controle do veículo tem inervação do glomérulo sináptico VM7 por neurônios Or42a que é indistinguível dos animais não tratados. A experiência do período crítico com 15% de exposição ao odor EB resulta em poda óbvia do glomérulo sináptico, com uma diminuição de 66% no volume de inervação tridimensional neste caso. A exposição ao nível mais alto de 25% de EB resulta em maior poda, com uma perda de quase 90% do volume do glomérulo sináptico neste caso. Assim, pode-se imaginar a poda dependente da dose à medida que a experiência com odor aumenta. (B) Resultados representativos da intensidade de fluorescência marcada com Or42a-mCD8::GFP dentro dos glomérulos sinápticos VM7 expostos de 0-1 dpe ao controle do veículo odorífero (óleo, verde), 15% EB (meio, laranja) ou 25% EB (direita, preto). (C) Resultados representativos dos volumes de inervação tridimensionais dos glomérulos VM7 sob as mesmas condições de exposição ao odor do período crítico. Os gráficos de dispersão mostram todos os pontos de dados individuais com a média ± SEM. A significância é indicada como p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) e p ≤ 0,0001 (****). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo de exposição a odores e imagens cerebrais apresentado aqui pode ser usado para induzir e quantificar de forma confiável a poda de glomérulos sinápticos de neurônios sensoriais olfativos dependentes da experiência durante um período crítico no início da vida. Estudos anteriores utilizando esse paradigma de tratamento para explorar a remodelação do circuito olfatório iniciaram a exposição ao odorante no^2º dia após a eclosão ^3,4,5. Em contraste, começamos a exposição ao odor em pupas de farato antes da eclosão adulta e descobrimos que a grande maioria da remodelação ocorre nas primeiras 24 horas após a eclosão ^8,9. Assim, uma etapa essencial neste protocolo de exposição ao odor é colocar pupas escuras estadiadas em câmaras de odor antes da eclosão (Figura 1). Isso não é para exposição ao odor de pupa em si, mas sim para garantir a exposição ao odor imediatamente após a eclosão do adulto. Selecionamos adultos juvenis fechados 4 h após o estadiamento para sincronizar as idades dentro de uma janela temporal apertada e evitar diferenças nos tempos de exposição ao odor. Esse intervalo de experiência anterior está de acordo com estudos recentes que demonstram que a habituação ao olfato da EB fecha após apenas 2 dias após a eclosão¹⁰. No entanto, as consequências das diferenças de tempo de exposição ao odor dentro do período crítico (por exemplo, 0-1 vs. 1-2 dias) não foram bem caracterizadas. Os neurônios sensoriais olfativos Or42a inervam seletivamente o glomérulo VM7 no lobo antenal, que é facilmente identificado com base nos mapas glomerulares precisos e na marcação de inervação direcionada (por exemplo, Or42a-mCD8::GFP; Figura 2). A exposição ao odor EB durante o período crítico não altera a expressão do promotor Or42a ou os níveis do repórter⁸. A exposição cronometrada ao odorante causa eliminação sequencial de sinapses e perda de inervação do axônio dos neurônios do receptor Or42a. Esta poda é completamente reversível no período crítico do início da vida (0-2 dpe), mas não na maturidade adulta (7-9 dpe), quando as mudanças no ambiente odorífero não alteram mais a inervação. A restrição temporal rígida desse mecanismo sensorial dependente da experiência é uma grande questão pendente no campo. Muitas tentativas estão sendo feitas para reabrir a plasticidade crítica do período na maturidade. O protocolo dado aqui é um poderoso caminho para a investigação.

A facilidade da exposição ao odor e do protocolo de imagem cerebral descritos aqui permite ampla acessibilidade e ampla adaptabilidade. O início, a interrupção e a duração da experiência de exposição ao odor ficam totalmente a critério do investigador para permitir estudos direcionados das propriedades do período crítico, remodelando a reversibilidade e a reabertura da plasticidade do período crítico. Da mesma forma, a força da experiência do odorante pode ser facilmente manipulada para o estudo da poda de glomérulos sinápticos dependentes da dose (Figura 3). É importante ressaltar que estudos que usam concentrações mais baixas de EB (por exemplo, 15% de EB) podem ser usados para testar manipulações que podem aumentar a taxa ou a extensão da remodelação dos glomérulos sinápticos. Por exemplo, os resultados podem mostrar que a poda sináptica em níveis mais baixos de EB (por exemplo, 15%) é indistinguível de níveis mais altos de EB (por exemplo, 25%). Em diferentes manipulações, os resultados podem ser comparados à inervação consistente dos controles do veículo odorífero e à poda robusta dos glomérulos sinápticos que ocorre a 25% EB (Figura 3). Uma limitação desse método é que a exposição ao odor depende inteiramente da volatilidade do odor dissolvido. Fatores variáveis como temperatura e umidade relativa afetam a eficácia da exposição ao odor⁸. A densidade da mosca nas câmaras de odor também pode afetar a exposição ao odor, por exemplo, através da produção de odor derivado da mosca Recomenda-se uma densidade não superior a 20-25 moscas por frasco. A concentração de odorante necessária para induzir a poda de glomérulos sinápticos muito forte é provavelmente maior do que a normalmente experimentada na natureza^10,17. Técnicas de imagem de resolução muito mais alta seriam necessárias para testar a eliminação de sinapses em concentrações mais baixas de odor. No entanto, o protocolo atual permite estudos consistentes e confiáveis para uma série de manipulações.

Há imensos benefícios para este protocolo de exposição a odores e imagens cerebrais. Drosophila é um modelo animal extremamente vantajoso fundado em um extenso e sofisticado kit de ferramentas genéticas, que pode ser sistematicamente explorado para o amplo estudo das interações gene-ambiente na remodelação do circuito olfativo de período crítico. Os exemplos mostrados aqui incluem a linha de driver transgênico Or42a-Gal4, o marcador de membrana UAS-mCD8::GFP e a fusão direta Or42a-mCD8::GFP. Não há diferenças distinguíveis entre a poda de glomérulos sinápticos com a fusão direta Or42a versus abordagens de marcação indireta Gal4 / UAS ^8,9. O driver Or42a-Gal4 fornece a capacidade de manipular os neurônios receptores olfativos direcionados e visualizar mudanças dependentes da experiência na inervação do VM7, enquanto a linha de fusão direta libera o sistema transgênico binário UAS-Gal4 para outras manipulações direcionadas a células. Muitas outras linhagens mutantes e transgênicas do extenso kit de ferramentas de Drosophila podem ser empregadas para testar mecanismos de restrição temporal e dependentes da experiência, incluindo a identificação de células que medeiam a poda sináptica, as vias de sinalização intercelular que transmitem informações de experiência olfativa e a maquinaria intracelular necessária para a eliminação de sinapses direcionadas. No geral, este protocolo permite a interrogação sistemática de muitos mecanismos que impulsionam a remodelação do circuito cerebral dependente da experiência olfativa. Este protocolo de exposição a odorantes e imagens cerebrais também pode ser usado para investigar modificações comportamentais da experiência olfativa específica do período crítico, manipulações genéticas e farmacêuticas que podem permitir a reabertura da plasticidade crítica do período na maturidade e outros aspectos da plasticidade do circuito olfativo além da poda dos glomérulos sinápticos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Para Exposição a Odores
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Butirato de etila	Sigma Aldrich	E15701
Tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-129
Óleo mineral	Sigma Aldrich	M3516
Câmaras de odor	Glasslock
Pincéis	Winsor &	Newton Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Malha de arame	Scienceware	378460000
Dissecação cerebral
Etanol, 190 provas	Decon Labs	2801	Diluído a 70%
Pinças	de Ciência Fina	11251-30	Dumont #5
Paraformaldeído	Ciências do Microscópio Eletrônico	157-8	Diluído para 4%
Placas de Petri	Fisher Scientific	08-757-100B
Solução salina tamponada com fosfato	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluído para 1x
sacarose	Fisher Scientific	BP220-1
Microscópio Eletrônico Sylgard	Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 cabra anti-frango	Invitrogen	A11039
546 cabra anti-rato	Invitrogen	A11081
Soro bovino albumina	Sigma Aldrich	A9647
Frango anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Fita dupla face	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Microscópio Eletrônico Sciences	17984-25
Lâminas de microscópio	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Esmalte de unhas	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisível
Soro de cabra normal	Sigma Aldrich	G9023
Estudos de desenvolvimento anti-CadN de ratos	Banco de hibridoma	AB_528121
Confocal/Análise
Qualquer computador/laptop
Microscópio confocal	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Software Fiji	Fiji		Versão 2.14.0/1.54f