Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.
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Artigo de método
Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Esse processo é crucial para o funcionamento adequado do cérebro, e sua desregulação pode resultar em distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos após o nascimento. De fato, muitos genes responsáveis por essas doenças estão envolvidos nesse processo e, portanto, revelar como essas mutações afetam a dinâmica celular é importante para entender a patogênese dessas doenças. Este protocolo introduz uma técnica para imagens de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro obtidas de embriões de camundongos. As células são marcadas com proteínas fluorescentes usando eletroporação in utero , que visualiza células individuais migrando da zona ventricular com uma alta relação sinal-ruído. Além disso, este sistema de transferência de genes in vivo nos permite realizar facilmente experimentos de ganho de função ou perda de função nos genes dados por co-eletroporação de sua expressão ou vetores de knockdown/knockout. Usando este protocolo, o comportamento migratório e a velocidade de migração de células individuais, informações que nunca são obtidas de cérebros fixos, podem ser analisados.
Introdução
Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, a glia radial (apical) na zona ventricular palial (VZ) que reveste o ventrículo lateral produz primeiro neurônios e depois progenitores gliais com algum período de sobreposição1. Os neurônios também são gerados a partir de progenitores intermediários ou glia radial basal na zona subventricular (SVZ) adjacente à VZ, ambas originadas da glia radial (apical) 2,3. Em camundongos, as células gliais radiais produzem apenas neurônios no dia embrionário (E) 12-14, neurônios e progenitores gliais em E15-16 e progenitores gliais de E17 em diante
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Protocolo
O presente estudo foi realizado com a aprovação e seguindo as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Pesquisa do Desenvolvimento, Centro de Deficiência do Desenvolvimento de Aichi (# 2019-013) e Universidade de Keio (A2021-030). Camundongos ICR (tipo selvagem) prenhes cronometrados foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais). Para observar a relação entre células migratórias e vasos sanguíneos, foram utilizados camundongos Flt1-DsRed, nos quais as células endoteliais expressam DsRed22. Camundongos Flt1-DsRed machos foram cruzados com camundongos ICR fêmeas (ambos os camundongos tinham 8-24 ....
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Resultados
As células gliais radiais na VZ palial produzem apenas neurônios até E14, e neurônios e células gliais em E15 e E16. Para observar os comportamentos migratórios de neurônios e células gliais simultaneamente, nós os rotulamos com GFP aprimorado (EGFP) e RFP, respectivamente, usando um promotor específico de neurônio, o promotor Tα127 e o promotor da proteína ácida fibrilar glial humana (hGFAP)28, que é preferencialmente ativado em astrócitos. Os progenitores dos ast.......
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Discussão
Este protocolo introduziu um método para a observação de lapso de tempo de células derivadas do VZ palial (cortical). Para rotular as células migratórias do VZ, usamos a eletroporação no útero, na qual as células individuais foram claramente marcadas com uma relação sinal-ruído mais alta do que na marcação mediada por vetor viral. Usando a eletroporação in utero, qualquer tipo de vetor em qualquer combinação pode ser facilmente introduzido nas células gliais radiais (células-tronco neurais) em embriões .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
O promotorT α1 é um presente de P. Barker e F.D. Miller. O promotor Dcx é um presente de Q. Lu. hGFAP-Cre foi um presente de Albee Messing. O sistema vetorial de transposon PiggyBac foi fornecido pelo Instituto Sanger. Os camundongos Flt1-DsRed foram fornecidos por M. Ema (Universidade de Shiga). Este trabalho foi apoiado pela JSPS KAKENHI (Grant Number JP21K07309 para H. Tabata, JP20H05688 e JP22K19365 para K. Nakajima) e Takeda Science Foundation, Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, Keio Gijuku Academic Development Funds para K. Nakajima.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Conjunto de tubo de aspiração | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezol (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
| Suplemento B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Butorfanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Inserção de cultura de células | Millipore | PICM ORG 50 | |
| Microscópio confocal | Nikon | A1RHD25 | Equipado com uma lente de longa distância de trabalho (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| Câmara de cultura | Tokken | TK-NBCMP | Eletroporador feito sob medida |
| NEPA Gene | NEPA21 | ||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Misturador de gás | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| Prato de base de vidro | Iwaki | 3910-035 | O diâmetro da base de vidro é de 27 mm |
| Capilares de vidro | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| Unidade de aquecimento | Tokken | TK-0003HU20 | Feito sob medida, incluindo capuz e aquecedor |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | Um presente de Albee Messing |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
| L-glutamina (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Baixa temperatura de fusão agarose | Lonza | 50100 | |
| Medetomidina (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| Microinjetor | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Meio neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | O cDNA hyPBase de pCMV-hyPBase (um presente do Instituto Sanger) foi inserido a jusante do promotor CAG de pCAGGS (um presente de J. Miyazaki). | ||
| pDcx-Dre | O promotor Dcx de Dcx4kbEGFP70 (um presente de Q. Lu) foi trocado pelo promotor CAG de pCAG-NLS-HA-Dre34 (um presente de Pawel Pelczar, Addgene # 51272). | ||
| Penicilina + Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Kit de purificação de plasmídeos | Invitrogen | PureLink HiPure plasmídeo kit midiprep (K210005) | |
| pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL de pCALNL-DsRed (um presente de Connie Cepko, Addgene # 13769) e TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) foram inseridos no local de clonagem de pPB-CAG.EBNXN (um presente do Sanger Institute). | ||
| pPB-CAG-rDIO-EGFP | A sequência contendo sítios sintéticos de rox, sintético DIO e cDNA EGFP de pEGFP-N1 (Clontech, U55762) na direção inversa foram inseridos no sítio de clonagem de pPB-CAG.EBNXN (um presente do Instituto Sanger). A sequência é fornecida no Arquivo Suplementar. | ||
| Extrator | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | um plugin para ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| Agulha de sutura | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 círculo, comprimento 14 mm |
| Fio de sutura | Nazme | C-23-B2 | Seda, tamanho 5-0 |
| Camundongos ICR (tipo selvagem) grávidos cronometrados Camundongo | |||
| TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
| eletrodo tipo pinça | BEX ou NEPA Gene | CUY650P5 | |
| T&alfa; O cDNA de 1-EGFP | EGFP de pEGFP-N1 (Clontech, U55762) foi inserido no downstream do T & alfa; 1 promotor no plasmídeo 253 (um presente de P. Barker e F.D.Miller) | ||
| Micrótomo vibratório | Leica ou Zeiss | Micrótomo de lâmina vibratória VT1000S ou Hyrax V50. |
Referências
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric d....
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Reimpressões e permissões
