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Preparação e análise de lâminas histológicas de globos oculares de ratos e camundongos para avaliação da retina

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DOI:

10.3791/66663

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23 de agosto de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito apresenta um protocolo para a preparação histológica de lâminas de globos oculares de roedores. Com o método proposto, a retina interna pode ser facilmente visualizada e avaliada ao microscópio óptico. O procedimento é apresentado para os globos oculares de camundongos e ratos.

Resumo

Um globo ocular de roedor é uma ferramenta poderosa para pesquisar os mecanismos patológicos de muitas doenças oftálmicas, como glaucoma, retinopatia hipertensiva e muito mais. Experimentos pré-clínicos permitem que os pesquisadores examinem a eficácia de novos medicamentos, desenvolvam novos métodos de tratamento ou busquem novos mecanismos patológicos envolvidos no início ou progressão da doença. Um exame histológico fornece muitas informações necessárias para avaliar os efeitos dos experimentos realizados e pode revelar degeneração, remodelação tecidual, infiltração e muitas outras patologias. Na pesquisa clínica, raramente há chance de obter tecido ocular adequado para um exame histológico, razão pela qual os pesquisadores devem aproveitar a oportunidade oferecida pelo exame de globos oculares de roedores. Este manuscrito apresenta um protocolo para a preparação histológica de cortes de globos oculares de roedores. O procedimento é apresentado para os globos oculares de camundongos e ratos e tem as seguintes etapas: (i) coleta do globo ocular, (ii) preservação do globo ocular para análise posterior, (iii) processamento do tecido em parafina, (iv) preparação de lâminas, (v) coloração com hematoxilina e eosina, (vi) avaliação do tecido ao microscópio óptico. Com o método proposto, a retina pode ser facilmente visualizada e avaliada em detalhes.

Introdução

O globo ocular é uma estrutura semelhante a um globo que constitui o órgão da visão. O interior do globo ocular pode ser dividido em dois segmentos: o segmento anterior, que inclui a córnea, íris, corpo ciliar, cristalino, câmara anterior e câmara posterior, e o segmento posterior, que inclui o corpo vítreo, retina, coróide, esclera, cabeça do nervo óptico. A câmara anterior está localizada entre a córnea e a íris 1,2. A íris é uma estrutura circular com uma abertura no centro chamada pupila. Na junção da córnea e da íris, existe o ângulo de drenagem, onde um sistema especializado de trabéculas drena o humor aquoso do globo ocular para o sistema venoso. A câmara posterior é ligada pela íris, pelo corpo ciliar e pelo cristalino, bem como pelos ligamentos suspensores que mantêm o cristalino no lugar. Atrás do cristalino, localiza-se o corpo vítreo, que é a maior estrutura do globo ocular. O corpo vítreo adere à retina e estabiliza sua posição. A retina é circundada pela coróide e pela esclera1. A anatomia do globo ocular está resumida na Figura 1.

A parede do globo ocular constitui três camadas. A camada mais externa é a esclera, que protege o globo ocular de lesões e mantém sua forma. No pólo anterior do globo ocular, a esclera se transforma em uma córnea transparente. Sob a esclera, existe uma estrutura vascular chamada úvea, cuja função principal é nutrir as estruturas do olho. A úvea forma a coróide e, dentro do pólo anterior, o corpo ciliar e a íris1. A camada mais interna é a retina, que é uma estrutura altamente especializada do olho, composta por neurônios, células gliais e células epiteliais pigmentares. Os neurônios da retina incluem as células fotorreceptoras (bastonetes e cones), células horizontais, células bipolares, células amácrinas e células ganglionares da retina (RGCs). Essas células são organizadas em camadas complexas, e sua função é receber e processar estímulos luminosos 2,3. As células gliais da retina compreendem as células de Müller, astrócitos e microglia, que estão presentes em todas as camadas da retina. As muitas funções das células gliais incluem a nutrição dos neurônios, suporte da barreira sangue-retina, suporte estrutural dos neurônios para manter a estrutura em camadas da retina, regulação do metabolismo dos neurônios, secreção de proteínas biologicamente ativas regulando o funcionamento, crescimento e sobrevivência dos neurônios e regulando os processos imunológicos dentro da retina4. As células epiteliais pigmentares constituem a camada mais externa da retina e atuam como uma barreira entre a coróide e os fotorreceptores. Essas células regulam o transporte bidirecional de resíduos e nutrientes e também protegem a retina de danos excessivos induzidos pela luz, absorvendo a energia da luz e neutralizando as espécies reativas de oxigênio geradas pela luz5.

A retina pode ser dividida em dez camadas: (i) o epitélio pigmentar da retina, (ii) a camada do segmento fotorreceptor (bastonetes e cones), (iii) membrana limitante externa (ELM), (iv) camada nuclear externa (ONL), (v) camada plexiforme externa (OPL), (vi) camada nuclear interna (INL), (vii) camada plexiforme interna (IPL), (viii) camada de células ganglionares (GCL), (ix) camada de fibras nervosas da retina (RNFL), e (x) membrana limitante interna (ILM)2. As camadas nucleadas da retina incluem o ONL, INL e GCL, enquanto as camadas com conexões sinápticas entre as células incluem o OPL e o IPL6. Os núcleos de bastonetes e cones formam o ONL, e seus axônios se estendem para o OPL, onde se conectam aos dendritos das células bipolares e horizontais. Dentro do INL, os núcleos das células horizontais, bipolares e amácrinas estão localizados. Dentro do IPL, os terminais axônicos das células bipolares e amácrinas fazem sinapse com dendritos de RGCs. Dentro do GCL, os RGCs compõem a maioria dos corpos celulares, mas também algumas células amácrinas deslocadas podem ser encontradas lá. Os axônios dos RGCs formam a RNFL e, além disso, o nervo óptico 7,8,9.

Muitas doenças oftálmicas, como distúrbios neurodegenerativos da retina, levam à cegueira irreversível e incurável10. A visão é considerada um dos sentidos mais importantes11, e a cegueira permanente reduz significativamente a qualidade de vida do paciente. Para aprofundar a compreensão dos mecanismos patológicos de muitas doenças, a pesquisa pré-clínica usando culturas de células ou modelos animais é amplamente realizada. Estudos pré-clínicos usando animais experimentais oferecem uma oportunidade para avaliar os mecanismos patológicos subjacentes às doenças oculares e desenvolver novas estratégias terapêuticas. As doenças oculares podem ser modeladas tanto em animais grandes (macacos, vacas, cães e gatos) quanto em pequenos animais (coelhos, ratos, camundongos e peixes-zebra). O uso de animais maiores permite melhor acesso ao olho devido ao seu tamanho. Já experimentos realizados com roedores, devido à sua reprodução relativamente rápida, permitem o cruzamento de linhagens endogâmicas caracterizadas pela suscetibilidade a determinadas doenças12,13.

Em modelos animais, a enucleação é possível, o que permite realizar um exame histopatológico detalhado do globo ocular, com a avaliação de patologias menores que aparecem em estruturas específicas do olho durante o desenvolvimento da doença - um exame que raramente pode ser realizado em humanos. A avaliação histopatológica é uma ferramenta extremamente valiosa na pesquisa dos mecanismos patológicos das doenças oculares. Na literatura publicada, as descrições da metodologia para o exame histológico dos globos oculares são muito limitadas e faltam guias passo a passo, o que dificulta a recriação dos iniciantes. Este estudo tem como objetivo fornecer um método simples e conciso de preparação de lâminas histológicas e avaliação da retina de ratos e camundongos.

Protocolo

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais. Os globos oculares utilizados neste estudo foram obtidos de animais incluídos em um experimento conduzido com base no número de aprovação do estudo WAW2/122/2020 emitido pelo2º Comitê de Ética Local da Universidade de Ciências da Vida de Varsóvia em Varsóvia, Polônia. Nosso protocolo foi desenvolvido examinando camundongos com 11 e 44 semanas e ratos com 6, 12 e 16 semanas.

1. Preparação de globos oculares de camundongos

NOTA: Este protocolo apresenta o método de preparação de seções de globos oculares de camundongos e foi desenvolvido usando globos oculares colhidos de: camundongos C57Bl/6 fêmeas com 11 semanas de idade (peso médio de 21 g), camundongos C57Bl/6 fêmeas com 44 semanas (peso médio de 25 g), camundongos DBA/2 fêmeas com 11 semanas (peso médio de 21,5 g) e camundongos DBA/2 fêmeas com 44 semanas com glaucoma (peso médio de 25 g).

  1. Enucleation
    1. Use uma pequena pinça para abrir as pálpebras. Pressione as pálpebras para que o globo ocular prolapse.
    2. Disseque o globo ocular da órbita cortando o tecido atrás do globo ocular com uma tesoura pequena e afiada. Uma vez que o globo ocular é removido da órbita, corte o tecido conjuntivo saliente e os músculos perioculares.
      1. Marque os globos oculares para melhor orientação, por exemplo, amarrando uma pequena sutura no coto do tendão do músculo reto lateral do globo ocular para marcar o lado temporal do globo ocular.
  2. Fixação de tecidos
    1. Colocar o globo ocular enucleado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e deixar repousar em solução de paraformaldeído (PFA) a 4 % dissolvido em tampão fosfato salino (PBS) durante 24 h.
    2. Em seguida, trate o globo ocular por 24 h em uma solução de sacarose a 10%, depois remova e coloque por 24 h em uma solução de sacarose a 20% e, finalmente, remova e coloque por 24 h em uma solução de sacarose a 30%.
      NOTA: Durante todo o processo, mantenha o globo ocular a uma temperatura baixa de 4 °C. Punções com agulha para infiltração de sacarose devem ser evitadas para minimizar o risco de danos ao globo ocular.
  3. Congelamento e armazenamento de tecidos
    1. Remova o globo ocular da solução de sacarose e seque-o enxugando-o levemente com uma toalha de papel.
    2. Coloque o globo ocular em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL e congele a - 80 °C para processamento futuro.
      NOTA: Se armazenado a - 80 °C, um globo ocular pode permanecer viável por até 12 meses até o processamento futuro.
  4. Preparação de slides
    1. Descongele o globo ocular à temperatura ambiente. Mova-o do tubo da microcentrífuga para um e enxágue em água corrente por 20 minutos para lavar a sacarose.
    2. Desidrate o globo ocular colocando-o e removendo-o das seguintes soluções sob uma capela de exaustão: solução de álcool etílico a 70% (EtOH) por 10 min, solução de EtOH a 80% por 10 min, solução de EtOH a 96% por 10 min, solução de EtOH a 99,9% por 10 min e acetona por 5 min.
    3. Limpe o globo ocular colocando-o em xileno por 5 min sob uma coifa.
    4. Derreta a parafina colocando um pouco de parafina sólida em um béquer e colocando-a em uma incubadora de laboratório ajustada para uma temperatura superior à temperatura de fusão especificada pelo fabricante da parafina (a temperatura de fusão da parafina está entre 46 ° C e 68 ° C). Depois que a parafina estiver totalmente derretida (o tempo depende da quantidade de parafina usada), mova o globo ocular para dentro do béquer com parafina e mantenha aquecido na incubadora por 1 h. Durante 1 h de infiltração de parafina no tecido, agite a parafina a cada 10 - 15 min.
      NOTA: Um processador de tecidos que permite a infiltração de parafina enquanto agita a solução pode ser usado para esta etapa.
    5. Incorpore o globo ocular em um bloco de parafina, conforme descrito abaixo.
      1. Abra o e remova a tampa superior. Escolha um molde de metal e despeje uma pequena quantidade de parafina para cobrir o fundo do molde. Remova o globo ocular do com uma pinça e coloque-o na parafina do molde. Coloque o globo ocular de lado para garantir o corte no plano sagital.
        NOTA: Colocar o globo ocular de lado (com o pólo anterior para um lado e o pólo posterior para o outro) permitirá o corte no plano sagital. Desta forma, serão obtidos cortes através da córnea, íris, corpo ciliar, pupila, retina periférica e central.
      2. Resfrie brevemente o molde em uma placa de resfriamento ajustada para - 15 °C para que a parafina solidifique levemente para ancorar o tecido no lugar. Cubra cuidadosamente o tecido com parafina e o fundo do para formar um bloco. Coloque o bloco em uma placa de resfriamento para solidificar totalmente. Em seguida, remova o bloco do molde de metal e coloque os blocos de parafina de volta na placa de resfriamento por pelo menos 15 minutos para esfriar antes de cortar.
    6. Prenda um bloco de parafina no micrótomo. Defina o micrótomo para aparar o excesso de parafina do bloco (nós o configuramos para cortar 15 μm) e apare até o centro do globo ocular. Altere as configurações do micrótomo para cortar seções mais finas (nós o configuramos para cortar 3.5 μm) e coloque a seção em uma lâmina. Se estiver usando um micrótomo com banho-maria adjacente, remova o excesso de água da lâmina com um lenço úmido.
      NOTA: O objetivo é obter pelo menos 3 seções transversais através da pupila. Quanto menos experiente for o pesquisador, mais seções devem ser obtidas para garantir o corte no nível do aluno. Coloque algumas seções em um slide. Além disso, para pesquisadores menos experientes, corte o tecido mais espesso, por exemplo, em seções de 4 μm ou 5 μm de espessura. O uso de um micrótomo com banho-maria adjacente torna o processo de transferência de seções de tecido para lâminas muito mais fácil quando comparado ao uso de micrótomos sem banho-maria. Outro ponto digno de nota é que a lente pode ser difícil de cortar. Para minimizar o risco de danos aos tecidos pela lente quebradiça, use apenas lâminas afiadas de micrótomo designadas para cortar tecidos duros. Considere usar uma lâmina para aparar e outra para cortar seções para minimizar o embotamento da lâmina.
    7. Coloque a lâmina em uma incubadora de laboratório ajustada para 56 °C por 30 min.
    8. Remova a lâmina da incubadora e comece a corá-la com hematoxilina e eosina (H & E) manualmente, colocando e removendo sequencialmente a lâmina de e para as seguintes soluções. Comece com 7 min de xileno, 5 min de xileno (outro copo com uma solução limpa) e 5 min de xileno (outro copo com uma solução limpa). Siga com 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (outro copo com uma solução limpa), 1 min 96% EtOH (outro copo com uma solução limpa).
    9. Lave em 5 min de água corrente, depois 2 min de hematoxilina de Mayer, 2 min de hematoxilina de Mayer (outro béquer com uma solução limpa), 5 min de água corrente, 5 min de água corrente (outro béquer limpo).
    10. Adicione 1% de Eosina por 2 min, seguido de 1 min 96% de EtOH, 30 s 96% de EtOH (outro béquer com uma solução limpa), 30 s 96% de EtOH (outro copo com uma solução limpa), 2 min de xileno, 1 min de xileno (outro copo com uma solução limpa), 2 min de xileno (outro copo com uma solução limpa).
      NOTA: Como alternativa, use um corador de lâmina automatizado.
    11. Sele a lâmina usando um selador de lâminas automatizado. A lâmina preparada está pronta para armazenamento e avaliação sob um microscópio óptico.
      NOTA: Como alternativa, execute a vedação da corrediça manualmente, colocando uma fina camada de poliestireno no tecido manchado e cobrindo-o com uma lamínula de vidro.
      CUIDADO: As etapas que incluem PFA, EtOH, acetona e xileno devem ser realizadas sob uma capela de laboratório.

2. Preparação da seção dos globos oculares de rato e montagem da lâmina

NOTA: Este protocolo apresenta o método de preparação de cortes de globos oculares de ratos e foi desenvolvido usando os globos oculares colhidos de: ratos SHR machos com 6 semanas de idade (peso médio 115,5 g), ratos SHR machos com 12 semanas de idade com hipertensão arterial (peso médio 262,5 g), ratos WKY machos com 6 semanas (peso médio 143,5 g), ratos WKY machos com 12 semanas (peso médio 265 g), ratos Lewis machos com 12 semanas de idade (peso médio de 310 g) e ratos Lewis machos com 16 semanas de idade com diabetes mellitus induzido (peso médio de 259 g).

  1. Enucleation
    1. Use uma pequena pinça para abrir as pálpebras. Pressione as pálpebras para prolapsar o globo ocular.
    2. Disseque o globo ocular da órbita cortando o tecido atrás do globo ocular com uma tesoura pequena e afiada.
      NOTA: Marque os globos oculares para melhor orientação, por exemplo, amarrando uma pequena sutura no coto do tendão do músculo reto lateral do globo ocular para marcar o lado temporal do globo ocular.
  2. Fixação de tecidos
    1. Coloque o globo ocular enucleado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixe-o descansar em uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% dissolvido em solução salina tampão fosfato (PBS) por 24 h.
    2. Em seguida, trate o globo ocular por 24 h em uma solução de sacarose a 10%, depois remova e coloque por 24 h em uma solução de sacarose a 20% e, finalmente, remova e coloque por 24 h em uma solução de sacarose a 30%.
      NOTA: Durante todo o processo, mantenha o globo ocular a uma temperatura baixa de 4 °C. Punções com agulha para infiltração de sacarose devem ser evitadas para minimizar o risco de danos ao globo ocular.
  3. Congelamento e armazenamento de tecidos
    1. Remova o globo ocular da solução de sacarose e seque-o enxugando-o levemente com uma toalha de papel.
    2. Coloque o globo ocular em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL e congele-o a -80 °C para processamento futuro.
      NOTA: Se armazenado a -80 °C, o globo ocular pode permanecer viável por até 12 meses até o processamento futuro.
  4. Preparação de slides
    1. Remova o globo ocular do freezer e do tubo da microcentrífuga. Corte o globo ocular ao meio ao longo do plano sagital com um bisturi afiado. Remova e descarte a lente.
      NOTA: Esta etapa é mais fácil de executar em um globo ocular congelado, recém-retirado do freezer. Durante o corte do globo ocular, a lente pode danificar o tecido circundante. Para minimizar o risco de danos, use um bisturi bem afiado e seja cauteloso.
    2. Descongele o globo ocular à temperatura ambiente. Mova as duas metades para um e enxágue em água corrente por 20 minutos para lavar a sacarose.
    3. Desidrate o globo ocular colocando-o e removendo-o das seguintes soluções sob uma capela de exaustão: solução de álcool etílico a 70% (EtOH) por 15 min, solução de EtOH a 80% por 15 min, solução de EtOH a 96% por 15 min, solução de EtOH a 99,9% por 15 min e acetona por 7 min.
    4. Limpe o globo ocular colocando-o em xileno por 7 min sob um exaustor.
    5. Derreta a parafina colocando um pouco de parafina sólida em um béquer e colocando-a em uma incubadora de laboratório ajustada para uma temperatura superior à temperatura de fusão especificada pelo fabricante da parafina (a temperatura de fusão da parafina está entre 46 ° C e 68 ° C). Depois que a parafina estiver totalmente derretida (o tempo depende da quantidade de parafina usada), mova o globo ocular para dentro do béquer com parafina e mantenha-o aquecido na incubadora por 1 h. Durante 1 h de infiltração de parafina no tecido, agite a parafina a cada 10 - 15 min.
      NOTA: Um processador de tecidos que permite a infiltração de parafina enquanto agita a solução pode ser usado para esta etapa.
    6. Incorpore o globo ocular em um bloco de parafina, conforme descrito abaixo.
      1. Abra o e remova a tampa superior. Escolha um molde de metal e despeje uma pequena quantidade de parafina para cobrir o fundo do molde. Remova o globo ocular do com uma pinça e coloque-o na parafina do molde. Coloque uma metade do globo ocular com a parte inferior do copo para cima e a outra para baixo.
        NOTA: Colocar as metades do globo ocular com uma metade com a parte inferior do copo para cima e a outra para baixo permitirá o corte do tecido no plano sagital. Desta forma, serão obtidos cortes através da córnea, íris, corpo ciliar, pupila, retina periférica e central.
      2. Resfrie brevemente o molde em uma placa de resfriamento ajustada para - 15 ° C para que a parafina solidifique levemente e ancore o globo ocular no lugar. Cubra cuidadosamente o globo ocular com parafina e o fundo do para formar um bloco. Coloque o bloco em uma placa de resfriamento para solidificar totalmente. Em seguida, remova o bloco do molde de metal e coloque os blocos de parafina de volta na placa de resfriamento por pelo menos 15 minutos para esfriar antes de cortar.
    7. Prenda um bloco de parafina no micrótomo. Defina o micrótomo para aparar o excesso de parafina do bloco (nós o configuramos para cortar 15 μm) e apare até chegar ao centro do globo ocular. Altere as configurações do micrótomo para cortar seções mais finas (nós o configuramos para cortar 3.5 μm) e coloque a seção em uma lâmina. Se você estiver usando um micrótomo com banho-maria adjacente, remova o excesso de água da lâmina com um lenço úmido.
      NOTA: O objetivo é obter pelo menos 3 seções transversais através da pupila. Quanto menos experiente for o pesquisador, mais seções devem ser obtidas para garantir o corte no nível do aluno. Coloque algumas seções em um slide. Além disso, para pesquisadores menos experientes, corte o tecido mais espesso, por exemplo, em seções de 4 μm ou 5 μm de espessura. O uso de um micrótomo com banho-maria adjacente torna o processo de transferência de seções de tecido para lâminas muito mais fácil quando comparado ao uso de micrótomos sem banho-maria.
    8. Remova a lâmina e comece a corar com hematoxilina e eosina (H & E) manualmente, colocando e removendo sequencialmente a lâmina de e para as seguintes soluções. Comece com 7 min de xileno, 5 min de xileno (outro copo com uma solução limpa) e 5 min de xileno (outro copo com uma solução limpa). Siga com 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (outro copo com uma solução limpa), 1 min 96% EtOH (outro copo com uma solução limpa).
    9. Lave em 5 min de água corrente, depois 2 min de hematoxilina de Mayer, 2 min de hematoxilina de Mayer (outro béquer com uma solução limpa), 5 min de água corrente, 5 min de água corrente (outro béquer limpo).
    10. Adicione 1% de Eosina por 2 min, seguido de 1 min 96% de EtOH, 30 s 96% de EtOH (outro béquer com uma solução limpa), 30 s 96% de EtOH (outro copo com uma solução limpa), 2 min de xileno, 1 min de xileno (outro copo com uma solução limpa), 2 min de xileno (outro copo com uma solução limpa).
      NOTA: Como alternativa, use um corador de lâmina automatizado.
    11. Sele a lâmina usando um selador de lâminas automatizado. As lâminas preparadas estão prontas para armazenamento e avaliação sob um microscópio óptico.
      NOTA: Como alternativa, execute a vedação da corrediça manualmente, colocando uma fina camada de poliestireno no tecido manchado e cubra com uma lamínula de vidro.
      CUIDADO: As etapas que incluem PFA, EtOH, acetona e xileno devem ser realizadas sob uma capela de laboratório.

3. Avaliação das seções do globo ocular

  1. Digitalização de slides
    1. Coloque a lâmina em um scanner de lâminas histopatológico e escaneie as seções usando o modo de digitalização: 40x. Salve as imagens como arquivos digitais de alta resolução.
  2. Análise de lâminas
    1. Abra o arquivo digitalizado com o uso de software de visualização de imagens. Encontre seções transversais da pupila e analise três seções consecutivas.
    2. Encontre a parte mais grossa da retina e amplie a imagem para 20x pressionando a caixa de ampliação no canto superior direito e escolhendo 20x. Mova o mouse para o nível do ELM na parte mais grossa da retina e pressione o botão direito do mouse, escolha Anotar e Régua.
    3. Mova o mouse em direção ao ILM e clique no botão esquerdo. Dê um título à medida RT e marque as caixas mostrar título e mostrar comprimento. Dessa forma, a espessura da retina (TR) será medida e a medida será mostrada em μm. Os resultados representativos são mostrados na Figura 2 e na Figura 3.
    4. Use a régua, meça a espessura de cada camada da retina, incluindo ONL, OPL, INL e IPL, e rotule-as. Os resultados representativos são mostrados na Figura 4 e na Figura 5.
    5. Para contar o número de células dentro do GCL, estabeleça um comprimento predeterminado da retina. Por exemplo, para a retina do camundongo, use uma seção de 500 μm e, para a retina do rato, use cinco seções de 100 μm.
    6. Usando a régua, meça a distância escolhida ao longo do GCL. Pressione o botão direito do mouse e selecione Anotar > salvo > 1x RBC. Clique em cada célula identificada como um corpo redondo e manchado de hematoxilina ao longo do GCL ao longo do comprimento predeterminado da retina. Conte o número de células circundadas. Os resultados representativos são mostrados na Figura 6 e na Figura 7.
    7. Depois de analisar três seções consecutivas, desenhe a média de todas as medições.

Resultados

Com o uso do protocolo apresentado, a anatomia e a morfologia de estruturas específicas do globo ocular podem ser avaliadas em detalhes. Nossa equipe se concentra em pesquisar os mecanismos patológicos da neurodegeneração em distúrbios da retina, como glaucoma, retinopatia diabética e retinopatia hipertensiva. Para avaliar as características da neurodegeneração na retina, avaliamos o RT (globo ocular de camundongo - Figura 2, globo ocular de rato - Figura 3), ONL, OPL, INL e IPL (globo ocular de camundongo - Figura 4, globo ocular de rato - Figura 5) e o número de células do GCL (globo ocular de camundongo - Figura 6, globo ocular de rato - Figura 7). Espera-se que o RT e as células do GCL sejam mais altos na retina central e mais baixos na periferia. Ao cortar o globo ocular ao nível da pupila, cortes transversais através da retina central (no pólo posterior do globo ocular) e periférica (perto do corpo ciliar) são obtidos em uma lâmina.

Embora a contagem de células GCL possa ser considerada bastante objetiva, o viés causado pelo corte distorcido pode influenciar os resultados da medição das camadas específicas da retina. Para evitar viés, as medições podem ser apresentadas como a razão entre a espessura de uma determinada camada e o valor de RT: ONL/RT, OPL/RT, INL/RT e IPL/RT.

Diagrama de anatomia do olho mostrando partes rotuladas: retina, esclera, lente, córnea, nervo óptico, mácula.
Figura 1: Anatomia do globo ocular. Seção transversal sagital de um globo ocular com a rotulagem de suas maiores estruturas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagem microscópica da seção transversal da retina, mostrando camadas de tecido, medição de espessura de 125 μm.
Figura 2: Espessura da retina em um camundongo. Medição da espessura da retina (TR) da membrana limitante externa até a membrana limitante interna no ponto mais largo, marcada com a barra verde. Globo ocular de rato (estirpe: C57Bl/6, idade: 44 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Corte histológico mostrando camadas retinianas, 53,4 μm de espessura; Imagem de microscopia, estudo de tecido.
Figura 3: Espessura da retina em um rato. Medição da espessura da retina (TR) da membrana limitante externa até a membrana limitante interna no ponto mais largo, marcada com a barra verde. Globo ocular de rato (cepa: Lewis, idade: 16 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de seção transversal do tecido retiniano; camadas medidas: IPL, INL, OPL, ONL; análise microscópica.
Figura 4: Camadas da retina em um camundongo. Medição da espessura de camadas retinianas individuais: camada nuclear externa (ONL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear interna (INL) e camada plexiforme interna (IPL), marcadas com barras verdes. Globo ocular de rato (estirpe: C57Bl/6, idade: 44 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagem microscópica da seção transversal da retina com camadas marcadas: OPL, ONL, IPL, INL; barra de escala 100 μm.
Figura 5: Camadas da retina em um rato. Medição da espessura de camadas retinianas individuais: camada nuclear externa (ONL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear interna (INL) e camada plexiforme interna (IPL), marcadas com barras verdes. Globo ocular de rato (cepa: Lewis, idade: 16 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Seção de histologia mostrando estrutura celular em camadas, imagem de microscópio, análise de tecido, escala de 500 μm.
Figura 6: Contagem de células da camada de células ganglionares em um camundongo. Método de contagem das células da camada de células ganglionares (GCL) ao longo da retina com um comprimento de 500 μm. Corpos unicelulares foram identificados como corpos redondos corados com hematoxilina localizados dentro da camada de células ganglionares. As células são marcadas com círculos pretos. Globo ocular de camundongo (cepa: DBA/2, idade: 44 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Lâmina histológica, secção transversal da retina; camadas de tecido visíveis; Exame microscópico, escala de 100 μm.
Figura 7: Contagem de células da camada de células ganglionares em um rato. Método de contagem das células da camada de células ganglionares (GCL) ao longo da retina com um comprimento de 100 μm. Corpos unicelulares foram identificados como corpos redondos corados com hematoxilina localizados dentro da camada de células ganglionares. As células são marcadas com círculos pretos. Globo ocular de rato (cepa: Lewis, idade: 16 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Um exame histológico do globo ocular de camundongo e rato é uma ferramenta poderosa no campo da oftalmologia experimental. Pode fornecer novas informações relacionadas a alterações nas estruturas oculares no curso de doenças oftálmicas, que de outra forma não seriam observadas em ambientes clínicos. Os protocolos descritos apresentam um método simples de realização de uma análise histológica da retina. As sutilezas do procedimento necessário para processar tecidos anteriores, como a córnea, não são descritas aqui.

No estudo apresentado, a enucleação foi realizada após a eutanásia dos animais, pois, além dos globos oculares, outros tecidos (sangue, rins) foram colhidos para fins de pesquisa. No entanto, a enucleação também pode ser realizada em animais vivos sob anestesia. Wilding et al. descreveram o procedimento14, e gostaríamos de encaminhar os leitores a este trabalho para ver fotos do procedimento de enucleação.

Embora os protocolos para a preparação das lâminas dos globos oculares de camundongos e ratos sejam semelhantes, a principal diferença entre os globos oculares de camundongos e ratos a serem considerados ao preparar as lâminas é o tamanho. Os globos oculares dos ratos têm um volume 8x - 10x maior em comparação com os camundongos, enquanto o comprimento axial médio de um globo ocular de camundongo é de cerca de 3,2 mm, e o comprimento axial de um globo ocular de rato normalmente oscila em torno de 6,91 mm15,16. Isso facilita a necessidade de cortar os globos oculares dos ratos ao meio para melhor penetração do reagente no tecido durante o processamento. Além disso, o tempo necessário para a penetração do reagente no tecido do rato é maior do que para os globos oculares de camundongos. Ao cortar os globos oculares do rato ao meio, é importante usar uma lâmina afiada, pois a lente firme e congelada pode ser um obstáculo.

Outro ponto que merece ser discutido é a fixação dos tecidos após a colheita dos animais. No protocolo apresentado, os globos oculares, após a enucleação, foram fixados com PFA e imersos em soluções de sacarose. A sacarose atua como crioprotetor, pois protege as células de grandes tecidos dos danos causados pelos cristais de gelo que se formam durante o congelamento17. O congelamento do tecido permite que os pesquisadores armazenem o tecido por mais tempo e também o usem para vários exames no futuro, incluindo uma análise histopatológica com um micrótomo (como apresentado), uma análise histopatológica com um criotomia e imunomarcação para avaliação usando microscopia confocal. Por exemplo, ao cortar um globo ocular de rato ao meio (etapa 2.4.1), se o corte for realizado de forma eficiente e rápida (dentro de 5 a 10 s) e o olho não tiver tempo para descongelar, metade do globo ocular pode ser usada para histopatologia e outra pode ser colocada de volta no freezer para futura imunomarcação. Não recomendamos a realização de imunomarcação em tecidos previamente infiltrados com parafina devido a possíveis alterações na conformação dos epítopos proteicos após a fixação da parafina. No entanto, se um grupo de pesquisadores planeja realizar apenas uma análise histopatológica usando um micrótomo, um método padrão mais simples de fixação de tecidos para inclusão em parafina pode ser usado - por exemplo, em vez de executar as etapas 1.2.1 - 1.4.1 para camundongos ou etapas 2.2.1 - 2.4.2 para ratos, coloque os tecidos em uma solução de PFA a 10% por 24 h, e depois armazená-los em PBS a 4 °C até o processamento. A sacarose não será necessária como crioprotetor, pois os tecidos não serão congelados. Com este método proposto, evitar-se-á o processo de congelação, o que poderá revelar-se benéfico e levar à obtenção de lâminas de maior qualidade. O congelamento dos globos oculares, embora proporcione aos pesquisadores mais liberdade na escolha do momento para realizar o exame histopatológico, é uma etapa que pode potencialmente diminuir a qualidade da amostra e levar ao descolamento de retina. No entanto, deve-se lembrar que, se armazenar tecidos a 4 °C, sua estabilidade biológica será menor e os tecidos devem ser analisados em 4 semanas. Além disso, ao trabalhar com globos oculares de ratos, a etapa 2.4.1 (cortar os globos oculares ao meio) será muito mais difícil de executar em um globo ocular descongelado.

A metodologia apresentada foi desenvolvida com base na metodologia descrita por Chai et al.18, Igarashi et al.19, Zhang et al.20 e Dorfman et al.21, na experiência pessoal e em um método de tentativa e erro. O método de medição da espessura da retina e das camadas individuais é descrito com base na metodologia apresentada por Chai et al.16 e Barber et al.18,22. O método de contagem de RGC retiniano foi desenvolvido a partir de uma revisão do trabalho de Chai et al.16, Zhang et al.18, Steinle et al.19 e Dorfman et al.18,20,21,23. No geral, a preparação de lâminas histopatológicas de globos oculares difere de uma preparação padrão de lâminas de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina porque o globo ocular é esférico e, portanto, mais difícil de manusear, cortar e seccionar. Além disso, a esclera é uma barreira para a infiltração de reagentes no tecido. Ao preparar lâminas histológicas de globos oculares, é preciso trabalhar com mais delicadeza e precisão, tomando cuidado para não danificar as delicadas estruturas da parte interna do globo ocular. As modificações deste protocolo podem incluir o uso da técnica de inclusão de metacrilato em vez de incorporação de parafina, o que pode fornecer melhores resultados morfológicos. No entanto, poucos pesquisadores utilizaram esse método para avaliação da retina24,25.

Este protocolo não está isento de preconceitos. O maior problema com o qual nossa equipe lutou foi o rasgo da retina e o descolamento da retina. Especialmente propensa a rasgar era a retina dos globos oculares de ratos, pois eles tinham que ser cortados ao meio antes da preparação da lâmina e, portanto, a retina era mais propensa a danos. Devido ao descolamento de retina, este protocolo não pode ser usado para a avaliação da coroide, do epitélio pigmentar da retina ou da camada do segmento fotorreceptor. No entanto, nossa equipe acredita que este protocolo pode ser usado para avaliar a retina interna (do ILM ao ELM). Para minimizar a quantidade de rasgo e descolamento da retina, cada etapa do protocolo deve ser realizada com cuidado, devagar e com movimentos precisos.

A análise histopatológica da retina não faz parte do diagnóstico humano padrão, mas é um método amplamente utilizado na pesquisa pré-clínica. Os resultados da avaliação histopatológica da retina em estudos pré-clínicos podem ser relacionados e discutidos com os resultados da tomografia óptica coerente (OCT)26, que é um exame que mostra uma secção transversal através da retina durante um exame in vivo que pode ser realizado em um ambiente clínico, entre humanos em ensaios clínicos. OCT, no entanto, é um exame menos detalhado. Portanto, as informações que podemos extrair de estudos histológicos realizados como parte da pesquisa pré-clínica são insubstituíveis e necessárias para o desenvolvimento do conhecimento médico.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

O trabalho, incluindo ratos, foi financiado no âmbito do projeto TIME 2 MUW - excelência de ensino como oportunidade para o desenvolvimento da Universidade Médica de Varsóvia co-financiado pelo Fundo Social Europeu no âmbito do Programa Operacional Desenvolvimento da Educação do Conhecimento para 2014-2020, o número do acordo de co-financiamento: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. O trabalho, incluindo camundongos, foi realizado como parte de um projeto implementado nos anos de 2020 a 2022, financiado por um subsídio para a ciência obtido pela Universidade Médica de Varsóvia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acetona Chempur 
Pinças Dumont #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm PontasWorld Precision Instruments14095pinça microcirúrgica pequena
EosinMar-Four4P.05.2001/LSolução aquosa
Álcool etílico 96 %Chempur CH.ET. AL.96%CZDA.
Álcool etílico 99,9 %Chempur Ch. ETIL. ALK.99,9%BWUtilizar para preparar soluções de 70% e 80% de Geleira EtOH
- 86 &graus; C Freezer de temperatura ultrabaixa NU-9483ENuAire13027D0034Temperatura de congelamento - 80 ° C
Corredoras de vidroMar-FourMI.15.01673Corrediças de vidro fosco com um campo fosco de dupla face para descrição
Leica CV5030 Totalmente Automatizado Glass CoverslipperLeica Biosystems 14,04,78,80,101Seladora de slides automatizada
Hematoxilina de MayerChempur
Moldes de base de metal 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Micrótomo
Lâminas de barbear de micrótomoMar-FourHI. N.35Ângulo de corte 35°
de biópsia Micro-TwinMar-FourLN.13874550
Processador de Tecidos Híbrido de MicroondasMulticorador Milestone
Leica ST5020Leica Biosystems Manchador de lâminas automatizado
Scanner de lâminas NanoZoomer 2.0-HTHamamatsuC9600Scanner de lâminas histopatológico
NDP.view2 Software de visualização de imagensHamamatsuU12388-01Software de visualização de imagens
Parafina Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010Temperatura de fusão 56 > C - 58 &graus; C
ParaformaldeídoSigma - Aldrich441244-1KGPrepare uma solução a 4% em
PBS PBS TabletsMerck Millipore524650-1EAUse para preparar uma solução de tampão fosfato salino, de acordo com as instruções do fabricante Tubos de
Microcentrífuga Pierce, 1,5 mLThermo Scientific69715
Geladeira-freezer EN14000AWElectrolux925032562-00refrigeração 4 &graus; C
Lâmina de bisturiSwann-MortonT.OST. SKAL00.024
SucroseChempur 
Tesoura de Mola SuperCut, 12.5cm, CurvadaWorld Precision Instruments501925tesoura microcirúrgica pequena e curva
Fita para seladoras automáticasMar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur Ch. KSYL.5l.METAL.OP 
111024800CH1246874023803081427720906

Referências

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