Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Resumo

Apresentamos um protocolo para produção de alto rendimento de canais vasculares com tamanhos flexíveis e padrões desejados em uma placa padrão de seis poços usando a tecnologia de bioimpressão 3D, conhecida como vasos em uma placa (VOP). Esta plataforma tem o potencial de avançar no desenvolvimento de terapêuticas para os distúrbios associados ao endotélio comprometido.

Resumo

A permeabilidade vascular é um fator chave no desenvolvimento de terapias para distúrbios associados ao endotélio comprometido, como disfunção endotelial nas artérias coronárias e função prejudicada da barreira hematoencefálica. As técnicas de fabricação existentes não replicam adequadamente a variação geométrica nas redes vasculares do corpo humano, o que influencia substancialmente a progressão da doença; Além disso, essas técnicas geralmente envolvem procedimentos de fabricação em várias etapas que dificultam a produção de alto rendimento necessária para testes farmacológicos. Este artigo apresenta um protocolo de bioimpressão para a criação de múltiplos tecidos vasculares com padrões e tamanhos desejados diretamente em placas padrão de seis poços, superando os desafios existentes de resolução e produtividade na tecnologia de bioimpressão. Uma abordagem de fabricação simplificada foi estabelecida para construir seis canais ocos e perfusíveis dentro de um hidrogel, que foram posteriormente revestidos com células endoteliais da veia umbilical humana para formar um endotélio funcional e maduro. A natureza controlada por computador da bioimpressão 3D garante alta reprodutibilidade e requer menos etapas de fabricação manual do que os métodos tradicionais. Isso destaca o potencial do VOP como uma plataforma eficiente de alto rendimento para modelar a permeabilidade vascular e avançar na descoberta de medicamentos.

Introdução

A rede vascular em todo o corpo humano funciona como uma barreira de transporte crucial, regulando dinamicamente a troca de moléculas e células entre o sangue e os tecidos circundantes. Essa regulação é essencial para prevenir o edema tecidual e permitir a troca seletiva de nutrientes e células, apoiando assim o metabolismo e a homeostase tecidual¹. A permeabilidade endotelial alterada, um fator em muitas condições de saúde, afeta tanto a gravidade da doença quanto a eficácia do tratamento². O endotélio vascular atua como uma barreira seletiva, facilitando a transferência entre vasos, tecidos e órgãos. Essa regulação envolve vários mecanismos, como a filtragem básica de solutos e pequenas moléculas, a ruptura intencional da barreira vascular e a influência de moléculas como prostaglandinas e fatores de crescimento nos níveis de permeabilidade³.

Os principais fatores nessa regulação incluem as junções das células endoteliais, a migração de leucócitos e a funcionalidade da barreira hematoencefálica⁴. Dada a sua complexidade, o processo varia em diferentes ambientes, envolvendo vários tipos de vasos sanguíneos e utilizando vias anatômicas distintas. Compreender os fundamentos biológicos da permeabilidade vascular é crucial para a elaboração de abordagens terapêuticas para tratar condições associadas à permeabilidade vascular anormal. Manter a permeabilidade vascular é crucial para a saúde do sistema vascular e dos tecidos circundantes; Consequentemente, o comprometimento dessa função leva à disfunção endotelial, estado em que o endotélio perde sua funcionalidade normal.

A disfunção endotelial é precursora de várias doenças humanas prevalentes, incluindo hipertensão, doença arterial coronariana, diabetes e câncer ^5,6,7. Essa condição pode se apresentar de várias maneiras, incluindo diminuição da vasodilatação, aumento da permeabilidade dos vasos e tendência a um estado pró-inflamatório. Esse estado patológico é o estágio inicial de vários problemas cardiovasculares críticos, como doença arterial coronariana, acidente vascular cerebral e doença arterial periférica⁸, que continuam a ser as principais causas de mortalidade nos Estados Unidos¹. A disfunção endotelial afeta a saúde cardiovascular, bem como a barreira hematoencefálica (BHE) e desempenha um papel importante na progressão de vários distúrbios neurológicos. A disfunção pode aumentar a permeabilidade da BHE, permitindo que toxinas, patógenos e células imunes se infiltrem no sistema nervoso central e contribuindo para distúrbios neurológicos, como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer, esclerose múltipla e infecções cerebrais⁹.

A disfunção endotelial no diabetes é marcada pelo comprometimento da capacidade do endotélio de regular o tônus vascular e produzir mediadores vasodilatadores, como o óxido nítrico, levando ao comprometimento da vasodilatação¹⁰. Essa condição é exacerbada por vias induzidas pela hiperglicemia, como a ativação da proteína quinase C e o estresse oxidativo, contribuindo significativamente para a progressão da doença vascular diabética¹¹. Além disso, descobriu-se que um ambiente inflamatório aumenta a adesão das células tumorais às células endoteliais microvasculares cerebrais, enquanto um endotélio com vazamento foi relatado como um fator importante na metástase do câncer^12,13. Descobriu-se que a geometria dos vasos sanguíneos influencia diretamente a metástase do câncer cerebral. As células tumorais se ligam preferencialmente a áreas de maior curvatura dos vasos sanguíneos⁷. Esse achado ressalta a importância da geometria vascular na metástase do câncer. Mais importante, em condições como fibrose e câncer, a função da barreira endotelial interrompida não apenas desempenha um papel no desenvolvimento da doença, mas também dificulta a eficácia do tratamento, dificultando a administração adequada do medicamento¹⁴. A pesquisa sobre permeabilidade vascular é crucial para o avanço do tratamento de doenças cardiovasculares e oferece insights sobre o gerenciamento de outras doenças que envolvem função vascular comprometida.

Dado o papel crucial da permeabilidade vascular na saúde e na doença, pesquisas consideráveis se concentraram em examinar a natureza seletiva da barreira endotelial para o desenvolvimento terapêutico usando modelos animais, juntamente com plataformas tradicionais de teste in vitro 2D e 3D. No entanto, os modelos animais apresentam limitações devido a diferenças específicas da espécie e questões éticas, além de altos custos^15,16. Por exemplo, a Pfizer, em 2004, afirmou que, nos 10 anos anteriores, gastou mais de US $ 2 bilhões em desenvolvimentos de medicamentos que mostraram efeitos promissores em modelos animais, mas acabaram falhando em estágios avançados de testes em humanos¹⁷. Além disso, os modelos 2D tradicionais não imitam com precisão a arquitetura tridimensional (3D) e a complexa estrutura geométrica dos canais vasculares.

Com os avanços nas tecnologias de biofabricação, grandes esforços têm sido direcionados para a fabricação de canais vasculares enquanto recapitulam a arquitetura 3D. Os canais vasculares em microescala podem ser efetivamente fabricados dentro de chips microfluídicos usando litografia suave, oferecendo assim uma vantagem de análise em tempo real^18,19. Métodos alternativos, como fundição de hidrogel ou envolvimento de folhas de células em torno de um molde ou mandril, podem ser usados para criar estruturas tubulares independentes com o diâmetro desejado^20,21. No entanto, esses métodos têm limitações; Por exemplo, chips microfluídicos são restritos a configurações de microcanais, e a fundição de hidrogel em torno de um molde não replica efetivamente várias geometrias.

Com o surgimento da tecnologia de bioimpressão 3D²², a replicação de geometrias complexas depositando com precisão vários materiais de hidrogel baseados em matriz extracelular (ECM) tornou-se possível^23,24. Alguns métodos de bioimpressão, como aqueles que usam bicos dispostos concentricamente, por exemplo, coaxial e triaxial^25,26, não podem criar tubos bifurcados; no entanto, estruturas complexas podem ser alcançadas com métodos de padronização sacrificial²⁷. Nenhum desses métodos de bioimpressão demonstrou permitir modelagem in vitro de alto rendimento - um requisito crucial para a pesquisa farmacológica na descoberta de medicamentos. Aqui, apresentamos um método para fabricar eficientemente canais vasculares endotelizados com controle eficiente sobre as dimensões.

Estabelecemos uma abordagem direta usando placas de seis poços disponíveis comercialmente, combinadas com um método de padronização sacrificial no qual uma bioimpressora fabrica canais vasculares de tamanhos e padrões desejados dentro de um hidrogel ECM. Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram semeadas para endotelizar esses canais e avaliar a funcionalidade do endotélio por meio de um ensaio de permeabilidade. Esse design permite a perfusão sem bombeamento, criando reservatórios de mídia em ambos os lados do canal e usa o fluxo acionado por gravidade com a ajuda de um balancim 2D comumente usado para imitar a cultura dinâmica. Essa abordagem elimina a necessidade de bombas peristálticas e facilita a escalabilidade dessa plataforma para aplicações de alto rendimento. A natureza controlada por computador da tecnologia de bioimpressão 3D também agiliza o processo de fabricação, diminuindo assim a probabilidade de erros durante a fabricação. O modelo VOP mostra-se promissor como uma ferramenta valiosa para testes farmacológicos na descoberta de medicamentos.

Protocolo

1. Geração de código G para a bioimpressora

1. Para gerar e visualizar o caminho de impressão, visite uma ferramenta de simulação de código G online (por exemplo, NCviewer).
2. Clique no ícone Novo arquivo na interface para criar um novo arquivo de código G.
3. Gere um caminho de impressão escrevendo manualmente os comandos do código G para o canal de sacrifício e a câmara de silício. Use as dimensões de uma placa padrão de seis poços como referência para criar a geometria.
   NOTA: O código G usado aqui é baseado no código de Controle Numérico Computadorizado (CNC). As funções de cada comando são fornecidas na Tabela Suplementar S1. O formato de placa de seis poços foi selecionado devido à sua compatibilidade com leitores comerciais de microplacas e configurações de microscopia e sua capacidade de acomodar volumes adequados de mídia para suportar a maturação do endotélio, minimizando assim a necessidade de trocas frequentes de mídia. Este protocolo de fabricação também pode ser adaptado para uso com outras placas de poços padrão.
4. Quando o código G estiver concluído, clique no ícone Salvar arquivo na interface para baixar o arquivo com extensão .nc.
   NOTA: Qualquer outro algoritmo de geração de código G disponível pode ser usado para gerar os caminhos de impressão. A geometria do canal vascular pode ser manipulada neste código G.

2. Preparação de tintas sacrificiais e de câmara de silício

NOTA: As fontes de todos os materiais usados neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Combine dois tipos de polímeros de silicone, SE1700 e polidimetilsiloxano (PDMS), na proporção de 10:2. Adicione o agente de cura de cada polímero na proporção de 10:1, polímero para agente de cura.
2. Use um misturador planetário para misturar e desgaseificar completamente a mistura de polímeros a 2.000 rpm.
3. Com uma espátula, transfira o polímero de silicone misturado para uma seringa descartável de 10 mL. Centrifugue a seringa carregada a 400 × g durante 3 min a 5 °C para garantir uma consistência uniforme e evitar bolhas durante a impressão.
   NOTA: A tinta da câmara deve ser usada dentro de 2 h após a adição dos agentes de cura para garantir a qualidade de impressão ideal. Conservar a seringa a 5 °C enquanto prepara para a impressão. Esse processo ajuda a retardar a cura da tinta, o que pode alterar os parâmetros de impressão.
4. Pesar o Pluronic F-127 (PF127) para preparar uma solução-mãe a 40% (p/v) de PF127 em água destilada.
5. Misturar a solução PF127 numa batedeira planetária durante 3 min a 400 × g para obter homogeneidade. Manter a mistura homogeneizada a 4 °C para a dissolução completa do PF127.
6. Prepare uma solução estoque de trombina de 1.000 unidades/mL em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
   NOTA: Armazene a solução estoque de trombina em alíquotas de 100 μL para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. As alíquotas devem ser conservadas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses.
7. Antes de imprimir, prepare a tinta sacrificial misturando trombina em uma diluição de 1:10 com PF127 até uma concentração final de trabalho de 36% (p / v) para PF127 e 100 unidades / mL para trombina. Para preparar 1 mL de tinta sacrificial, misture 100 μL de solução estoque de trombina com 900 μL de solução estoque PF127.
   NOTA: Ao preparar a tinta sacrificial para imprimir uma única placa, um volume total de 1 mL é mais do que suficiente.

3. Processo de fabricação

1. Antes de iniciar o processo de fabricação, trate uma placa de seis poços com plasma de oxigênio (O₂) a uma intensidade de 100 watts por 1 min.
2. Siga o procedimento descrito na seção 2 para preparar as tintas sacrificial e de silicone, garantindo que as tintas estejam livres de bolhas e misturadas de forma homogênea para uma impressão consistente. Coloque cuidadosamente as tintas no cabeçote de impressão da bioimpressora. Defina a temperatura da cabeça da bioimpressora para 37 °C para a tinta sacrificial e 5 °C para a tinta de silicone.
3. Conecte um bico cônico de rosca dupla de 22 G à seringa de silicone. Para a tinta sacrificial, escolha o tamanho do bico de acordo com o diâmetro do canal desejado.
   NOTA: Aqui, demonstramos três tamanhos de bicos: 18 G, 20 G e 22 G. Os parâmetros de impressão ideais, incluindo pressão de impressão e velocidade do cabeçote de impressão, são descritos na Tabela 1.
4. Carregue o código G desejado e pressione a função servo ready na interface de software da bioimpressora por 3 s. Posicione a chapa no palco no ponto inicial do código G e clique em iniciar para iniciar o processo de impressão.
   NOTA: Normalmente, a fabricação de uma placa contendo seis câmaras requer aproximadamente 1 h e 10 min. A etapa 3.4, envolvendo o carregamento e a execução do código G, está sujeita a variações dependendo da bioimpressora específica usada. Certifique-se de que as condições estéreis sejam mantidas durante o uso da bioimpressora para evitar contaminação.
5. Coloque uma tampa sobre a placa e transfira-a para uma incubadora de CO₂ umidificada a 37 °C por 72 h para curar as câmaras de silício.
   NOTA: Embora a cura do silício possa ocorrer em um ritmo mais lento dentro da incubadora, a placa não deve ser colocada dentro de um forno seco.

4. Preparação de hidrogel e incorporação de canais

1. Prepare um tubo cônico de 50 mL contendo 20 mL de 1x PBS. Coloque 0,01 g de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP) no tubo cônico para fazer uma solução LAP a 0,05% (p / v). Vortex até que o pó esteja completamente dissolvido.
   NOTA: Enrole o tubo cônico em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Conservar a solução-mãe LAP a 4 °C.
2. Adicione 3 g de metacrilato de gelatina (GelMA) e 0,2 g de fibrinogênio a 20 mL de solução LAP para atingir uma concentração final de 15% de GelMA e 1% de fibrinogênio (referido como GelFib). Colocar a mistura num banho-maria a 37 °C e periodicamente misturar em vórtice até que a solução esteja totalmente dissolvida.
3. Após a fabricação, conforme descrito na Seção 3, adicione 300 μL de GelFib pré-aquecido em cada câmara de hidrogel para incorporar o padrão de sacrifício. Reticule rapidamente o GelMA com luz ultravioleta (UV) em um comprimento de onda de 405 nm com uma intensidade de 85 mW / cm² por 120 s. Repita este procedimento para todos os outros poços.
   NOTA: O fibrinogênio se reticula rapidamente ao entrar em contato com o padrão de sacrifício contendo trombina. Recomendamos adicionar hidrogel e realizar reticulação UV individualmente para cada poço para evitar a gelificação indesejada de GelMA à temperatura ambiente. Além disso, condições estéreis devem ser mantidas para evitar contaminação durante o processo de cura UV.
4. Adicione 1 mL de DPBS a cada lado do canal vascular em cada poço e mantenha a placa a 4 °C por 15 min para liquefazer o PF127.
5. Após 15 min, aspire o DPBS e repita o passo 4.5 3x para a lavagem completa do PF127.
6. Antes de introduzir células nos canais, perfunda DMEM F12 contendo 1% de Matrigel por 30 min através dos canais para aumentar a fixação celular.

5. Cultura HUVEC

1. Pré-aqueça o meio de crescimento de células endoteliais (ECGM) em banho-maria a 37 °C por 30 min.
2. Enquanto isso, recupere um frasco de HUVECs criopreservados do tanque de nitrogênio, afrouxe suavemente a tampa do frasco e reaperte-o para liberar nitrogênio dos fios. Descongele imediatamente as células submergindo o frasco para injetáveis num banho-maria a 37 °C durante 2 min, garantindo que permanece uma pequena quantidade de gelo no interior do frasco. Enxágue o frasco com etanol a 70% para evitar contaminação.
   NOTA: Use óculos de segurança ao recuperar células do tanque de nitrogênio. A tampa do frasco para injetáveis deve ser mantida acima do nível da água durante este processo.
3. Prepare um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de ECGM pré-aquecido. Com uma micropipeta, transfira cuidadosamente as células descongeladas do frasco para o tubo cônico. Para garantir que nenhuma célula seja deixada para trás, adicione 1 mL de meio fresco pré-aquecido ao criogenial, enxágue o interior e transfira as células restantes para o tubo cônico.
4. Centrifugar o tubo cónico a 200 × g durante 3 min para obter um sedimento celular. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender as células em 10 ml de meio fresco, transferir as células para um balão T75 e colocar o balão dentro de uma incubadora de CO₂ humidificada a 37 °C.
   NOTA: Esta etapa é importante para remover o dimetilsulfóxido presente no meio de congelamento no criogênico por meio de centrifugação.
5. Atualize o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80-90% de confluência.

6. Endotelização de canais

1. Pré-aqueça ECGM, DPBS, solução neutralizadora de tripsina e ácido etilenodiaminotetracético (TE) de tripsina em banho-maria a 37 °C por 30 min.
2. A 90% de confluência, enxágue as células em um frasco T75 com 10 mL de DPBS, adicione 1 mL de TE a 0,25% ao frasco e incube-o por 3 min.
3. Bata suavemente nas laterais do frasco e adicione 5 mL de solução neutralizadora de tripsina para neutralizar o TE. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Use 5 mL de ECGM fresco para coletar as células restantes e adicioná-las ao tubo cônico.
4. Centrifugue o tubo cônico a 250 × g por 3 min para coletar o pellet da célula.
5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 1 mL de ECGM fresco. Conte as células com um hemocitômetro e repita a Etapa 6.4 para obter um pellet de células. Ressuspenda 3 milhões de células em 90 μL de ECGM fresco.
6. Antes de introduzir a suspensão celular no canal, aspire brevemente o canal a vácuo para limpar o lúmen.
   NOTA: Evite a sucção prolongada do canal para evitar danos à sua integridade.
7. Carregue suavemente o canal com uma suspensão de células a uma densidade de semeadura de 0,5 milhão de células por poço. Use uma micropipeta para adicionar ~ 15 μL desta suspensão para preencher o canal.
   NOTA: A densidade de semeadura pode variar dependendo do tamanho do canal. Essa densidade é otimizada para um canal impresso com um bico de 20 G e um diâmetro interno de aproximadamente 900 μm.
8. Coloque a placa dentro da incubadora por 2 h. Em seguida, inverter a placa a 180°, mantendo-a em posição plana durante as 2 h seguintes.
9. Após 4 h, lave o canal com DPBS para remover as células não aderentes e mortas. Adicione 2 mL de ECGM fresco a cada poço (1 mL de cada lado do canal). Inicie a cultura dinâmica em um balancim em um ângulo de inclinação de 10° e 5 rpm posicionando a placa no balancim com os canais paralelos à direção do balanço. Atualize o meio de crescimento a cada dois dias.
   NOTA: A cultura dinâmica aumenta a troca de meio entre os reservatórios e canais e ajuda as células a proliferar durante a noite.

7. Avaliação da maturação do endotélio

1. Pré-aqueça ECGM e DPBS em banho-maria a 37 °C por 30 min e reagente do Kit de Contagem de Células-8 (CCK8) à temperatura ambiente.
2. Faça uma solução de trabalho de CCK8 misturando 100 μL de reagente CCK8 com 1 mL de ECGM fresco para cada poço. Enquanto trabalha para uma placa/6 canais, prepare 600 μL de reagente CCK8 combinando-o com 6 mL de ECGM fresco.
3. Remova o meio de crescimento por sucção e enxágue os canais com DPBS. Adicione 1 mL de solução de trabalho CCK8 a cada poço e deixe a placa permanecer plana dentro da incubadora por 30 min. Depois, inicie a cultura dinâmica em um rocker conforme descrito na etapa 6.9 e continue esse processo pelas próximas 3 h.
4. Após 3 h, remova o conteúdo de cada poço inclinando a placa para um lado e transfira-o para uma nova placa de seis poços. Enxágue os canais com DPBS e adicione meio fresco.
   NOTA: Cubra a placa com papel alumínio até a medição da absorbância. Mantenha um volume de reagente consistente em todos os poços para garantir leituras uniformes. Durante a pipetagem, evite cuidadosamente a introdução de bolhas de ar, que podem atrapalhar a precisão das leituras de densidade óptica.
5. Depois de agitar suavemente a placa por 15 s para garantir uma mistura uniforme das cores, use um leitor de microplacas para medir a absorbância a 450 nm.
6. Repita este procedimento em intervalos de tempo predefinidos. Calcule a densidade óptica média para cada ponto no tempo e trace uma curva de crescimento no software gráfico. Essa curva indica a maturação relativa do endotélio ao longo do tempo.

8. Ensaio de permeabilidade

1. Remova o meio de um poço de interesse.
   NOTA: Para o ensaio de permeabilidade, recomenda-se o processamento de cada poço separadamente para evitar que outros canais sequem, o que pode alterar sua permeabilidade vascular.
2. Prepare 6 mL de solução de 0,1 mg / mL de dextrano conjugado com FITC dissolvendo 70 kDa de dextrano FITC em DPBS.
   NOTA: Prepare uma solução estoque de 20 mg / mL de dextrano FITC dissolvendo 100 mg de dextrano FITC em 5 mL de DPBS. Depois de agitar suavemente a solução, alíquota de 500 μL em tubos de 1,5 mL para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Estas alíquotas podem ser conservadas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses. Antes de realizar o ensaio, dilua a solução estoque a uma concentração de trabalho de 0,1 mg / mL.
3. Posicione a placa firmemente na platina do microscópio e ajuste a ampliação da objetiva no modo de contraste de fase para garantir uma visibilidade clara da parede do canal na região de interesse, juntamente com o gel localizado nas proximidades, dentro do campo de visão.
   NOTA: Para uma avaliação eficaz da permeabilidade, tente maximizar a área do gel ao redor da região de interesse no campo de visão; Este aspecto é fundamental para o monitoramento preciso do transporte de dextrano.
4. Depois de focar na área desejada, mude do contraste de fase para o modo de fluorescência. Na guia de aquisição de imagem , adicione FITC ao canal de campo amplo e adquira uma imagem antes de adicionar a solução de dextrana, para calcular a intensidade de fluorescência de fundo. Em seguida, adicione 1 mL de solução de trabalho de dextrana FITC em um lado do canal e deixe a solução fluir em direção ao outro lado do poço, impulsionada pela diferença de pressão hidrostática.
5. Adquira imagens em intervalos de tempo predeterminados - com mais frequência para canais com alta permeabilidade e com menos frequência para aqueles com menor permeabilidade.

9. Medição da intensidade de fluorescência no ImageJ

1. No software de análise de imagem ImageJ, meça a intensidade no ponto de tempo inicial (I_{t1), a} intensidade média observada no ponto de tempo posterior (I_t2) e a intensidade devido ao ruído de fundo (I_b), conforme descrito abaixo. Utilizar a equação (1) para calcular o coeficiente de permeabilidade (P_d). t₁ e t₂ referem-se aos pontos de tempo iniciais e posteriores de aquisição da imagem.
   Características (1)
   1. Inicie o ImageJ e abra a imagem adquirida no ponto de tempo inicial.
   2. Defina a escala em ImageJ. Navegue até Analisar | Definir escala. Insira a escala e a unidade de medida conhecidas.
   3. Selecione a ferramenta retângulo e desenhe um retângulo sobre a área do gel onde a medição da intensidade de fluorescência é necessária.
   4. Navegue até Analisar | Defina Medidas e certifique-se de que o valor médio de cinza esteja marcado.
      NOTA: Esta opção mede a intensidade média dentro da área selecionada. Outros parâmetros podem ser selecionados conforme necessário para a análise fornecida.
   5. Com a área ainda selecionada, navegue até Analisar | Meça ou simplesmente pressione M. Aguarde a abertura de uma janela de resultados , mostrando a intensidade média de fluorescência e quaisquer outros parâmetros selecionados.
   6. Faça três medições e calcule o valor médio da intensidade de fluorescência em uma planilha.
   7. Repita este procedimento para as imagens capturadas no ponto de tempo subsequente t₂, bem como aquelas tiradas antes da adição da solução de dextrano para o cálculo da intensidade de fluorescência no ponto de tempo posterior, para determinar a fluorescência de fundo.

Resultados

A plataforma VOP, com flexibilidade de tamanho e padrão, foi fabricada com um sistema de bioimpressão de várias cabeças. Canais, ocos e capazes de perfusão, foram semeados com HUVECs para facilitar a endotelização e foram posteriormente avaliados com um ensaio de permeabilidade (Figura 1A). Para demonstrar a capacidade de fabricação multiescala desse método, imprimimos três configurações distintas: reta, bifurcada e complicada (Figura 1B). Por meio de uma abordagem de fabricação direta, seis canais vasculares ocos e perfusáveis embutidos em uma matriz de hidrogel podem ser produzidos dentro de uma placa padrão de seis poços. Esses canais podem então ser endotelizados com HUVECs (Figura 2A). As células rapidamente se ligam e proliferam para cobrir a superfície luminal do canal vascular (Figura 2B). As células aderidas às superfícies luminais inferior e superior exibem uma distribuição uniforme dentro do lúmen (Figura Suplementar S1).

A placa foi colocada em uma incubadora umidificada por 3 dias para permitir a cura da tinta de silicone, garantindo que o padrão de sacrifício permanecesse livre de dessecação (Figura 3A). Para avaliar o fluxo através desses canais, microesferas verdes foram introduzidas, demonstrando que os canais são efetivamente perfusíveis (Vídeo Suplementar S1). O diâmetro dos canais foi variado de 558 ± 38 μm a 1094 ± 45 μm, alterando o tamanho do bico de 22 G para 18 G durante a impressão do padrão de sacrifício. Além disso, a configuração geométrica dos canais foi manipulada pela modificação do código G da bioimpressora (Arquivo Suplementar 1) para permitir a impressão de padrões complicados e bifurcados (Figura 3B).

A duração da reticulação com UV foi otimizada para 120 s, o que suporta a proliferação celular efetiva (Figura Suplementar S2). Essa duração de reticulação resultou em um ambiente fisiologicamente mais relevante que promove a proliferação de células endoteliais, provavelmente devido às propriedades mecânicas equilibradas e porosidade do hidrogel, facilitando uma melhor fixação celular e subsequente proliferação. Os HUVECs proliferaram efetivamente na superfície luminal e mostraram uma morfologia semelhante a paralelepípedos no dia 5 após a semeadura. A maturação do endotélio foi avaliada com o ensaio CCK8 realizado nos dias 1, 3 e 5 (Figura 4A,B). A maturação do endotélio foi verificada por imunomarcação para CD31 5 dias após a semeadura celular, que demonstrou a localização de CD31 nas junções apertadas (Figura 4D).

Para avaliar a função de barreira do endotélio, perfundimos uma solução de dextrana 70 kDa através dos canais no dia 5 de maturação. Para comparação, foi selecionado um canal de controle sem endotélio (nu). O canal endotelizado exibiu mudanças mínimas na fluorescência dentro da região do gel perivascular ao longo do tempo, sugerindo assim que o endotélio manteve efetivamente sua função de barreira. No entanto, os canais nus exibiram um aumento da fluorescência na região perivascular do gel, indicando maior permeabilidade devido à ausência de endotélio (Figura 4C e Figura 4E).

Figura 1: Preparação de canais vasculares impressos e suas configurações. (A) Esquema de fabricação, endotelização e ensaio de permeabilidade de canais vasculares impressos. (B) Esquema das três configurações demonstradas neste método: reta, bifurcada e complicada. Abreviatura: VOPs = vasos em um prato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Linha do tempo de fabricação para impressão do padrão de sacrifício e da câmara de silício, bem como a endotelização do canal vascular. (A) A ilustração representa um único poço da placa do poço e AA' refere-se à vista ao longo do plano da seção transversal. (B) Imagens representativas das etapas envolvidas no processo de fabricação. Barras de escala = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abreviaturas: GelFib = 15% de metacrilato de gelatina e 1% de fibrinogênio em solução de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio a 0,05% p/v; HUVECs = Células endoteliais da veia umbilical humana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Vasos em uma placa. (A) Imagem bruta de vasos em uma placa após a impressão do padrão de sacrifício e da câmara de silício. (B) Demonstração de fabricação multiescala de canais vasculares com uma variedade de configurações e tamanhos, perfundidos com microesferas verdes. Barras de escala = 200 μm (canais retos), 1.000 μm (canais contorcidos e bifurcados). Abreviaturas: ID = diâmetro interno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Canais vasculares e sua maturação e permeabilidade endotelial. (A) Imagens microscópicas de fluorescência dos canais vasculares nos dias 1, 3 e 5 após a semeadura com HUVECs marcados com proteína fluorescente verde, mostrando a proliferação e morfologia de paralelepípedos de HUVECs no dia 5. (B) A maturação endotelial foi avaliada com o ensaio CCK-8 nos dias 1, 3 e 5 após a semeadura celular. (C) Ensaio de permeabilidade dos canais vasculares endotelizados (endotélio +) e nus (endotélio -). (D) Imagens representativas da coloração de CD31 ilustram a localização de CD31 em junções apertadas no dia 5. (E) Quantificação da permeabilidade difusional. Barras de escala = 200 μm (A, C, D). Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliais da veia umbilical humana; GFP = proteína fluorescente verde; GFP HUVECs = HUVECs marcados com GFP; CCK-8 = kit de contagem de células 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tinta de impressão	Parâmetros de impressão
	Calibre do bocal	Temperatura (°C)	Pressão do ar (kPa)	Velocidade da cabeça (mm/min)
Tinta sacrificial	18	37	40-48	200
	20
	22
Tinta de silicone	22	5	100

Tabela 1: Parâmetros de impressão para as tintas sacrificiais e de silicone.

Arquivo suplementar 1: script G-Code contendo os comandos para impressão 3D do padrão de sacrifício e da câmara de silício dentro de uma placa de seis poços. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S1: Imagens representativas da superfície luminal inferior e superior após a semeadura celular mostrando a fixação de GFP-HUVEC nos planos focais inferior e superior. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: UU' = plano focal superior; LL' = plano focal inferior. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2: Proliferação de GFP-HUVEC sob diferentes durações de reticulação com UV (405 nm). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliais da veia umbilical humana; GFP = proteína fluorescente verde; GFP HUVECs = HUVECs marcados com GFP. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar S1: Perfusão com microesferas verdes mostrando a perfusão efetiva através dos canais retos, contorcidos e bifurcados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S1: Funções dos comandos G-code e M-code. NOTA: No código G, X, Y e Z indicam as coordenadas de movimento ao longo dos eixos X, Y e Z, respectivamente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aproveitando a precisão, automação e natureza controlada por computador da tecnologia de bioimpressão 3D, estabelecemos um método simplificado para fabricar canais vasculares em placas padrão de seis poços, que foram escolhidas por sua compatibilidade com leitores comerciais de microplacas e configurações de imagens microscópicas. O design da placa pode acomodar canais de vários tamanhos e um volume suficiente de mídia para o crescimento de canais maiores, diminuindo a frequência necessária de mudanças de mídia. Adaptações futuras desse projeto podem ser adaptadas a outras placas de poços padrão disponíveis comercialmente, aumentando assim o rendimento experimental e diminuindo o uso de materiais.

As plataformas microfluídicas costumam usar um polímero de silicone chamado PDMS devido à sua não toxicidade, permeabilidade a gases e alta transparência²⁸. No entanto, a baixa fidelidade de forma do PDMS limita seu uso em bioimpressão baseada em microextrusão para fabricação de chips com alta fidelidade de forma. O SE1700²⁹, outro polímero de silicone, oferece maior precisão na construção de câmaras para fabricação de tecidos, mas sua alta viscosidade requer bicos maiores e pressão pneumática substancial. Formulamos uma mistura de SE1700 e PDMS que pode ser usada com bicos menores, permitindo assim a fabricação em áreas confinadas com alta precisão e fidelidade de forma. Outros tipos de polímeros, como a Policaprolactona (PCL) ou o Polietileno Acetato de Vinila (PEVA), também podem ser empregados para impressão em câmara devido à sua alta fidelidade^{de forma 30}.

A transparência óptica do GelMA também é crucial³¹. Em contraste com outros hidrogéis à base de ECM - como o colágeno, que se torna opaco após a reticulação - o GelMA mantém a transparência, permitindo assim a análise celular em tempo real dentro dos canais, mesmo quando o tamanho do canal aumenta. Esse aspecto oferece uma grande vantagem sobre os métodos que requerem seções finas para observação quando o tamanho do construto é aumentado³². A biodegradabilidade do GelMA facilita a substituição do andaime ECM por tecido novo e funcional à medida que se desintegra, fornecendo assim o espaço necessário para o crescimento do tecido funcional recém-formado ^33,34. Além disso, sua comprovada baixa citotoxicidade o torna altamente adequado para aplicações de engenharia de tecidos^35,36. As excelentes características mecânicas do GelMA o tornam um bom candidato para aplicações em engenharia de tecidos vasculares³⁷. Sua eficácia em facilitar a endotelização de condutos vasculares com HUVECs tem sido bem documentada³⁸.

As células utilizadas para endotelização neste estudo, HUVECs, exibem uma alta taxa de sucesso de isolamento e são um modelo excepcional para examinar uma ampla gama de doenças cardiovasculares e metabólicas³⁹. No entanto, essa abordagem pode ser adaptada para acomodar diferentes tipos de células endoteliais, incluindo aquelas derivadas de artérias ou diretamente de pacientes. Essa adaptabilidade permite a criação de modelos de tecido vascular específicos do paciente, facilitando a avaliação das respostas individuais a medicamentos específicos.

Este protocolo tem algumas etapas críticas para os leitores terem em mente. Primeiro, o tratamento com plasma é fundamental para modificar as características da superfície da placa, especificamente para aumentar a hidrofilicidade, porque a maioria das placas de poços comerciais são hidrofóbicas. O tratamento com plasma introduz grupos funcionais polares na superfície, melhorando assim a capacidade de ligação com a câmara de silício e o hidrogel. Em segundo lugar, o controle de temperatura é crucial porque a tinta sacrificial se liquefaz em temperaturas mais baixas, e a tinta de silicone requer temperaturas mais baixas para evitar a cura prematura, o que pode impedir a extrusão da tinta através do bico. Em terceiro lugar, a remoção completa de todos os vestígios de PF127 é crucial porque qualquer PF127 residual pode afetar adversamente os processos celulares, como interferir na adesão celular⁴⁰. Quarto, durante a cultura de células, se as células crescerem até uma confluência superior a 90%, elas podem sofrer estresse devido à competição por espaço e nutrientes. Esse estresse pode resultar em comportamento celular alterado, diminuição da viabilidade celular e modificações no microambiente celular. Para manter a saúde celular e a proliferação adequada, recomenda-se manter as culturas abaixo de 90% de confluência. Quinto, é importante manter a placa plana dentro da incubadora antes e depois da inversão para obter adesão celular uniforme dentro do canal e, finalmente, endotelização uniforme. Finalmente, manter o tempo de exposição consistente, a intensidade do laser de excitação e o foco do microscópio é crucial durante a aquisição da imagem, porque variações nesses parâmetros podem alterar a intensidade do sinal de emissão, afetando potencialmente a precisão dos resultados.

Nossa abordagem permite a criação de canais em múltiplas configurações, como os padrões retos, bifurcados e complicados aqui demonstrados. Essa adaptabilidade é essencial para replicar as diversas geometrias da rede vascular no corpo humano e supera as capacidades dos métodos tradicionais, como a fundição de hidrogel em torno de um molde ou as técnicas de bioimpressão baseadas em bicos concêntricos usadas para estruturas semelhantes a tubos 30,41,42. No entanto, uma limitação desse método é que ele não garante a circularidade dos canais porque o padrão de sacrifício é disposto em uma superfície plana.

A vantagem de construir canais em vários tamanhos é fundamental para superar as limitações das plataformas microfluídicas, que muitas vezes são restritas a microcanais. Essa restrição pode ser uma desvantagem nos ensaios bioquímicos convencionais. Por exemplo, para obter material suficiente para ensaios de expressão de proteínas padrão, como western blotting, as saídas de vários dispositivos microfluídicos devem ser combinadas. Além disso, quando canais ocos são criados, o hidrogel deve manter rigidez suficiente para suportar o processo de remoção da agulha. Nossa abordagem utiliza um material de sacrifício termorreversível, que se torna líquido quando a temperatura é diminuída, facilitando assim esse processo sem prejudicar a integridade do gel. Além disso, outros materiais gelificantes termorreversíveis, como a gelatina⁴³, também podem ser utilizados como materiais de sacrifício neste método.

Essa abordagem permite a fácil personalização das estruturas teciduais na placa, fornecendo assim uma ferramenta promissora para testes farmacológicos na descoberta de medicamentos. Este método pode facilitar a triagem de medicamentos, avaliando seus efeitos na permeabilidade vascular - um fator chave no desenvolvimento de terapias para doenças associadas à disfunção vascular. Nosso modelo pode ser usado para estudar a permeabilidade vascular sob condições específicas, como inflamação, e para desenvolver estratégias de normalização vascular, o que é relevante para o tratamento de várias doenças que envolvem permeabilidade vascular anormal⁴⁴, avançando na compreensão desse processo e desenvolvendo potenciais aplicações clínicas⁴⁵.

Para avaliar a permeabilidade vascular, perfundimos 70 kDa dextrana através do canal vascular. Normalmente, um endotélio vascular saudável serve como uma barreira eficaz para moléculas de dextrana desse peso molecular⁴⁶. No entanto, na presença de inflamação, ocorre ruptura das junções apertadas, permitindo que essas moléculas vazem, aumentando a permeabilidade vascular³⁰. Além disso, o dextrano marcado com fluorescência é utilizado para avaliar a distribuição de medicamentos em tecidos modificados⁴⁷. Embora o fluxo bidirecional e a dinâmica de transbordamento de controle limitado dentro do canal sejam limitações deste modelo, prevemos que os usuários finais poderão adaptar o sistema de acordo com seus requisitos usando balancins personalizados para controlar a dinâmica do fluxo dentro dos canais. Essa adaptação pode incluir a implementação de fluxo unidirecional sem bomba⁴⁸.

No futuro, esse método de fabricação pode ser ampliado para construir tecidos complexos. Ao posicionar com precisão outros tipos de células perto de canais vasculares, tecidos vascularizados perfusíveis podem ser criados, superando assim um grande desafio na bioimpressão de tecidos volumétricos. Também acreditamos que esse método pode ser adaptado para simular outros tipos de tecidos ocos e perfusíveis, como vasos linfáticos e intestinos, de maneira de alto rendimento para uma variedade de aplicações biomédicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipeta Sorológica de 10 mL	SPL SPL	91010
Seringa de 10 mL	Shinchang Medical
15 mL	SPL	50015
3D Bioprinter	T & R Biofab	3DX-Printer
Placa de 6 poços	SPL	37206
Armários de Segurança Biológica	CHC LAB	PCHC-777A2-04,
Microscópios invertidos de campo claro Kit de	Leica	DMi1
(CCK8)	GlpBio	GK10001
Kit de contagem de células (CCK8)	de cultura de células	GlpBio
75T	SPL	70075
Matriz de membrana basal reduzida do fator de crescimento (GFR) Corning Matrigel, sem LDEV, 10 mL	Corning	354230
			destilada
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO, Grau de Cultura de Células	Sigma aldrich	D2438
Dow-Corning, Kit PDMS-Sylgard 184a	DOW	DC-184
DOWSIL SE 1700 Transparente W/C 1.1 KG Kit	DOW	2924404
D-PBS - 1x	Welgene	LB001-01
Meio de Crescimento de Células Endoteliais MV 2 (Pronto para usar)	Promocell	C-22022
Eppendorf Micro pipeta(1000,200,100,20,10)	eppendorf
Ethyl Alcohol 99.9%	Duksan	D5
Excel	Microsoft
Fibrinogênio de plasma bovino	Sigma Aldrich	F8630-1G
FITC Dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F
Esferas fluorescentes (1.0 μ m, verde)	Sigma Aldrich	L1030-1ML
GelMA-pó (Gelatina metacrilato) 50 g	Materiais 3D	20JT29
Gibco, meio de congelamento de cultura de células de recuperação, 50 mL	Gibco
HUVECs (células endoteliais da veia umbilical humana)	Promocell
ImageJ software	NIH
Incubadora	Thermo SCIENTIFIC	Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubadora
Invitrogen, Kit de viabilidade/citotoxicidade vivo/morto (para células de mamíferos)	Thermo Fisher	L3224
Lítio Fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfato em pó	Tokoyo Indústria Química CO.	85073-19-4
Marienfeld Superior, tampa da câmara de contagem	Marienfeld Superior
Marienfeld Superior, hemocitômetro, câmara de contagem de células	Marienfeld Superior	HSU-0650030
Microcentrífuga	eppendorf	Centrífuga 5920 R
NCViewer.com
Tanque de nitrogênio	WORTHINGTON INDUSTRIES	LS750
Omnicure UV Laser	EXCELITAS	SERIES 1500
Parafilm M	amcor	PM-996
Solução de Penicilina-Estreptomicina (100x)	GenDEPOT	CA005-010
Misturador Planetário	THINKY CORPORATION, japão	ARE-310
Máquina de tratamento de plasma	FEMTO SCIENCE	CUTE-1MPR
Amortecedor	aldrich	P2443-250G
, (P2007-1) 10x PBS	Biosesang	PR4007-100-00
Armário de armazenamento de reagentes	ZIO FILTER TECH	SC2-30F-1306D1-BC
Microscópio de imagem de células vivas em tempo real	Carl ZEISS
Geladeira	SAMSUNG	RT50K6035SL
ROCKER 2D digital	IKA	4003000
Scoop-Spatula	CachePor	SL-SCO7001-EA
sigma, Tripsina-EDTA solition, 0,25%	Sigma aldrich	T4049-100ML
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)	Thermo Fisher scientific	151-21-3
Seringa Barril Ponta Cap	FISNAR	3051806
Tally	Counter Control Company	C23-147-050
Bico cônico (18 G)	Mushashi	TPND-18G-U
Bico cônico (22 G)	Mushashi	TPND-22G-U
Bico cônico 20 G	Musashi	TPND-20G-U
Trombina de plasma bovino	Sigma Aldrich	T7326-1KU
Temporizador, 4 canais	ETL	SL. Tim3005
Trypan Blue Solution 0,4%	Gibco	15250061
Solução Neutralizante de Tripsina	Promocell	C-41120
UG 24 mL UG frasco de pomada	Yamayu	No. 3-53
UG 58 mL UG frasco de pomada	Yamayu	No. 3-55
Banho-maria	DAIHAN Scientific	WB-11
Máquina de peso	Sartorius	bce2241-1skr