Quantificando a densidade microvascular pulmonar em camundongos através de lóbulos

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo simples e econômico para realizar a quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar para tecido pulmonar de camundongos inteiros usando coloração única de Isolectina B₄.

Resumo

A alternância anormal da angiogênese pulmonar está relacionada à disfunção microvascular pulmonar e está profundamente ligada à integridade da parede vascular, regulação do fluxo sanguíneo e troca gasosa. Em modelos murinos, os lobos pulmonares exibem diferenças significativas de tamanho, forma, localização e vascularização, mas os métodos existentes não levam em consideração essas variações ao quantificar a densidade microvascular. Essa limitação dificulta o estudo abrangente da disfunção microvascular pulmonar e o potencial remodelamento da circulação microvasculatura em diferentes lóbulos. Nosso protocolo aborda essa lacuna empregando dois métodos de seccionamento para quantificar as alterações da densidade microvascular pulmonar, aproveitando o tamanho, a forma e a distribuição dos ramos das vias aéreas em lobos distintos em camundongos. Em seguida, utilizamos a coloração com isolectina B₄ (IB₄) para marcar células endoteliais microvasculares pulmonares em diferentes fatias, seguida de análise imparcial da densidade microvascular usando o software ImageJ disponível gratuitamente. Os resultados apresentados aqui destacam vários graus de alterações na densidade microvascular nos lóbulos pulmonares com o envelhecimento, comparando camundongos jovens e velhos. Este protocolo oferece uma abordagem direta e econômica para quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar, facilitando a pesquisa sobre aspectos fisiológicos e patológicos da microvasculatura pulmonar.

Introdução

As células endoteliais (CEs) são um tipo especial de célula localizada no revestimento interno dos vasos sanguíneos, cobrindo toda a árvore arterial e venosa e desempenhando um papel crucial na manutenção da estabilidade dos vasos sanguíneos e órgãos¹. Os pulmões são órgãos altamente vascularizados e desempenham papéis fisiológicos e patológicos essenciais nos pulmões, como formar a parede vascular, regular o fluxo sanguíneo, facilitar as trocas gasosas, modular as respostas inflamatórias, controlar a atividade plaquetária, secretar substâncias reguladoras envolvidas no crescimento vascula....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados seguindo as diretrizes éticas do Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Sichuan (No K2023023).

1. Preparação de seções de parafina para lobos pulmonares de camundongos

1. Adquira tecido pulmonar do camundongo.
   1. Escolha camundongos C57Bl/6 machos com 6 semanas e 16 meses para avaliar a densidade microvascular em pulmões de camundongos em diferentes faixas etárias.
   2. Administrar 100 mg/kg de pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal em camundongos. Eutanásia dos camundongos por luxação cervical após anestesia. Abra a ca....

Resultados

Para distinguir entre as lesões nos brônquios principais e nos ramos das pequenas vias aéreas, é fundamental garantir que a estrutura contínua das lesões nesses dois tipos de vias aéreas seja observada. Isso pode ser alcançado seguindo os procedimentos de corte e incorporação descritos na Figura 1. Dados os numerosos lobos pulmonares em camundongos, que são orientados em várias direções e possuem uma estrutura semelhante a uma malha, eles são mais suscetíveis ao colapso em comparação com out.......

Discussão

O estudo da densidade microvascular pulmonar tem implicações significativas para a compreensão dos processos fisiológicos pulmonares e também para a definição de biomarcadores(es) para doenças respiratórias. A circulação pulmonar possui uma extensa área de superfície capilar envolvida por uma fina camada de células endoteliais. A justaposição harmoniosa dessas células e células epiteliais alveolares dá origem a uma frágil membrana alvéolo-capilar projetada especificamente para facilitar .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4% Paraformaldeído	Biosharp	BL539A	Fixador de Tecido
4', 6-diamidino-2-fenilindol	MCE	HY-D0814	Corantes Nucleicos
Alexa-647 Fluor Conjugado Isolectina B4	Thermo	I32450	Microvasos de Ligação
Anti-fluorescente Tablet Selador	Abcam	AB104135	Fixação de Amostra
Fluido de Reparo de Antígeno	Biosharp	BL151A	Reparo de Locais Antigênicos
de Biópsia	ActivFlo	39LC-500-1	Fixação e Posicionamento de Amostras de Tecido
Albumina de Soro Bovino	Sigma	B2064-50G	Solução
de Vedação Placa Fria	Leica	HistoCore Arcadia H	Congelamento de amostras
Forno de secagem elétrico de temperatura constante	Taisite	101-0AB
de micrótomo descartável	Leica	14035838383	amostras de tecido de corte para preparar seções
Moldes de incorporação Shitai		26155166627	fixação de amostras de tecido
Etanol	Kelong	CAS 64-17-5	Solução de desidratação de tecido
Parafina aquecida Estação de Incorporação	Leica	EG1150	Incorporação de Amostras de Tssue em Banho-maria de Parafina
HistoCore	Leica	HI1220	Achatar e Fixar Amostras de Tecido
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Ferramenta Quantitativa
Canetas de Imuno-Histoquímica	Biosharp	BC004	Agente Bloqueador de Água
Fórceps Médico	Shanghai Equipamento Médico N	/ A	Apreensão, Manipulação ou Movimentação de amostras de tecido
Microscópio	Nikon	Ts2	Dispositivo de imagem
Mídia de montagem	Jiangyuan	Insípido	Fixação e preservação Cera
parafina	SCHLEDEN	80200-0014	de fixação de seções de tecido
PBS	Beyotime	C0221A	tampão de lavagem
Pentobarbital Sódio	Pequim Reagente químico Empresa	Q/H82-F158-2002	Micrótomo rotativo anestésico
	Biobase	Bk-2258	Preparando
fatias Tesoura estéril	Shanghai Medical Equipamento	N/A	segmentação Amostras de Tecido
Bisturi Cirúrgico	Shanghai Medical Equipment	N/A	Amostras de Tecido de Corte
Tritão	Solarbio	T8200	Solução de Permeabilização
Corrediça Sem Lavagem	PLATINUM PRO	PRO-04 Amostras de	Fixação para Coloração
de Xileno	SUM	XK13-011-00031	Solução de Desparafinação de Tecidos