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Artigo de método

MiR-15a exossômico derivado de lágrimas como nova ferramenta diagnóstica para retinopatia diabética

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DOI:

10.3791/66687

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30 de dezembro de 2025

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1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para a coleta e detecção do miR-15a a partir de rupturas como uma nova ferramenta diagnóstica para retinopatia diabética.

Resumo

A retinopatia diabética (RD) é uma complicação importante do diabetes mellitus, afetando uma porcentagem significativa da população diabética. O diagnóstico e a intervenção precoces são fundamentais para prevenir a perda irreversível de visão. Os métodos diagnósticos atuais, embora eficazes, têm limitações. O miRNA, um pequeno RNA não codificante que inibe a estabilidade e/ou a tradução de um mRNA ao se ligar às regiões 3'-não traduzidas (3'-UTRs) dos mRNAs alvo, tem sido cada vez mais reconhecido como significativamente associado ao diabetes e pode ser obtido por rasgos. Este estudo investigou o potencial do miR-15a exossomal derivado do líquido lacrimal como um novo marcador diagnóstico para DR. Amostras lacrimais foram obtidas de 135 pacientes diabéticos (36 com retinopatia diabética [DR] e 50 sem DR) e 49 controles saudáveis. Os exossomos foram isolados, e os níveis de expressão do miR-15a exossômico foram medidos usando PCR digital por gotículas (ddPCR). Os resultados mostraram que a expressão exossômica de miR-15a foi alterada em pacientes diabéticos e com DR em comparação com indivíduos saudáveis. Esses achados indicam que o miR-15a exossômico, derivado do fluido lacrimal, pode desempenhar um papel nos mecanismos moleculares subjacentes ao diabetes e suas complicações. Além disso, possui potencial como um biomarcador diagnóstico não invasivo e confiável para retinopatia diabética, oferecendo alta sensibilidade e especificidade.

Introdução

A retinopatia diabética (DR) é uma das complicações microvasculares mais proeminentes do diabetes, ameaçando a visão de milhões ao redor do mundo. A prevalência global de DR com base nos dados populacionais do IDP Atlas 2019 foi estimada em 22,7% de toda a população diabética mundial, com o número de novos casos aumentando continuamente, especialmente em países desenvolvidos eem desenvolvimento. Clinicamente, a DR é caracterizada por DR em estágio inicial ou retinopatia diabética não proliferativa (NPDR), DR em estágio avançado ou retinopatia diabética proliferativa (RDP), e presença de edema macular. Aumento da permeabilidade vascular e obstrução capilar são duas alterações patológicas comuns observadas na NPDR, e neovascularização anormal da íris, mácula, disco óptico ou retina é observada no caso daPDR 2,3. A progressão para PDR, que pode resultar em hemorragia vítrea e descolamento de retina, pode causar comprometimento visualsignificativo 3. Em todos os casos, alterações patológicas podem ser detectadas por meio de exame de funduscopia ou fotografia do fundo de fundo por oftalmologistastreinados 4. Usando o método padrão da fotografia do fundo do olho, a retinopatia diabética pode ser detectada com 78%-96% de sensibilidade e 86%-97% deespecificidade 5. No entanto, esse método só detecta quando ocorreu dano à retina. Há uma necessidade não atendida de detecção precoce da DR antes do aparecimento de sinais retinianos clinicamente visíveis, como hemorragias retinianas por blot, microaneurismas, exsudatos e proliferação de novos vasos.

O avanço das ferramentas moleculares levou à descoberta de exossomos como uma potencial ferramenta diagnóstica para várias doenças, incluindo câncer e doençascardiovasculares 6,7. Exossomos são partículas de tamanho nanodimensional ligadas por uma membrana de bicamada lipídica secretada pela maioria das células em seu espaço de vesícula extracelular (EV). Esses exossomos podem ser transportados por biofluidos como sangue, lágrimas, saliva e urina, tornando-os facilmente acessíveis para procedimentos diagnósticos não invasivos ou minimamenteinvasivos. Eles carregam vários marcadores celulares de origem, incluindo proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. De particular interesse são pequenos RNAs não codificantes transportados dentro dos EVs. Embora esses RNAs não sejam codificados para proteínas, eles desempenham papéis fundamentais na regulação gênica e têm sido implicados em muitos processos fisiológicos e patológicos, incluindo nas células β pancreáticas, que são altamente importantes no desenvolvimento dodiabetes 9,10.

Especificamente, foi demonstrado que o miR-15a tem uma forte associação com o desenvolvimento do diabetes, principalmente por meio da regulação da produção de insulina e das funções das células betapancreáticas 11. Nosso grupo demonstrou recentemente que o miR-15a está alterado no plasma da retinopatia diabética. Além disso, também foi demonstrado que o miR-15a é secretado pelas células beta pancreáticas, e viaja pela corrente sanguínea até aretina 12. O fluido lacrimal é considerado um fluido facilmente acessível, facilmente obtido do olho de forma não invasiva e econômica13. Ele contém uma mistura de várias proteínas, lipídios, eletrólitos e outras moléculas, que reflete o estado fisiológico da superfície ocular e dos tecidos ao redor, incluindo aretina 14. Um número maior de miRNAs foi detectado no fluido lacrimal do que na solução sérica e aquosado humor 15,16. A composição da lágrima muda em resposta a várias condições sistêmicas, incluindodiabetes 17. De fato, a análise do líquido lacrimal demonstrou ter um potencial promissor para monitoramento e diagnóstico de outras doenças não relacionadas aos olhos, como esclerose múltipla e câncer de mama18,19. Com a ligação direta da retinopatia diabética ao olho, seria mais relevante buscar potenciais propriedades diagnósticas do fluido lacrimal nessa doença. Os níveis de IL-1RA, IL-8, IL-6 e TNF-α nos fluidos lacrimais de pacientes com retinopatia diabética foram observados em alterações, que também variam de acordo com a gravidade dadoença 20,21. Comparado ao exame tradicional de funduscopia, a análise do líquido lacrimal para retinopatia diabética oferece vantagens potenciais em termos de acessibilidade, não invasividade e especificidade, permitindo a detecção precoce antes do início dadoença 22.

Portanto, o principal objetivo deste estudo é investigar o potencial do miR-15a exossômico derivado do líquido lacrimal como um novo marcador diagnóstico para retinopatia diabética por meio do isolamento e quantificação de miRNA a partir de fluidos lacrimais da população diabética com retinopatia. Com isso, haveria um novo método de detecção para retinopatia diabética por meio de triagem de líquido lacrimal, que pode ser detectado mesmo antes do início das complicações retinianas, permitindo medidas preventivas ou terapêuticas precoces.

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Protocolo

O estudo foi conduzido com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Médica do Centro Médico da Universidade da Malásia (Número de referência: 20165-2446). O consentimento por escrito foi obtido de todos os sujeitos humanos antes do recrutamento. Um total de 135 participantes foi incluído entre os pacientes que frequentavam a clínica de oftalmologia do Centro Médico da Universidade da Malásia (UMMC), em Kuala Lumpur. Os critérios de inclusão incluíam pacientes que receberam serviços sob o UMMC e tinham entre 20 e 80 anos. Pacientes que passaram por tratamento ativo com insulina, com histórico de tratamento a laser ou anti-VEGF nos últimos 3 meses, ou que tomaram antiplaquetas regulares ou anticoagulantes regulares foram excluídos do estudo. Os participantes foram então divididos em três grupos: (1) controle saudável (Controle), (2) diabético sem retinopatia (DM sem DR) e (3) diabético com retinopatia (DR). Um resumo do protocolo é fornecido na Figura 1. Detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

figure-protocol-1
Figura 1: Uma visão geral do protocolo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação de materiais    

  1. Prepare um kit básico de curativos estéril contendo duas pinças, seis bolas de algodão, quatro gazes, uma bandeja e uma bolsa de risco biológico.
  2. Despeje 5 mL de solução de irrigação com cloreto de sódio 0,9% em uma bandeja.
  3. Abra um pacote de lenços limpantes para pálpebras e coloque no campo estéril.
  4. Prepare um tubo contendo 250 μL de solução conservante.
  5. Dobre uma tira de Schirmer no nível da cunha, ainda dentro da embalagem, antes de colocar a tira estéril sobre o campo estéril.
  6. Coloque luvas cirúrgicas de forma asséptica.
  7. Usando uma pinça estéril, umedeça os algodões com 0,9% de solução de irrigação estéril de cloreto de sódio estéril.

2. Preparação de sujeitos humanos    

  1. Permita que o sujeito se sente confortavelmente e peça para fechar os olhos.
  2. Limpe a pele periorbitária quatro vezes usando algodão embebido em solução de irrigação.
  3. Limpe a pele periorbitária com um lenço limpador para pálpebras.

3. Coleta de fluido lacrimógeno humano

  1. Colete os fluidos lacrimais usando a tira de Schirmers colocada no fórnix temporal inferior.
  2. Ao colocar a tira parcialmente dobrada no olho direito, peça que o sujeito olhe para a esquerda. Puxe a pálpebra inferior para expor o fórnix inferior.
  3. Usando um par de pinças estéreis, coloque uma tira de Schirmer nos dois terços externos do fórnix conjuntival inferior. Evite que a tira toque a pele para evitar a contaminação da amostra com suor ou outros materiais na pele.
  4. Coloque uma gaze sob a tira para evitar contato com a pele.
  5. Deixe que as lágrimas sejam absorvidas pela tira até a marca de 20 mm ou no máximo 5 minutos, o que ocorrer primeiro.
  6. Se o nível de 20 mm não for atingido, documente o nível dos rasgos com base nas marcações para permitir a padronização do volume do fluido rasgado.
  7. Usando um par de pinças estéreis, remova cuidadosamente a tira de Schirmer e coloque a tira em um tubo contendo solução de soro tampão fosfatado (PBS).
  8. Coloque o tubo em uma caixa térmica para transporte até o laboratório.
  9. Limpe a superfície periorbital removendo qualquer solução residual na pele.

4. Pré-processamento de amostras de lágrimas    

  1. Vortex, o tubo contendo a tira de Schirmer deixado de molho em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente.
  2. Agite o tubo em um balancim por 5 minutos em temperatura ambiente.
  3. Centrifuge o tubo a 2000 x g por 15 minutos a 4 °C.
  4. Transfira a solução para um novo tubo, marque e mantenha-a a -80 °C até o processamento a jusante.
  5. Descarte a tira restante.

5. Isolamento de exossomos

NOTA: O isolamento de RNA é realizado usando um kit comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante (veja Tabela de Materiais).

  1. Descongele a solução lacrimal no gelo por 10 minutos.
  2. Equilibre a coluna de spin por 15 minutos em temperatura ambiente antes do uso.
  3. Remova a saída inferior da coluna e coloque-a sobre a placa de coleta de resíduos fornecida.
  4. Remova o tapete de vedação superior e permita que o buffer de armazenamento passe pela coluna por força gravitacional.
  5. Adicione 250 μL de PBS e deixe que ele passe pela coluna.
  6. Repita o passo 5.5.
  7. Aplique uma amostra de 110 μL no topo de cada coluna e permita que a amostra entre na coluna.
  8. Transfira a coluna para uma placa de coleta de amostras fornecida.
  9. Adicione 100 μL de PBS e deixe que ele passe pela coluna até a placa de coleta da amostra.
  10. Transfira a coluna para a placa de coleta de resíduos.
  11. Adicione 4 PBS de 200 μL à coluna e permita que ela entre para remover a fração de proteínas livres da primeira carga.
  12. Adicione 110 μL de amostra na coluna. Permita entrar na coluna.
  13. Coloque a coluna sobre uma placa de coleta de amostras. Adicione 100 μL de PBS e deixe que ele passe pela coluna.
  14. Centrifuge brevemente a placa de coleta da amostra a 100 x g por 30 s. Os exossomos isolados agora estão prontos para isolamento de RNA.

6. Isolamento de RNA

NOTA: O isolamento de RNA é realizado usando um kit comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante (veja Tabela de Materiais).

  1. Sujeito 200 μL dos exossomos isolados para isolamento de RNA.
  2. Adicione 60 μL de tampão de lise aos exossomos isolados. Vórtice por 5 segundos.
  3. Incube em temperatura ambiente por 3 minutos.
  4. Adicione 20 μL de tampão inibidor de precipitação, faça vórtice por 20 s e incube em temperatura ambiente por 3 minutos.
  5. Centrifuge a 12.000 x g por 3 minutos em temperatura ambiente.
  6. Transfira o sobrenadante transparente e incolor para um novo tubo.
  7. Adicione 1 volume de isopropanol.
  8. Vortex por 5 s e transfira a solução para a mini coluna de spin fornecida no kit.
  9. Centrífuga em temperatura ambiente por 15 s a 8000 x g. Descarte o fluxo de fluxo.
  10. Lave a coluna com 700 μL de tampão de lavagem RWT.
  11. Centrifugar por 15 s a 8000 x g. Descarte o flowthrough.
  12. Lave a coluna com 500 μL de tampão de lavagem RPE.
  13. Centrifugar por 15 s a 8000 x g. Descarte o flowthrough.
  14. Adicione 500 μL de etanol 80% à mini coluna de spin da amostra.
  15. Centrifuge por 2 minutos a 8000 x g. Descarte o fluxo e o tubo de coleta.
  16. Coloque a mini coluna de centrifugação em um novo tubo coletor de 2 mL.
  17. Centrifuge a coluna e o tubo a 18.000 x g por 5 minutos. Descarte o fluxo e o tubo de coleta.
  18. Coloque a mini coluna de spin em um novo tubo de 1,5 mL e adicione 15 μL de água sem RNase no centro da membrana da coluna de spin.
  19. Incube por 3 minutos em temperatura ambiente.
  20. Centrifuge a 18.000 x g por 1 minuto para eluir o RNA. O RNA está pronto para processamento a jusante.
  21. Realize análise de rastreamento de nanopartículas para controle de qualidade e verificação do rendimento do RNA.

7. Síntese de cDNA

  1. Realize a síntese de cDNA usando kits comercialmente disponíveis seguindo os protocolos do fabricante (veja Tabela de Materiais).
  2. Prepare a mistura master conforme a Tabela 1 em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Misture a solução pipetando para cima e para baixo.
  4. Pipete 5,1 μL da mistura master em tubos PCR de 0,1 μL.
  5. Adicione 9,9 μL de amostra ao tubo alocado contendo a mistura master.
  6. Coloque os tubos de PCR em um termociclador e funcione conforme a Tabela 2.
    NOTA: O cDNA está pronto para análise adicional.
ComponenteVolume/reação
Buffer RT 10x1,5 μL
Mistura 100M dNTP0,15 μL
Inibidor de RNAse (200U/μL)0,19 μL
Enzima RT Multiscribe (50U/μl)1 μl
Primer RT 20x0,75 μL
Água livre de RNAse1,51 μL
Exemplo9,9 μL
Total Volume15 μL

Tabela 1: Preparação da mistura mestre de PCR usada para síntese de cDNA a partir do RNA isolado.

PassoTemperaturaDuração
Transcrição Reversa16 °C30 min
42 °C30 min
Pare85 °C5 min
Segura4 °C

Tabela 2: Condições de termociclagem para a síntese de cDNA.

8. PCR digital de gotículas

NOTA: A PCR digital por gotículas (ddPCR) é realizada usando kits comercialmente disponíveis, seguindo os protocolos do fabricante (veja Tabela de Materiais).

  1. Prepare a mistura master para ddPCR em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL, conforme a Tabela 3.
  2. Pipete 19,8 μL de mistura master em tubos de PCR de 0,1 μL. Adicione 2,2 μL de amostras e misture bem pipetando a mistura para cima e para baixo por 10 vezes.
  3. Transfira 20 μL da mistura da amostra para a faixa de amostra do cartucho ddPCR.
  4. Adicione 50 μL de óleo na linha de óleo do cartucho.
  5. Prenda uma junta no cartucho usando o gancho na placa.
  6. Coloque o cartucho na máquina de geração de gotas. Um som de clique indica a inserção adequada do cartucho na máquina de geração de gotas.
  7. Transfira cuidadosamente todas as gotículas geradas para poços de uma placa de 96 poços. Adicione pelo menos um poço sem controle de template como um controle negativo.
  8. Sele a placa usando uma folha perfurável em uma máquina seladora de placas (veja a Tabela de Materiais).
  9. Coloque a placa em um termociclador e funcione conforme a Tabela 4.
  10. Transfira a placa para a máquina leitora de gotículas para contar para gotículas positivas e negativas.
  11. Quantifique o número de cópia/mL usando o número de cópia/valor de 20 μL gerado pela execução.
ComponenteVolume/reação
2x ddPCR Supermix para Sondas (Sem dUTP)10 μL
20x Primers/ sonda1 μL
Exemplo7 μL
Água livre de RNAse2 μL
Total Volume20 μL

Tabela 3: Preparação da mistura master PCR usada para ddPCR.

PassoTemperaturaDuraçãoRampaCiclo
Ativação enzimática95 °C10 min~2 °C/ s para cada passo1
Desnaturação94 °C30 s40
Recozimento60 °C1 min40
Desativação enzimática98 °C10 min1
Segura4 °CN/AN/A

Tabela 4: Condições de termociclagem para a ddPCR.

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Resultados

Curva padrão
Foi criada uma curva padrão para determinar o volume exato de lágrimas coletadas de cada paciente. Basicamente, diferentes volumes de conservantes entre 3 μL e 25 μL foram expostos às tiras de Schirmer. E a distância da área úmida no Schirmer foi observada. O procedimento foi repetido três vezes para cada procedimento, e a leitura média foi calculada. Foi gerada uma curva padrão do volume de rasgos coletados versus a distância das áreas úmidas de Schirmer...

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Discussão

Exame de funduscopia, tomografia de coerência óptica e angiografia com fluoresceína são as técnicas atualmente disponíveis para detecção de retinopatia diabética. As três técnicas são frequentemente usadas juntas para fornecer uma avaliação abrangente de várias doenças retinianas e coroides. Funduscopia é um exame clínico realizado rotineiramente durante a avaliação da retinopatia diabética. Esse método é realizado por oftalmologistas treinados e é o padrão ouro para o diagnóstico da ret...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Alcon Research Institute (IF011-2020) e pela FOM UMSC Care Postdoctoral Research Grant 2021.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,9% w/v de cloreto de sódioAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x Soro Tampão de FosfatoThermo Fisher Scientific10010-023
Biossistemas Aplicados  Kit de Transcrição Reversa de MicroRNA TaqManBiossistemas Aplicados4366596
ddPCR Supermix para Sondas (Sem dUTP)Laboratórios BioRad1863024
Placas de 96 Poços ddPCRLaboratórios BioRad12001925
Cartuchos DG8Laboratórios BioRad1864008
Juntas DG8Laboratórios BioRad1863009
Óleo de Geração de Gotículas para SondasLaboratórios BioRad1863005
Kit de Isolamento de Exospin-96Sistemas de Guiamento de CélulasEX07-96
Kit Avançado de Soro/Plasma miRNeasyQiagen  217204
Selante de placas PCR PX1Laboratórios BioRad1814000
Sistema de PCR digital de gotículas QX100Laboratórios BioRadQX100
QXDx Gerador de Gotas Laboratórios BioRad12001049
Tira de SchirmerOptitechSCH-100
Ciclador Térmico T100Laboratórios BioRad1861096
Ensaio de MicroRNA Taqman MTOMED 20 (ID do ensaio: 000389)Biossistemas Aplicados4440887Sequência de Alvo: UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

Referências

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