Artigo de método

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

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DOI:

10.3791/66723

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10 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1EGA Institute for Women's Health, University College London, 2Department of Women and Children's Health, St Thomas' Hospital, King's College London

Neste artigo

Resumo

O parto prematuro (parto < 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Resumo

O parto prematuro continua a ser a principal causa de mortalidade e morbidade neonatal em todo o mundo, com terapias preventivas limitadas. Há uma necessidade imperativa de
Modelos animais relevantes e reprodutíveis para a tradução de intervenções inovadoras
para se tornar uma realidade. Existem vários modelos de camundongos de parto prematuro. No entanto, eles não recapitulam as morbidades neonatais humanas, incluindo alterações neuropatológicas e
lesão pulmonar, que são sequelas características de infecção ascendente e parto prematuro. Caracterizamos um modelo que, até onde sabemos, é o único que mimetiza o cenário humano em que essas morbidades neonatais estão presentes após a indução do parto prematuro por uma bactéria viva que ascende da vagina. Este artigo demonstra a administração intravaginal de uma cepa bioluminescente de Escherichia coli e detalha a avaliação de resultados neuropatológicos e lesão pulmonar usando técnicas de imuno-histoquímica e histologia.

Introdução

O nascimento prematuro (TBP; parto < 37 semanas) é o principal contribuinte para a mortalidade neonatal em todo o mundo 1,2. Responsável por 11% de todos os nascimentos, é um importante problema de saúde global com etiologia complexa e pouco compreendida, dificultando a previsão e prevenção 3,4,5. Os sobreviventes neonatais de TBP podem apresentar resultados adversos no neurodesenvolvimento, incluindo paralisia cerebral, distúrbios respiratórios, como displasia broncopulmonar (DBP), e distúrbios gastrointestinais, como enterocolite necrosante (ECN)6,7,8. Portanto, há uma necessidade urgente de modelos animais clinicamente relevantes e reprodutíveis para abordar as vias biológicas que contribuem para a TBP e desenvolver intervenções inovadoras.

Existem vários mecanismos possíveis subjacentes à TBP espontânea, como senescência decidual, quebra da tolerância materno-fetal, estresse, comprimento cervical curto ou dano cervical9. No entanto, pelo menos 40% dos TBPs espontâneos são relatados como associados à infecção microbiana10,11. Os micróbios que ascendem do canal vaginal através do colo uterino até o útero são hipotetizados e amplamente aceitos como uma via comum de infecção devido à correlação entre os micróbios isolados do líquido amniótico e aqueles residentes na microbiota vaginal 12,13,14. Os microrganismos frequentemente associados ao parto prematuro incluem espécies de Mycoplasma, Ureaplasma, Fusobacterium e Streptococcus, e a maioria dos casos é polimicrobiana15,16.

Os camundongos são frequentemente usados para modelar a TBP, sendo a abordagem mais comum a administração da toxina bacteriana lipopolissacarídeo (LPS), que pode ser administrada por via intrauterina, intraperitoneal ou intra-amniótica para induzir os níveis de inflamação necessários para iniciar o parto17. No entanto, o LPS não modela infecção microbiana viva e, mais importante, os resultados neonatais não podem ser medidos nesses modelos, pois o LPS induz a morte fetal18. Nos últimos anos, modelos animais de infecção bacteriana vaginal ascendente foram desenvolvidos, mas recapitular o nascimento prematuro e os resultados neonatais associados tem sido um desafio 19,20,21,22,23,24.

Nosso grupo estabeleceu um novo modelo de infecção bacteriana vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal que recapitula a fisiopatologia da TBP humana25. Aqui, demonstramos como avaliar a neuropatologia neonatal e a lesão pulmonar em filhotes expostos à infecção vaginal ascendente materna com uma cepa patogênica de Escherichia coli (E. coli) que tem sido associada à meningite neonatal humana. Este modelo oferece uma oportunidade única para explorar a fisiopatologia da infecção ascendente, além de fornecer os meios para avaliar a eficácia das intervenções de parto prematuro na melhoria dos resultados neonatais.

Protocolo

Os procedimentos foram conduzidos sob uma Licença do Ministério do Interior do Reino Unido (PAD4E6357) de acordo com a Lei de Procedimentos Científicos Animais (1986) e as diretrizes ARRIVE. Temperatura (19-23 °C), umidade (~55%) e ciclos claro/escuro de 12 h foram rigidamente controlados. Camundongos C57BL / 6 Tyrc-2J fêmeas virgens (com idades entre 6 e 12 semanas) foram acasalados durante a noite por 16 a 18 horas. A evidência do tampão copulatório foi atribuída como dia embrionário (E) 0,5.

E. coli patogênica O18:K1 (A192PP)26, uma cepa de A192 (DSM. No. 10719)27, foi modificado para conter o operon lux (luxCDABE), originário do simbionte nematóide Photorhabdus Luminescens ATCC29999 (cepa Hb), e incluindo um de resistência à canamicina (Km2)28. Esta cepa é categorizada como Grupo de Perigo 2 pelo Comitê Consultivo do Governo do Reino Unido sobre Patógenos Perigosos (ACDP). Use equipamento de proteção individual (EPI) adequado e siga as diretrizes locais ao manusear e descartar agentes biológicos.

1. Modelo de camundongo de infecção bacteriana vaginal ascendente

  1. Preparação de culturas de E. coli
    1. Prepare o caldo Luria-Bertani (LB) dissolvendo o pó em água destilada (dH2O) para fazer uma solução a 20% e autoclave. Assim que o LB esfriar à temperatura ambiente, adicione 50 μg / mL de canamicina. Conservar a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
    2. Prepare uma solução de gel plurônico F127 a 20% dissolvendo o sólido em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Vórtice para misturar e agitar a 4 °C durante a noite.
    3. Adicione 10 mL de caldo LB tratado com antibióticos a um recipiente universal estéril de 30 mL. Remova um estoque congelado de glicerol de E. coli do armazenamento a -80 °C. Usando uma ponta de pipeta estéril, raspe o estoque de glicerol congelado de E. coli para cobrir levemente a extremidade da ponta e ejetar a ponta diretamente no caldo LB. Fixe o recipiente universal com parafilme, rotule-o como risco biológico e coloque-o num agitador orbital durante a noite (200 rpm) a 37 °C.
    4. Na manhã seguinte, diluir a cultura bacteriana 1:100 (0,1 mL de cultura + 9,9 mL de caldo LB fresco) e devolvê-la ao agitador orbital por 1,5-3 h (200 rpm a 37 ° C), verificando regularmente o crescimento da cultura medindo a absorbância a 600 nm. Pipetar 100 μL da cultura em duplicado para uma placa transparente de fundo plano de 96 poços. Meça a absorbância em um espectrofotômetro com correção de comprimento de caminho ativada. Um OD600 entre 0,5 e 0,7 significa a fase logarítmica média do crescimento.
    5. Quando OD600 0,5-0,7 for atingido (~ 108-9 unidades formadoras de colônias [UFC]), remova 100 μL da cultura bacteriana e dilua em 900 μL de PBS estéril. Centrifugue a 14.000 × g por 1 min para lavar o pellet bacteriano e remover o caldo LB. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet bacteriano em PBS estéril e dilua 1:10.000 em PBS estéril (para 102-3 UFC).
    6. Desinfete todas as pontas e recipientes expostos a bactérias antes do descarte.
  2. Anestesia
    1. Em E16.5, anestesiar camundongos prenhes pela inalação de isoflurano (5% para indução, 1,5% para manutenção em oxigênio). Transfira o fluxo da anestesia e depois o animal para o cone do nariz, colocando a fêmea em decúbito ventral. Confirme a anestesia através da ausência de um reflexo de pinça do dedo do pé e mantenha o isoflurano na porcentagem mínima necessária para o procedimento.
      CUIDADO: O isoflurano é um irritante para os olhos e a pele e tóxico para o sistema nervoso central. Use EPI apropriado. Sempre use um sistema de limpeza.
    2. Administre 20 μL de E. coli de fase mediana (1 × 102-3 UFC ressuspensa em PBS estéril) ou PBS estéril (controle de veículo) na vagina usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL (Figura 1). Usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL fresca, forneça 20 μL de gel plurônico F127 a 20% na vagina para evitar vazamento bacteriano. Usando gaze estéril, aplique pó de quinina no intróito para impedir que os camundongos limpem a suspensão bacteriana. Registre a data e a hora do tratamento.
      NOTA: AS UFC utilizadas foram baseadas em experimentos de titulação para atingir o fenótipo desejado (parto prematuro com filhotes vivos). A UFC pode ser determinada realizando diluições seriadas e plaqueamento em placas de ágar LB29.
    3. Enjaular individualmente os animais em gaiolas ventiladas individualmente (VCI) e permitir que recuperem da anestesia antes de devolverem a gaiola à sala de espera; Marque claramente a gaiola como um risco biológico. Monitore os animais até que seu comportamento normal seja retomado.
      NOTA: Este procedimento não deve levar mais de 5 minutos e os animais devem se recuperar rapidamente (dentro de 2 a 5 minutos).
  3. Mensuração dos desfechos gestacionais
    1. Configure o CCTV conectando uma câmera na parte externa de cada gaiola para monitorar os ratos em busca de sinais de parto e parto de filhotes. Registre o tempo necessário até o parto como o número de horas desde o momento da administração intravaginal de E. coli ou PBS (etapa 1.2.2) até o parto do primeiro filhote.
    2. Registre o número de filhotes vivos/mortos no parto e calcule uma porcentagem de sobrevivência por ninhada. Observe a mãe e os filhotes diariamente, registrando a sobrevivência dos filhotes até 7 dias pós-natais e garantindo a recuperação das mães. Faça outras medidas, como peso e comprimento do filhote, durante este período.
      NOTA: Os sinais de parto incluem aumento da higiene, giros em círculos e alongamento e chute das patas traseiras. Como se trata de uma infecção bacteriana viva, as barragens desenvolverão sintomas ao longo do tempo (geralmente 24 horas após o tratamento). A fêmea deve se recuperar da infecção, mas se ela ainda estiver exibindo sintomas de infecção após o parto, não tiver construído um ninho ou alimentado seus filhotes no primeiro dia, sacrifique humanamente os animais usando métodos da Tabela 1 (como exposição ao CO2 em uma concentração crescente e confirmação de morte por luxação cervical).
  4. Imagem de bioluminescência
    1. Após a inoculação bacteriana, faça imagens das fêmeas em 24 h e 48 h para rastrear a propagação da infecção, conforme descrito abaixo. Fotografe os filhotes no dia pós-natal (P)0 até P14 sem a necessidade de anestesia.
    2. Depois de abrir o software de imagem, clique em Inicializar e aguarde até que a câmera atinja a temperatura operacional (a barra de temperatura ficará verde e "travará"). Marque a caixa Imagem luminescente e confirme se o Filtro de excitação está definido como Bloquear e o Filtro de emissão está definido como Aberto.
    3. Anestesiar fêmeas adultas pela inalação de isoflurano (5% para indução, 1,5% para manutenção em oxigênio). Coloque os animais em decúbito dorsal na máquina de imagem de bioluminescência (com um estágio aquecido) enquanto mantém a anestesia para os camundongos. Selecione Tempo de exposição automática ou defina manualmente o tempo de exposição (intervalo de exposição: 1 min - 5 min). Após a imagem, devolva os animais às gaiolas para se recuperarem da anestesia antes de devolvê-los à sala de espera.
    4. Para medir quantitativamente a radiância do fóton, selecione regiões de interesse (ROIs) nas imagens do mouse e registre os fótons por segundo por centímetro quadrado por esterradiano (fótons∙(segundo-cm2)-1∙sr-1).

2. Análises de tecidos fetais e neonatais

  1. Coleta de tecido perinatal
    1. Em E18.5, sacrifique a mãe por exposição ao aumento da concentração de CO2 e confirmando a morte por luxação cervical e realize uma mini laparotomia para remover o útero; Em seguida, faça uma incisão no útero usando uma tesoura.
    2. Se estiver coletando líquido amniótico, faça uma pequena incisão nas membranas e colete o fluido usando uma pipeta Pasteur ou uma seringa sem agulha.
    3. Usando uma pinça, com uma mão segure a parte externa do útero no ponto onde a placenta está presa e, com uma pinça curva na outra mão, retire suavemente a placenta da parede uterina interna, separando os tecidos, guiando cuidadosamente o feto, com as membranas e a placenta presas, para fora do útero. Novamente, com uma pinça em cada mão, segure suavemente a placenta e segure e arranque as membranas no ponto em que encontram a placenta (certifique-se de que elas saiam limpas).
    4. Agora que os tecidos estão separados, colete os tecidos gestacionais necessários (por exemplo, útero, placenta, membranas fetais, colo do útero e vagina) e disseque os tecidos fetais (por exemplo, cérebro, pulmões e intestino).
    5. Congele imediatamente os tecidos em gelo seco ou em nitrogênio líquido e / ou fixe os tecidos em paraformaldeído (PFA; 4% em PBS).
    6. Armazene o tecido congelado a -80 °C e fixe os tecidos por 24-48 h; em seguida, armazene em sacarose a 30% a 4 °C.
      CUIDADO: O PFA é inflamável e pode causar irritação nos olhos, pele e respiração. Prepare a solução a 4% em um gabinete de biossegurança e use EPI apropriado ao manusear.
  2. Coleta de tecido pós-natal
    1. Em P7, anestesiar os filhotes com isoflurano (5% para indução, 1,5% para manutenção em oxigênio).
    2. Realize a exsanguinação e a perfusão tecidual incisando o átrio direito e injete 10 mL de PBS no ventrículo esquerdo. Decapite a carcaça e remova o cérebro e os pulmões usando tesouras e pinças estéreis. Processe e armazene o tecido conforme descrito acima.
      NOTA: O tecido materno e fetal congelado pode ser analisado quanto a mediadores inflamatórios e outros por qPCR, ELISA e western blot. Protocolos para essas técnicas estão prontamente disponíveis nos fabricantes de reagentes ou em outras publicações 25,30,31.
  3. Crioseccionamento de cérebros fetais e neonatais
    1. Usando uma lâmina, remova o cerebelo para criar uma superfície plana e congele o tecido em gelo seco. Monte o tecido congelado no suporte da amostra usando o composto de temperatura de corte ideal (OCT) e cubra o tecido com uma fina camada de OCT. Deixe congelar (1-2 min).
    2. Usando um criostato ajustado para -20 °C, certifique-se de que a alavanca esteja travada e carregue o suporte da amostra. Ajuste com precisão a posição do tecido e trave no lugar. Apare o tecido e comece a coletar seções de tecido em microlâminas da fusão do corpo caloso, congelando imediatamente as seções em gelo seco. Corte 50 cortes seriados de 40 μm de cada tecido.
      CUIDADO: Tenha cuidado com a lâmina afiada.
    3. Armazenar as secções congeladas em microlâminas a -80 °C.
  4. Imuno-histoquímica
    NOTA: O protocolo abaixo pode ser usado para identificar astrócitos (proteína glial fibrilar ácida; GFAP), microglia (fator inflamatório do aloenxerto 1; IBA-1) e neutrófilos (membro da família G do antígeno linfocitário 6; Ly6G). Informações sobre anticorpos podem ser encontradas em Tabela 1.
    1. Selecione cinco seções por cérebro, com 400 μm de distância, o que permitirá a avaliação de diferentes regiões cerebrais em profundidades variáveis do cérebro. Reidrate as seções congeladas com uma gota de dH2O e espalhe e desdobre o tecido usando duas escovas finas. Seque o lenço sob um ventilador por 20-30 min. Usando uma caneta hidrofóbica (PAP), desenhe cuidadosamente ao redor do tecido sem tocá-lo.
    2. No dia 1, prepare formaldeído a 4% (FA) adicionando 5,4 mL de formaldeído em 50 mL de tampão fosfato 0,1 M (PB) para uma cubeta de 50 mL (capacidade de 15 lâminas). Mergulhe as lâminas em FA por 5 min para fixar as criossecções, permitindo a adesão às lâminas e para imobilizar antígenos.
      CUIDADO: O ácido fílico é inflamável e pode causar irritação nos olhos, na pele e nas vias respiratórias. Prepare uma solução a 4% em um gabinete de biossegurança e use EPI apropriado ao manusear.
    3. Prepare soro de albumina bovina a 0,1% (BSA) adicionando 0,4 g de BSA a 400 mL de 0,1 M PB. Lave as seções 2x imergindo-as em 0.1 M PB, seguidas de uma lavagem em BSA (~ 3 s por lavagem). Armazene slides
      cubetas contendo BSA até que sejam necessárias.
    4. Prepare as câmaras de umidade umedecendo papel de seda com dH2O e coloque-as na câmara, drenando o excesso de água.
    5. Prepare soro de cabra a 5% (50 μL de soro de cabra em 1 mL de 0,1 M PB). Seque cuidadosamente a lâmina ao redor da seção de tecido com papel de seda, garantindo que a borda da caneta PAP esteja intacta e, em seguida, aplique 50 μL da solução por seção de tecido. Incubar na câmara de umidade por 30 min.
    6. Remova o soro batendo na lâmina em papel de seda limpo e adicione o anticorpo primário diluído em BSA (anticorpos e diluições são apresentados na Tabela 1). Incubar durante a noite a 4 oC.
    7. No dia 2, incube o anticorpo secundário no soro de camundongo (ver Tabela 1) por 30 min a 37 oC e adicione à BSA (diluição de 1:100) (por exemplo,., 5 mL de BSA + 100 μL de soro de camundongo + 50 μL de anticorpo secundário).
    8. Lave as lâminas 2x imergindo-as (~3 s) em BSA e depois uma vez em 0,1 M PB. Segure as lâminas em cubetas contendo BSA e seque a borda ao redor de cada seção de tecido. Aplicar 50 μL da solução de anticorpos secundários por secção de tecido e incubar durante 1 h na câmara de humidade.
    9. Prepare o complexo de avidina biotina (ABC) (diluição a 0,1%) adicionando 10 μL de A e 10 μL de B em 1 mL de 0,1 M PB. Mergulhe (~3 s) as lâminas 2x em BSA e uma vez em 0.1 M PB, depois coloque as lâminas em uma cubeta contendo 0.1 M PB. Seque as lâminas, aplique 50 μL de solução ABC por lâmina e incube por 1 h na câmara de umidade.
    10. Prepare a solução de diaminobenzidina (DAB). Pesar 25 mg de DAB por cubeta, dissolver em 50 ml de PB 10 mM e filtrar com papel de filtro nº 4.
      CUIDADO: O DAB é um perigo para a saúde com possível mutagenicidade e carcinogenicidade de células germinativas. Use EPI apropriado e descarte com segurança.
    11. Lave as lâminas 3 x 3 s com 10 mM PB e coloque-as em cubetas contendo 10 mM PB. Adicione peróxido de hidrogênio (H2O2) à solução DAB antes de despejar imediatamente a solução em cubetas novas (16,7 μL de H2O2 por cubeta). Mova as lâminas para as cubetas DAB e deixe por ~ 3 min (máximo 5 min), enquanto verifica constantemente a intensidade da coloração ao microscópio.
      CUIDADO: H2O2 pode irritar os olhos, a pele e a garganta. Use EPI apropriado.
    12. Lave as lâminas (3 s) uma vez em 10 mM PB e 2x em dH2O e deixe as lâminas secarem. Mergulhe as lâminas secas 3x em xileno. Aplique uma gota de meio de montagem DPX em uma lamínula e coloque sobre a seção de tecido, tomando cuidado para evitar bolhas de ar.
      CUIDADO: O xileno e o DPX são inflamáveis e podem causar irritação nos olhos, na pele e nas vias respiratórias. Manuseie em um armário de biossegurança e sempre use luvas ao manusear.
  5. Coloração de Nissl
    1. No dia 1, reidratar e espalhar o tecido em dH2O. Prepare 4% de FA adicionando 5,4 mL de FA em 50 mL de 0,1 M PB e use imediatamente. Incube as lâminas em 4% de FA durante a noite.
    2. No dia 2, mova as lâminas de 4% FA para 70% de etanol (EtOH) e incube durante a noite.
    3. Prepare a coloração de Nissl dissolvendo 4 g de Cresyl Violet em 40 mL de 100% de EtOH em um tubo cônico fechado de 50 mL. Inverter durante 15 min, adicionar a solução a 360 ml de dH2O quente e misturar numa placa de agitação durante 20 min. Filtre a solução antes de usar.
    4. No dia 3, siga o procedimento de coloração descrito na Tabela 2 e cubra as seções de tecido com DPX.
  6. Marcação terminal da extremidade do entalhe da desoxinucleotidil transferase dUTP (TUNEL)
    1. Reidrate e espalhe o tecido em dH2O, depois incube as lâminas em 4% FA por 5 min. Mover as lâminas para uma solução de H2O2 e metanol (CH3OH) (1:10) e incubar durante 15 min. Lave as lâminas por 2 x 3 s em 0.1 M PB e coloque-as em cubetas contendo 0.1 M PB.
    2. Preparar a solução de TUNEL no gelo de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar a solução às lâminas (50 μL por secção de tecido) e incubar numa câmara de humidade a 37 °C durante 2 h.
    3. Após 1 h de incubação, preparar a solução ABC conforme descrito no passo 2.4.9 e incubar à temperatura ambiente.
    4. Após 2 h, mova as lâminas para a solução TUNEL STOP (NaCl 300 mM, Citrato de Sódio 30 mM) por 10 min e mergulhe as lâminas para lavar 3 x 3 s em solução PBS 10 mM. Incubar as lâminas em solução ABC durante 1 h.
    5. Prepare sulfato de cobalto (1,55 g de CoSO4 anidro em 100 mL de dH2O) e cloreto de níquel hexahidratado (2,38 g de NiCl2 · 6H2O em 100 mL de dH2O). Prepare a solução de DAB Co-Ni (10 mM PB + 25 mg DAB + 1 mL / 100 mL de Co + 1 mL / 100 mL de Ni). Filtre a solução sob vácuo e mantenha-a no escuro. Imediatamente antes de despejar a solução DAB nas cubetas, adicione 16,7 μL de H2O2 por cubeta de 50 mL.
    6. Após 1 h, mova as lâminas para as cubetas DAB e incube por ~ 3 min em temperatura ambiente, verificando constantemente a intensidade da coloração. Pare a reação movendo as lâminas para cubetas contendo 10 mM PB. Lave imergindo 2 x 3 s em dH2O e deixe as seções de tecido secarem antes de cobri-las com DPX.
  7. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
    1. Reidrate e espalhe o tecido em dH2O e deixe as seções secarem ao ar.
    2. Mergulhe as lâminas em hematoxilina por 2 min.
      CUIDADO: A hematoxilina pode causar irritação nos olhos e na pele. Use EPI apropriado.
    3. Enxágue as lâminas em água corrente da torneira por 5 min, descolora em álcool ácido por 1 s e enxágue em água da torneira.
    4. Contracoloração em eosina a 0,5% (1,5 g dissolvido em 300 mL de EtOH a 95%) por 30 s.
      CUIDADO: A eosina é inflamável e pode causar irritação nos olhos e na pele. Prepare as soluções em um gabinete de biossegurança e use EPI apropriado.
    5. Desidrate as seções de tecido em um gradiente de EtOH: 50%, 70%, 95% e finalmente 100% EtOH, cada um por 3 min. Mova as lâminas para xileno por 2 x 5 min. Lamínula com DPX.

3. Avaliações histológicas e imuno-histoquímicas para neuropatologia e lesão pulmonar

NOTA: As avaliações podem ser realizadas nas seguintes regiões: córtex, córtex piriforme, cápsula externa, estriado, hipocampo e tálamo (Figura 2). Para cérebros E18.5, o corpo caloso também pode ser incluído, pois a diferenciação das células ainda não está completa e as células gliais não migraram para todas as regiões do cérebro. O avaliador deve ser cego para os grupos de tratamento.

  1. Morte celular TUNEL+
    1. Usando um microscópio convencional, conte as células positivas para coloração TUNEL bilateralmente com aumento de 20x em todas as regiões do cérebro (Figura 2).
    2. Avalie três campos ópticos selecionados aleatoriamente por região do cérebro e calcule o número médio de células por região do cérebro.
  2. Avaliação da morfologia de Nissl
    1. Capture imagens de tecido inteiro usando uma câmera colorida com ampliação de 1x e salve como um arquivo TIFF ou outro formato desejado. Importe as imagens para o ImageJ para análise posterior.
    2. Descreva as regiões cerebrais de interesse (por exemplo, córtex e hipocampo) e meça usando a ferramenta à mão livre (Figura 2).
    3. Para obter a medida do tecido, aplique a fórmula: (mm2 × 400 μm) = volume × 100 (revisado32).
  3. Índice de ramificação microglial
    1. Usando um microscópio com um recurso de grade quadrada de 0,049 mm x 0,049 mm, com ampliação de 40x, conte o número de corpos celulares IBA-1+ dentro da grade (C) e o número médio de ramos que cruzam as linhas de grade (B). Faça isso em três campos selecionados aleatoriamente (veja a Figura 3) para cada região do cérebro mostrada na Figura 2.
    2. Use a fórmula (B2 / C) para calcular o índice de ramificação microglial.
  4. Luminosidade óptica para intensidade de coloração GFAP
    1. Usando o software referenciado (Tabela de Materiais) e uma câmera colorida com ampliação de 40x, capture três campos selecionados aleatoriamente por região do cérebro (Figura 2). Pressione Ctrl+H para obter um histograma exibindo a média e o desvio padrão (DP). Registre os valores médios e DP em uma planilha. Capture uma imagem de controle apenas do vidro circundante (ou seja, sem tecido) e registre os valores médios e DP como antes
    2. Use a seguinte fórmula para calcular os valores de luminosidade óptica (OLV) em uma planilha:
      OLV = (média do vidro − desvio padrão do vidro) − (média de [média por imagem − desvio padrão por imagem])
      NOTA: Por exemplo:
      Vidro circundante
      Média ± DP = 143,5 ± 8,56
      Região do cérebro (por exemplo, córtex)
      1. 136,7 ± 10,6
      2. 140,6 ± 10,4
      3. 137,4 ± 11,3
      OLV = (143,5 - 8,56) - (média de [136,7 - 10,6], [140,6 - 10,4], [137,4 - 11,3])
      OLV = 134.94 - 127.47
      OLV = 7,47
    3. Calcule a média de cada valor por região, por animal e depois por grupo experimental.
  5. Avaliações da morfologia pulmonar
    1. Capture seções H&E com ampliação de 40x (três campos ópticos por slide, meça espaços aéreos por campo), salve como TIFF (ou equivalente) e importe imagens para o ImageJ. Selecione aleatoriamente os campos que são representativos de toda a seção pulmonar.
    2. Usando a ferramenta à mão livre, contorne os espaços aéreos e registre a medição (Figura 4A). Encontre a média de três espaços aéreos por campo, depois entre os três campos por seção e, finalmente, entre as três seções por amostra.
  6. Influxo de neutrófilos nos pulmões
    1. Capture imagens de amostra usando uma câmera colorida com ampliação de 40x, três vezes por seção de tecido pulmonar, e salve o arquivo original como um arquivo TIFF ou outro formato desejado. Importe as imagens para o ImageJ e conte manualmente os neutrófilos individuais em três campos do mesmo pulmão. Calcule a média de neutrófilos por pulmão.

Resultados

Este protocolo apresenta um modelo de camundongo de infecção vaginal ascendente e descreve métodos para avaliar a neuropatologia neonatal e os resultados respiratórios. O procedimento para induzir infecção vaginal ascendente deve ser rápido (dentro de 5 minutos) e os camundongos devem se recuperar em alguns minutos. As barragens desenvolveram sintomas de infecção após aproximadamente 24 h25. Isso inclui movimentos lentos, piloereção e uma postura curvada. O tempo médio aproximado de parto nos camundongos infectados foi de 40,3 h após a administração de E. coli (média do grupo controle PBS 52,7 h), ocorrendo em E18,5 em comparação com o parto a termo do grupo controle PBS em E19,531. A porcentagem de filhotes nascidos vivos por ninhada foi reduzida (de 100% para 71,4%) com a infecção, assim como sua sobrevida em 7 dias pós-natal (Figura 5)25. Quando bactérias bioluminescentes são usadas, a imagem pode rastrear a propagação da infecção em barragens e filhotes. Bactérias foram observadas no útero, membranas fetais, placenta e em alguns fetos dentro de 18 h após a administração (Figura 6), e mediadores inflamatórios, medidos por qPCR e ELISA, foram regulados positivamente nesses tecidos, bem como nos tecidos perinatais do filhote, como cérebro, pulmões e intestino 25,29,31.

Uma bateria de avaliações neuropatológicas, como avaliação da morfologia, morte celular, ativação microglial e ativação de astrócitos, foi realizada nos fetos e neonatos usando histologia e imuno-histoquímica 25,31,33. O tecido pulmonar também pode ser avaliado (Figura 4 e Figura 7). A coloração positiva para TUNEL sugere degradação do DNA, um estágio posterior da morte celular34. Observamos um aumento significativo na coloração TUNEL no córtex, córtex piriforme, cápsula externa, hipocampo e tálamo nos cérebros de filhotes expostos à infecção por E. coli durante a gravidez (Figura 8A, B) 31 . A microglia marcada com IBA-1, as células imunes residentes do cérebro, pode ser categorizada por seu estado morfológico, em que a ramificação sugere um fenótipo de repouso, enquanto as células ativadas e fagocíticas tornam-se amebóides ou de formaarredondada 35. Portanto, em vez de quantificar as células microgliais, apresentamos uma estratégia para avaliar seu fenótipo como uma indicação de seu estado. Vemos um aumento na ramificação de IBA1+ no córtex externo e estriado de filhotes de E. coli, em comparação com o grupo PBS (Figura 8C,D)31. Os astrócitos reativos marcados com GFAP, que podem estar associados a inflamação e lesão neurológica, estavam aumentados no córtex piriforme e na cápsula externa em filhotes de E. coli (Figura 8E, F) 31 , 36 , 37 . A coloração de Nissl permite a avaliação de alterações morfológicas grosseiras na estrutura do cérebro; O violeta de cresil é uma coloração histológica padrão para neurônios e rotula grânulos de RNA extranuclear e núcleos celulares. No grupo E. coli, observamos redução da espessura do córtex (Figura 9)31. Da mesma forma, a H&E, que cora respectivamente o núcleo e o citoplasma das células, permite a avaliação da morfologia pulmonar (Figura 4)31. Observamos aumento do espaço aéreo em camundongos expostos a E. coli, bem como um aumento no número de neutrófilos Ly6G+, uma indicação de inflamação (Figura 7)31.

Para análises de dados, o tempo de entrega foi analisado por um teste t não pareado se os dados estivessem normalmente distribuídos. Para os dados percentuais para filhotes nascidos vivos, uma transformação de raiz quadrada de arco seno foi necessária primeiro para transformar uma distribuição de proporção (limitada pelo intervalo de 0 a 1) em uma distribuição normal, que é um dos requisitos para poder realizar um teste t. A sobrevivência dos filhotes foi analisada por um teste de Log-rank (Mantel-Cox). Para histologia e imuno-histoquímica, foram utilizados o teste U de Mann-Whitney ou múltiplos testes t com correção de Welsh, dependendo do tipo de dados e se estavam distribuídos normalmente. Para poder estatístico suficiente, recomendamos o uso de um mínimo de cinco barragens por grupo de tratamento.

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Figura 1: Administração intravaginal de Escherichia coli e o cronograma do tratamento para induzir parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos. (A) E. coli [1], seguida de gel plurônico a 20% F127 [2], é administrada na vagina do camundongo usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL. O pó de quinino é adicionado ao intróito [3]. (B) E. coli é entregue na vagina no dia embrionário 16.5. Tecidos, como pulmões e cérebro, podem ser coletados durante o período fetal ou neonatal. Abreviatura: EN = dia embrionário N; NP = dia pós-natal N; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Regiões cerebrais avaliadas para neuropatologia. Um exemplo de coloração de Nissl do cérebro de um filhote neonatal e as regiões que podem ser avaliadas quanto à neuropatologia. Todas as regiões cerebrais podem ser avaliadas para TUNEL, IBA-1 e GFAP. Optamos por avaliar a morfologia do córtex e do hipocampo usando Nissl. Ampliação: 1x. Barra de escala = 1,5 mm. Abreviaturas: TUNEL = marcação terminal da extremidade de corte da desoxinucleotidil transferase dUTP; AIB-1 = fator inflamatório do aloenxerto 1; GFAP = proteína glial fibrilar ácida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Avaliação positiva do índice de coloração e ramificação IBA-1. Para quantificar o índice de ramificação das células IBA-1+ , conte o número de corpos celulares dentro da grade e o número médio de ramificações que cruzam as linhas de grade horizontais e verticais. Abreviatura: IBA-1 = fator inflamatório do aloenxerto 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Medições do espaço aéreo nos pulmões dos filhotes (coloração H & E). (A) Descreva os espaços aéreos e meça usando a ferramenta à mão livre no ImageJ. (B) A área média do espaço aéreo é aumentada em filhotes expostos a E. coli em comparação com PBS. (C) Imagens representativas de H & E de pulmões de filhotes expostos a PBS e E. coli no útero. Ampliação: 40x. Barra de escala = 59,5 μm. Abreviaturas: H = hematoxilina; E = eosina. n = 2 de 4 ninhadas. *p < 0,05. Essa figura foi adaptada de Boyle et al.31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Efeitos da E. coli intravaginal no tempo de parto e na sobrevivência dos filhotes. (A) O tempo de parto é reduzido na presença de E. coli. (B) A porcentagem de filhotes nascidos vivos é significativamente reduzida e (C) a sobrevivência dos filhotes é reduzida em filhotes expostos a E. coli. Tempo de parto: n = 8-10 ninhadas por grupo; filhotes nascidos vivos: n = 10-17 ninhadas por grupo; Sobrevivência dos filhotes: n = 10-12 ninhadas por grupo. *p < 0,05, ***p < 0,001. Essa figura foi adaptada de Boyle et al.31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Imagem de bioluminescência para monitorar a propagação de E. coli . (A) E. coli bioluminescente sobe da vagina para os cornos uterinos em 48 h. (B) Cornos uterinos dissecados mostram infecção por E. coli em 18 h, (C) assim como a placenta e as membranas fetais. Essa figura foi adaptada de Suff et al.25 e Boyle et al.31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Coloração de Ly6G para neutrófilos em pulmões fetais. (A) Coloração para Ly6G (positivo: pontas de setas), para avaliar o influxo de neutrófilos, em fetos expostos a PBS e E. coli . (B) O número médio de células Ly6G + é significativamente aumentado em fetos de E. coli . Ampliação: 40x. Barra de escala = 59,5 μm. n = 10 de 5 ninhadas por grupo. *p < 0,05. Abreviaturas: Ly6G = Locus do complexo do antígeno 6 do antígeno linfocitário G6D. Essa figura foi adaptada de Boyle et al.31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Exemplos de coloração TUNEL, IBA1 e GFAP. (A) Coloração TUNEL para morte celular no cérebro pós-natal de filhotes expostos a PBS ou E. coli. (B) O número médio de células TUNEL+ é aumentado no córtex, córtex piriforme, cápsula externa, hipocampo e tálamo. (C) Imuno-histoquímica IBA1 para microglia nos grupos PBS e E. coli . (D) O índice de ramificação, como medida da ativação da micróglia, é aumentado na cápsula externa e no estriado em filhotes de E. coli . (E) Coloração GFAP para astrócitos, (F) que está aumentada no córtex piriforme e na cápsula externa em filhotes de E. coli . Barra de escala = 59,5 μm. Abreviaturas: GFAP = proteína glial fibrilar ácida; TUNEL = marcação terminal da desoxinucleotidil transferase dUTP nick end; Pyr = córtex piriforme; EC = cápsula externa; Str = estriado; Quadril = hipocampo; thal = tálamo; total = todas as regiões; CA = cornu ammonis; OLV = valores de luminosidade óptica. Análises imuno-histoquímicas: n = 5-7 de 5 ninhadas por grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n.s. - não significativo. Essa figura foi adaptada de Boyle et al.31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Exemplo de coloração de Nissl positiva e negativa e avaliações morfológicas. (A) Coloração de Nissl do cérebro do filhote pós-natal para avaliar a estrutura e morfologia do tecido. (B) Não há impacto na largura do cérebro, mas (C) a espessura cortical é reduzida em filhotes expostos a E. coli. (D) Não há diferença no volume do hipocampo. Ampliação: 1x. Barra de escala = 1,5 mm. n = 5-7 a partir de 5 ninhadas por grupo. **p < 0,01. Essa figura foi adaptada de Boyle et al.31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Anticorpo primárioDiluiçãoAnticorpo/diluição secundáriosDiluição
Coelho anti-GFAP1:6000Cabra anti-coelho1:100
Coelho anti-IBA11:1000Cabra anti-rato1:100
Mouse anti-Ly6G1:1000Cabra anti-coelho1:100

Tabela 1: Anticorpos para imuno-histoquímica.

PassoReagenteTempo (min)
1Mancha NISSL10
2Água Destilada Fresca2
3Água Destilada Fresca2
470% EtOH2
590% EtOH2
696% EtOH2
796% EtOH com 3-5 gotas de ácido acético glacial2-5 (VERIFICAR CONSTANTEMENTE)
8100% EtOH2
9Isopropanol2
10Xileno2
11Xileno2
12Xileno2

Tabela 2: Procedimento de Nissl.

Discussão

Aqui, descrevemos a indução de um novo modelo de camundongo de parto prematuro e morbidade neonatal por meio de ascensão vaginal bacteriana. Optou-se por E. coli K1 por ser uma causa comum de sepse neonatal e meningite e ser transmitida verticalmente da mãe para o feto 38,39,40. A chave para o sucesso deste modelo é o uso do gel termossensível Plurônico, que evita o vazamento da suspensão bacteriana da vagina, permitindo que a infecção se estabeleça e suba ao útero. Como esse modelo utiliza bactérias vivas derivadas de um isolado de septicemia, é fundamental monitorar as barragens de perto27. Se os animais se recusarem a se mover ou comer ou não cuidarem de seus filhotes (por exemplo, negligenciar a nidificação e a alimentação), eles devem ser sacrificados humanamente imediatamente.

Na maioria das vezes, os sintomas associados à infecção se dissipam dentro de 24 horas após o parto. Também é essencial estar ciente de que diferentes sorotipos de E. coli e outras cepas de bactérias terão efeitos variados na duração gestacional, na extensão da infecção/inflamação e no resultado neonatal. Sugerimos a realização de experimentos preliminares de dose com diferentes UFCs ao usar novos sorotipos/cepas bacterianas para determinar a concentração mínima necessária para o fenótipo desejado e definir desfechos humanos estritos para evitar sofrimento. Deve-se ter extremo cuidado ao administrar um patógeno vivo; permitem que a literatura oriente o uso adequado desses organismos ao modelar a infecção ascendente.

A cepa do camundongo também é importante, pois seus sistemas imunológicos são diferentes. Por exemplo, o tempo e as UFC usados neste modelo não têm os mesmos resultados quando realizados em camundongos C57BL / 6. Optamos por usar os camundongos C57BL / 6 Tyrc-2J , pois os experimentos de curso de tempo mostraram significativamente mais infecção nesta cepa em comparação com CD-1, BALB / c e C57BL / 6. Além disso, há evidências de sinais bioluminescentes de extinção de pêlo preto, o que é um resultado mensurável útil neste modelo29. O dia gestacional ideal para administração bacteriana também pode diferir com o patógeno e a cepa do camundongo. Há uma enorme heterogeneidade nos modelos pré-clínicos de PTB; Portanto, é importante considerar essas variáveis para desenvolver resultados reprodutíveis17.

Outra consideração é o tempo que os animais são expostos à anestesia. Como a exposição excessiva durante a gravidez está associada à neurotoxicidade em filhotes, é essencial manter o tempo de anestesia no mínimo (por exemplo, máximo de 5 min) e sempre incluir controles expostos ao mesmo ambiente e tratados com uma substância veículo 41,42,43. Grupos de controle adicionais úteis para este modelo incluem apenas parto intravaginal não tratado de gel plurônico e apenas anestesia.

A imuno-histoquímica é amplamente utilizada como uma ferramenta experimental para identificar diferentes proteínas e células, e pode ser usada para caracterizar a estrutura e a conectividade no cérebro. Aqui, descrevemos como analisar as principais células do sistema nervoso central que estão associadas à neuroinflamação e lesão neurológica. Também apresentamos métodos para avaliar a apoptose celular e as colorações histológicas que são úteis para medir a morfologia do cérebro e do pulmão. Considerações importantes para garantir o sucesso desses protocolos começam com o uso cuidadoso da caneta PAP; se a caneta PAP tocar o tecido, a coloração falhará, mas se o parâmetro for muito amplo, as seções podem secar durante a noite. Da mesma forma, a câmara de umidade deve ser mantida úmida para evitar o ressecamento das seções.

Ao realizar a coloração de Nissl, a etapa do ácido acético glacial é a mais crítica; As seções precisam ser verificadas constantemente. Quando as principais estruturas do cérebro se tornam visíveis, as seções precisam ser movidas imediatamente para EtOH para interromper a reação. Optamos por avaliar o córtex e o hipocampo, pois a espessura cortical reduzida e o volume hipocampal reduzido foram relatados em neonatos prematuros humanos e outros modelos animais, mas outras regiões podem ser avaliadas quanto a alterações morfológicas 44,45,46,47. Muita atenção também deve ser dada ao desenvolvimento da coloração DAB. Isso deve ser cronometrado e mantido consistente entre os experimentos.

A análise dos dados é a limitação mais comum da imuno-histoquímica devido à dificuldade em quantificar os resultados, que muitas vezes são considerados subjetivos. Embora a análise GFAP seja realizada usando medições de luminosidade óptica assistidas por computador, a coloração inconsistente pode afetar essas medições. Além disso, as avaliações da morfologia do cérebro e do pulmão envolvem medições manuais à mão livre, dependendo do julgamento do observador. Para evitar inconsistências, repetimos essas avaliações duas vezes e em um curto período de tempo. Para reduzir ainda mais qualquer viés, é importante que o avaliador esteja cego para os grupos de tratamento. A baixa imunorreatividade também pode ser um fator limitante. A falta de sinal pode sugerir que o antígeno de interesse está ausente ou pode ser devido a uma falha no protocolo. Para resolver isso, incluímos uma amostra de tecido que pode atuar como um controle positivo sempre que possível e repetimos o procedimento de coloração quando observamos um sinal baixo ou ausente para garantir que isso não foi resultado de um erro experimental.

Além dos protocolos descritos, análises imunológicas dos tecidos materno, fetal e neonatal podem ser realizadas por qPCR e ELISA. Observamos aumento dos níveis inflamatórios de mRNA e proteína em animais expostos à infecção 25,31,48. Nossa hipótese é que a neuropatologia neonatal que demonstramos histologicamente pode ser o resultado de inflamação fetal no cérebro, pulmão e intestino 25,31. Outras avaliações neuropatológicas que realizamos incluem a proteína básica da mielina (MBP) para investigar a mielinização e a NeuN para corar os núcleos neuronais25,31. Além disso, outros marcadores podem ser avaliados para neutrófilos e micróglia para entender melhor o fenótipo e o comportamento dessas células após a exposição à infecção no útero49,50. Além disso, testes comportamentais podem ser realizados para determinar o impacto a longo prazo na prole.

Este modelo não é isento de limitações. Por exemplo, vemos variação na patologia entre e dentro das ninhadas. Isso pode ser o resultado do uso de uma bactéria viva, onde a propagação da infecção não pode ser controlada. Consequentemente, o padrão e o alcance da infecção ascendente nos cornos uterinos variam e geralmente são assimétricos. Outra limitação é a patogenicidade da E. coli, que às vezes pode fazer com que as mães fiquem muito doentes para cuidar de seus filhotes. Os camundongos também não são o melhor modelo de lesão pulmonar, devido à alveologênese ocorrer no pós-natal, e não no pré-natal, como em humanos51. Não conseguimos inflar nossos tecidos pulmonares quando as amostras foram coletadas, o que pode ter impactado em nossos resultados. No entanto, nossos resultados são consistentes com as alterações observadas em modelos animais neonatais de DBP52,53.

Este modelo recapitula a condição humana postulada em que a infecção bacteriana sobe da vagina para o útero, estimulando o parto prematuro. Após a publicação inicial desse modelo, outros replicaram ou produziram modelos semelhantes, enfatizando ainda mais a reprodutibilidade e a relevância dessa metodologia19,54. Crucialmente, este modelo exibe as morbidades comuns experimentadas por neonatos prematuros, onde outros modelos falharam. Isso pode ser devido ao uso de uma cepa bacteriana especificamente associada à sepse neonatal. O LPS, que é mais comumente usado para induzir o parto prematuro em modelos animais, é letal para os filhotes, portanto, os resultados neonatais não podem ser medidos18. Outros modelos de infecção ascendente também têm lutado para produzir filhotes sobreviventes ou demonstrar morbidade neonatal 19,20,21,22,23,24,55,56. Modelos animais clinicamente relevantes, como o que descrevemos, são fundamentais para a compreensão da fisiopatologia do parto prematuro e para o desenvolvimento de intervenções inovadoras que melhorarão os resultados neonatais.

Divulgações

Os autores não têm divulgações relevantes.

Agradecimentos

Escherichia coli K1 A192PP-luxABCDE foi gentilmente presenteado pelo Professor Peter Taylor, da University College London. A Figura 1 e a Figura 3 foram criadas em BioRender.com. Esta pesquisa foi apoiada pela Wellcome Clinical Research Career Development Fellowship 222970 / Z / 21 / Z (NS), Action Medical Research e Borne grant GN2647 (NS, SNW e DP); e Bem-estar das Mulheres concedem RG2365 (A.K.B., N.S., M.H., S.N.W. e D.P.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-GFAP, coelhoTecnologias AgilentZ033429-2
Anti-IBA1, rabbit & nbsp;Wako019-19741
Anti-Ly6G, mouseBioLegend127601
Câmera AVT-Horn 184 3CCDSony
Biotina-16-DUTPMerck11093070910
Coberturas retangulares de vidro borosilicatoFisherScientific12363128
Acetato de violeta cresilThermoFisher Scientific405760100
Crióstato CM1900Leica
Cuvette de vidro MerckBR472700
Diaminobenzidina (DAB)Generon40480004-3
Pinça de dissecação, aço inoxidável, 10 cm, serrilhada, curvaWorld Precision Instruments Ltd15915
Pinça de dissecação, aço inoxidável, 10 cm, serrilhada, retaWorld Precision Instruments Ltd15914
Tesoura Dissecante, 10 cm de comprimento, DireitaWorld Precision Instruments Ltd14393
DPX Merck100579
EosinaSigma-AldrichHT110116
Solução de formaldeído com 4% de tampãoMerck100496
Anticorpo Anti-Coelho IgG (H+L), BiotiniladoLaboratórios VectorBP-9100-50
Anticorpo Anti-Rato IgG (H+L), BiotiniladoLaboratórios VectorBA-9400-1.5
GraphPad Prism v.8 GraphPad Software
H2O2Sigma-Aldrich7722-84-1
HematoxilinaSigma-AldrichMHS16
ImageJInstitutos Nacionais de Saúde
Isoflurano (IsoFlo)Zoetis50019100
Sistema de Imagem In Vivo IVIS Lumina II / Software de Imagem VivaPerkin Elmer/Revvity
MicroslidesVWRISO8037/I
Optimas 6.51 Media Cybernetics Inc.
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
Soro salino tamponado com fosfato (PBS) e nbsp;Thermo Fisher Scientific (Tecnologias de Vida)14190094
Pluronic F-127 Sigma-AldrichP2443
QuininoSuprimentos de Laboratório CientíficoQ0132
Caneta Pap de Barreira Hidrofóbica ReadyProbesThermo Fisher Scientific R3777
Hidróxido de sódioHoneywellS8045
Fosfato de sódio monobásico anidroFisherScientificBP329-1
SacaroseMerckS9378
Terminal transferase Merck3333574001
Kit VECTASTAIN ABC-HRP, PeroxidaseLaboratórios VectorPK-4000
Xilenos (grau histológico) Sigma-Aldrich534056

Referências

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