Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.
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Artigo de método
Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O coração de mamíferos é um órgão complexo formado durante o desenvolvimento por meio de populações altamente diversas de células progenitoras. A origem, o momento do recrutamento e o destino desses progenitores são vitais para o desenvolvimento adequado desse órgão. Os mecanismos moleculares que governam a morfogênese do coração são essenciais para a compreensão da patogênese das cardiopatias congênitas e da regeneração cardíaca embrionária. Abordagens clássicas para investigar esses mecanismos empregaram a geração de camundongos transgênicos para avaliar a função de genes específicos durante o desenvolvimento cardíaco. No entanto, a transgênese de camundongos é um processo complexo e demorado que muitas vezes não pode ser realizado para avaliar o papel de genes específicos durante o desenvolvimento do coração. Para resolver isso, desenvolvemos um protocolo para eletroporação e cultura eficientes de corações embrionários de camundongos, permitindo que a transgênese transitória avalie rapidamente o efeito do ganho ou perda de função de genes envolvidos no desenvolvimento cardíaco. Usando essa metodologia, superexpressamos com sucesso Meis1 no coração embrionário, com preferência pela transfecção de células epicárdicas, demonstrando as capacidades da técnica.
Introdução
O coração é o primeiro órgão formado durante o desenvolvimento embrionário. Este processo envolve a coordenação espaço-temporal de várias populações de células progenitoras de áreas distintas do embrião. Tudo isso ocorre enquanto o coração em desenvolvimento continua batendo e funcionando, enfatizando a notável coordenação necessária para sua formação 1,2,3. Dado o papel crucial do coração, a regulação rigorosa nos níveis celular e molecular é essencial para sua formação adequada 4,5. Identificar os mecanismos que controlam o desenvolvimento cardíaco tem sido de grande interesse, pois são cruciais para desvendar as cardiopatias congênitas, que afetam um número substancial de pacientes em todo omundo6. Além disso, compreender o desenvolvimento cardíaco é fundamental para decifrar a regeneração cardíaca, pois os corações de mamíferos pós-natais retêm uma capacidade regenerativa que é perdida ou prejudicada na idade adulta 7,8. Consequentemente, dissecar os reguladores moleculares do desenvolvimento do coração é imperativo para avançar nos esforços de pesquisa sobre doenças cardíacas congênitas e regeneração cardíaca.
Em busca desse objetivo, tem havido um foco crescente na investigação do papel do epicárdio no desenvolvimento e regeneração cardíaca9. O epicárdio é uma fina camada de tecido mesotelial que compreende a camada mais externa do coração dos mamíferos (Figura 1). Estudos recentes têm mostrado a importância do epicárdio durante a lesão cardíaca, revelando que esse tecido é capaz de enviar sinais de proliferação aos cardiomiócitos na área afetada para mitigar o dano 10,11. Apesar da importância do epicárdio, a realização de novas investigações moleculares tem sido desafiada por sua imensa heterogeneidade. Experimentos de RNAseq de célula única revelaram a heterogeneidade do epicárdio, abrigando múltiplas subpopulações celulares com assinaturas transcriptômicas distintas 12,13,14,15,16. Assim, uma estratégia para rastrear potenciais reguladores do desenvolvimento cardíaco deve acomodar a diversidade de células progenitoras epicárdicas.
Nesse sentido, a receptividade do modelo de camundongo à modificação genética facilitou a identificação de inúmeros genes cruciais para o desenvolvimento do coração, permitindo a geração de linhagens mutantes com ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de genes específicos. No entanto, essas abordagens implicam um investimento considerável de tempo e recursos experimentais; portanto, eles são impraticáveis ao avaliar os papéis de um grande número de genes candidatos. Além disso, os genes de desenvolvimento frequentemente exercem funções pleiotrópicas em diferentes tecidos ou são necessários para o desenvolvimento embrionário inicial, dificultando a interpretação de sua contribuição para o desenvolvimento em um processo específico. Embora seja possível direcionar a função do gene em estruturas específicas ou pontos de tempo de desenvolvimento, isso geralmente requer o uso de construções genéticas mais complexas, que podem ser difíceis de gerar ou geralmente não estão disponíveis.
Para superar essas limitações, apresentamos uma metodologia para eletroporar corações embrionários de camundongos para transgênese transitória (Figura 2). Emparelhada com cultura ex vivo e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), essa estratégia demonstra suas capacidades por meio do GOF transitório de Meis1, um gene bem caracterizado implicado no desenvolvimento e regeneração do coração 17,18,19. Neste artigo, outras aplicações potenciais desta metodologia também são exploradas, e suas vantagens e limitações são discutidas, bem como comparadas aos protocolos existentes para modulação transitória da expressão gênica. Acreditamos que a estrutura e os exemplos visuais apresentados aumentarão a compreensão da biologia do epicárdio durante o desenvolvimento e a doença.
Figura 1: Camadas do coração embrionário de camundongo. Diagrama esquemático de uma visão coronal de um coração embrionário de camundongo E13-14. As três principais camadas celulares do coração são representadas em amarelo (endocárdio), vermelho (miocárdio) e azul (epicárdio). O pericárdio é representado em uma linha marrom. As quatro câmaras do coração são abreviadas como VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito; AE, átrio esquerdo; AD, átrio direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral esquemática do protocolo de eletroporação cardíaca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da CNIC e em conformidade com a legislação vigente, incluindo a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE, conforme aplicado pela Lei Espanhola sob o Real Decreto 53/2013. Para este protocolo, foram empregadas fêmeas de camundongos CD-1 do tipo selvagem com idade entre 15 e 21 semanas. Detalhes sobre os animais, reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de plasmídeo e ferramenta
- Primeiro, prepare a mistura de eletroporação adicionando o DNA plasmidial desejado no gelo a uma concentração final de 1 μg / μL. Em seguida, complete a mistura adicionando sacarose na concentração final de 6% (dissolvida em PBS), um corante biocompatível a 0,01% e complete com PBS até um volume final de 30 μL.
NOTA: Aproximadamente 1-2 μL da mistura de eletroporação são usados por amostra. Dimensionar as proporções da mistura de eletroporação de acordo com o número de amostras no experimento. Lembre-se de que o DNA para eletroporação deve ser purificado da cultura bacteriana, garantindo estabilidade ideal e contaminantes mínimos. Para obter mais detalhes sobre os plasmídeos usados para este estudo, consulte a seção de resultados representativos. - Prepare o meio de crescimento suplementando o meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2% de tampão Hepes e 1% de penicilina / estreptomicina. Manter o meio numa estufa a 37 °C até à utilização. Além disso, aqueça 1x PBS a 37 °C, juntamente com o meio de crescimento.
- Preparar as agulhas esticando um capilar de vidro de 20 μm de diâmetro utilizando um extrator de pipetas com as seguintes condições: calor = 550; puxar = 100; velocidade = 250; tempo = 120. O diâmetro final após o arrancamento deve ser aproximadamente entre 5-8 μm.
- Configure os parâmetros do eletroporador para cinco ciclos de 50 ms a 40 V com intervalos de 900 ms. Prepare os eletrodos, a pipeta bucal e a agulha romba (Figura 3A). Equipar a pipeta com a agulha para carregar o ADN (Figura 3A).
2. Dissecção de embriões e extração de coração
- Configure um cruzamento entre camundongos CD-1 do tipo selvagem. Na manhã seguinte, selecione as fêmeas que exibem um tampão vaginal e anote esse horário como dia embrionário E0.5. Eutanásia dos animais no dia embrionário E12-12.5 por luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
- Extraia cuidadosamente o útero do camundongo e coloque-o em uma toalha de papel seca. Em seguida, corte o útero com uma tesoura fina, inserindo a ponta da tesoura no lado mesometrial e passando lentamente a ponta da lâmina por todo o comprimento. Expor as decíduas e transferi-las para o meio de cultura. Para mais detalhes, consulte o trabalho de Behringer et al.20.
- Dissecar as decíduas para extrair os embriões e, em seguida, colocá-los numa placa de Petri de 60 mm com meio de crescimento quente. Usando uma pinça fina, corte cuidadosamente a cauda e a cabeça do embrião para que apenas o tronco do corpo permaneça. O estágio dos embriões pode ser verificado por meio da avaliação de características anatômicas, conforme descrito por Wong et al.21.
- Em seguida, remova com cautela o máximo possível de tecido do tronco do embrião sem danificar o coração ou as artérias pulmonares e aorta. Uma vez exposto o coração, coloque-o imediatamente em um meio de crescimento novo e quente e mantenha-o em uma incubadora a 37 °C até a eletroporação.
NOTA: Manter a temperatura do coração é crucial para sua sobrevivência. Certifique-se de que o meio esteja sempre quente e substitua-o a cada 5-10 min. Por outro lado, as amostras podem ser manuseadas sem manter a esterilidade, pois isso não afetará a eficiência do procedimento. Observe que o meio de crescimento contém antibióticos.
3. Eletroporação cardíaca e cultura ex vivo
- Carregue aproximadamente 10 μL de mistura de plasmídeo (preparada na etapa 1.1) na agulha aspirando cuidadosamente com a pipeta bucal.
- Prepare um único coração para eletroporação, colocando-o em uma placa de Petri limpa de 60 mm com 1x PBS estéril aquecido a 37 °C. Coloque o prato sob o microscópio de dissecação (Figura 3A).
- Prepare os eletrodos ajustando a distância entre os pólos positivo e negativo para aproximadamente 4 mm (Figura 3B).
NOTA: 4 mm é a distância de abertura na qual os corações de camundongo E12.5 se encaixam nos eletrodos usados neste trabalho. Considere alterar essa distância com base em diferentes tamanhos de amostra ou especificações de eletrodo. - Perfure suavemente a camada mais superficial do coração com a agulha na pipeta da boca. Pipete cuidadosamente 1-2 μL da mistura de plasmídeos e remova a agulha. Várias injeções podem ser realizadas para garantir a penetração ideal, bem como para expandir o número de células eletroporadas.
- Segure os eletrodos no lugar de forma que o coração fique localizado entre os dois pólos (Figura 3C). Em seguida, eletropore o coração com as condições especificadas acima.
NOTA: Para garantir a máxima eficiência de eletroporação, é possível alternar a polaridade dos eletrodos e fornecer outro pulso. - Transfira o coração eletroporado para uma nova placa de 12 poços contendo 1 mL de meio de crescimento e coloque-o a 37 ° C, 5% de CO2.
- Repita as etapas 3.1 a 3.6 até que todas as amostras do experimento sejam eletroporadas. Finalmente, incubar todos os corações em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO2, por 24 h ou até a análise.
NOTA: Em nossas mãos, os corações podem ser deixados em cultura por até 48 h sem sinais aparentes de deterioração (Filme Suplementar 1; Filme Suplementar 2; Figura Suplementar 1).
Figura 3: Configuração de eletroporação. (A) Configuração usada para eletroporação. As setas vermelhas indicam o eletroporador, os eletrodos e a placa de Petri onde os corações são eletroporados. (A') Detalhe próximo da agulha de eletroporação, conforme destacado em (A) pelo retângulo branco. (B) Detalhe da distância ajustada dos eletrodos usados nos corações E12.5. (C) Representação esquemática da eletroporação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Classificação celular e análise imuno-histoquímica
- Para a análise de classificação celular das amostras, prepare um meio de digestão para dissociar o tecido misturando 400 μL de liberase (5 mg / ml), 300 μL de dispase (0,1 g / mL), 4 μL de CaCl2 (0,4 μM), 50 μL de MgCl2 (5 μM) e complete até 10 mL de DMEM. Mantenha no gelo até o uso. Cada coração precisa de aproximadamente 1 mL de meio de digestão. Ajuste os volumes de acordo com o número de amostras.
NOTA: Para imuno-histoquímica, fixe diretamente os corações em 1,5 mL de PFA a 4% por 2 h em RT ou durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lave os corações 3x com PBS e prossiga para os procedimentos histológicos e de imunocoloração a jusante. Para um protocolo de imuno-histoquímica detalhado, consulte Morris et al.22. - Transfira cada coração em cultura para um novo tubo contendo 1 mL de meio de digestão gelada.
- Para facilitar a dissociação, pique o tecido aplicando suavemente o prazer com uma seringa 3-4 vezes e incube imediatamente em uma placa quente a 37 °C, 600 rpm por 45 min.
- Filtrar a mistura de digestão através de um filtro de células de 70 μm para um novo tubo e deixá-la esvaziar por fluxo de gravidade. Em seguida, resgate o volume de passagem e filtre-o novamente usando um filtro de células de 40 μm em um novo tubo de 50 mL.
- Adicione 500 μL de soro fetal bovino (FBS) e complete até 30 mL usando DMEM frio.
- Centrifugue a mistura a 240 x g por 10 min em temperatura ambiente.
- Descarte o sobrenadante e coloque o tubo de 50 mL de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel para secar completamente.
NOTA: Este é um ponto conveniente para pausar o experimento congelando o pellet de célula. Em caso afirmativo, ressuspenda as células com 10% de DMSO em FBS e armazene a -80 °C. - Para classificação de células, ressuspenda as células em 300 μL de tampão de classificação (1% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina em PBS) e adicione 0,3 μL de DAPI (1000x). Execute a classificação de células.
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Resultados
Para demonstrar a eficácia desta técnica na realização de experimentos de ganho de função (GOF) para reguladores relevantes do desenvolvimento cardíaco, uma construção foi eletroporada superexpressando o fator de transcrição Meis1. Para isso, o RNA foi extraído de embriões E9.5 e a transcrição reversa foi realizada para obter DNA complementar (cDNA). Usando o cDNA como modelo, a sequência codificadora Meis1 foi clonada (Tabela Suplementar 1) em um plasmídeo de expressão pCAG (doravante r...
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Discussão
No geral, a metodologia descrita aqui oferece uma estrutura robusta para expressar construções transgênicas no epicárdio em desenvolvimento (Figura 4B), conforme demonstrado pela superexpressão de Meis1 (Figura 4C). Com as construções apropriadas, este protocolo pode ser usado para avaliar transitoriamente o impacto do ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de um gene específico. O LOF pode ser implementado na técnica transfectando um plasmídeo direciona...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pela bolsa RTI2018-097617-J-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e Acción 9 da Universidad de Jaén para O.H.O. Concessão PGC2018-096486-B-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e bolsa H2020-MSCA-ITN-2016-722427 do programa Horizonte 2020 da UE para M.T. JMG foi apoiado por uma bolsa de doutorado do Ministério da Ciência da Espanha e da Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Tanto o CNIC quanto o CBMSO são apoiados pelo Ministério da Ciência da Espanha, e o CNIC é apoiado pela Fundação ProCNIC.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #55 Fórceps | Dumont | 11295-51 | |
| Placa de Cultura de Células Multipoços de Fundo Plano Transparente de 12 poços | BD Falcon | 353043 | |
| mesa de torno de 35 mm | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µ Filtro de Células M | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| Tubos de 50 mL | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µ m Filtro de células | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Anticorpo Policlonal | Invitrogen | A10262 | diluição 1:1000 usado |
| Anti-Miosina 4 (MF20) Anticorpo Monoclonal | Invitrogen | 14-6503-82 | diluição 1:500 usado |
| CD1 Camundongos | Fornecido pela Unidade Animalária (CNIC) | ||
| Caspase-3 clivada (Asp175) Anticorpo | Sinalização Celular Tecnologias | 9661 | Diluição 1:400 usada |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | Diluição 1:1000 usada |
| Dispase/colagenase | Roche | 10269638001 | |
| Água | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Microscópio Estereoscópico Leica S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Extrator de Micropipeta Modelo P-97 | Instrumento Sutter | SU-P-97 | |
| plasmídeo de expressão pCAG | Addgene | #89689 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15070-063 | |
| Placas de Petri 35 &vezes; 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Placas de Petri 60 &vezes; 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Fenol Vermelho Pontas | |||
| Reutilizadas de equipamentos | |||
| Embrião de cultura de soro de rato, ratos machos SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Anticorpo recombinante anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) | Abcam | ab89901 | diluição 1:300 usado |
| Eletroporador de onda quadrada CUY21SC | Gene | Nepa CUY664-10X15 | |
| PBS | Fornecido e autoclavado pela unidade técnica | ||
| Sucrose | Eletrodos de pinça Millipore | 84100 | |
| com gap variável | Nepa Gene | CUY650P5 |
Referências
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Reimpressões e permissões
