Artigo de método

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

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DOI:

10.3791/66754

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24 de maio de 2024

 ,  ,  , 
1Tissue and Organ Homeostasis Program, Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO), 2Cardiovascular Regeneration Program, National Cardiovascular Research Center (CNIC), 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Cardiovasculares (CIBERCV), 4Department of Experimental Biology, Faculty of Experimental Sciences, University of Jaén

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.

Resumo

O coração de mamíferos é um órgão complexo formado durante o desenvolvimento por meio de populações altamente diversas de células progenitoras. A origem, o momento do recrutamento e o destino desses progenitores são vitais para o desenvolvimento adequado desse órgão. Os mecanismos moleculares que governam a morfogênese do coração são essenciais para a compreensão da patogênese das cardiopatias congênitas e da regeneração cardíaca embrionária. Abordagens clássicas para investigar esses mecanismos empregaram a geração de camundongos transgênicos para avaliar a função de genes específicos durante o desenvolvimento cardíaco. No entanto, a transgênese de camundongos é um processo complexo e demorado que muitas vezes não pode ser realizado para avaliar o papel de genes específicos durante o desenvolvimento do coração. Para resolver isso, desenvolvemos um protocolo para eletroporação e cultura eficientes de corações embrionários de camundongos, permitindo que a transgênese transitória avalie rapidamente o efeito do ganho ou perda de função de genes envolvidos no desenvolvimento cardíaco. Usando essa metodologia, superexpressamos com sucesso Meis1 no coração embrionário, com preferência pela transfecção de células epicárdicas, demonstrando as capacidades da técnica.

Introdução

O coração é o primeiro órgão formado durante o desenvolvimento embrionário. Este processo envolve a coordenação espaço-temporal de várias populações de células progenitoras de áreas distintas do embrião. Tudo isso ocorre enquanto o coração em desenvolvimento continua batendo e funcionando, enfatizando a notável coordenação necessária para sua formação 1,2,3. Dado o papel crucial do coração, a regulação rigorosa nos níveis celular e molecular é essencial para sua formação adequada 4,5. Identificar os mecanismos que controlam o desenvolvimento cardíaco tem sido de grande interesse, pois são cruciais para desvendar as cardiopatias congênitas, que afetam um número substancial de pacientes em todo omundo6. Além disso, compreender o desenvolvimento cardíaco é fundamental para decifrar a regeneração cardíaca, pois os corações de mamíferos pós-natais retêm uma capacidade regenerativa que é perdida ou prejudicada na idade adulta 7,8. Consequentemente, dissecar os reguladores moleculares do desenvolvimento do coração é imperativo para avançar nos esforços de pesquisa sobre doenças cardíacas congênitas e regeneração cardíaca.

Em busca desse objetivo, tem havido um foco crescente na investigação do papel do epicárdio no desenvolvimento e regeneração cardíaca9. O epicárdio é uma fina camada de tecido mesotelial que compreende a camada mais externa do coração dos mamíferos (Figura 1). Estudos recentes têm mostrado a importância do epicárdio durante a lesão cardíaca, revelando que esse tecido é capaz de enviar sinais de proliferação aos cardiomiócitos na área afetada para mitigar o dano 10,11. Apesar da importância do epicárdio, a realização de novas investigações moleculares tem sido desafiada por sua imensa heterogeneidade. Experimentos de RNAseq de célula única revelaram a heterogeneidade do epicárdio, abrigando múltiplas subpopulações celulares com assinaturas transcriptômicas distintas 12,13,14,15,16. Assim, uma estratégia para rastrear potenciais reguladores do desenvolvimento cardíaco deve acomodar a diversidade de células progenitoras epicárdicas.

Nesse sentido, a receptividade do modelo de camundongo à modificação genética facilitou a identificação de inúmeros genes cruciais para o desenvolvimento do coração, permitindo a geração de linhagens mutantes com ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de genes específicos. No entanto, essas abordagens implicam um investimento considerável de tempo e recursos experimentais; portanto, eles são impraticáveis ao avaliar os papéis de um grande número de genes candidatos. Além disso, os genes de desenvolvimento frequentemente exercem funções pleiotrópicas em diferentes tecidos ou são necessários para o desenvolvimento embrionário inicial, dificultando a interpretação de sua contribuição para o desenvolvimento em um processo específico. Embora seja possível direcionar a função do gene em estruturas específicas ou pontos de tempo de desenvolvimento, isso geralmente requer o uso de construções genéticas mais complexas, que podem ser difíceis de gerar ou geralmente não estão disponíveis.

Para superar essas limitações, apresentamos uma metodologia para eletroporar corações embrionários de camundongos para transgênese transitória (Figura 2). Emparelhada com cultura ex vivo e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), essa estratégia demonstra suas capacidades por meio do GOF transitório de Meis1, um gene bem caracterizado implicado no desenvolvimento e regeneração do coração 17,18,19. Neste artigo, outras aplicações potenciais desta metodologia também são exploradas, e suas vantagens e limitações são discutidas, bem como comparadas aos protocolos existentes para modulação transitória da expressão gênica. Acreditamos que a estrutura e os exemplos visuais apresentados aumentarão a compreensão da biologia do epicárdio durante o desenvolvimento e a doença.

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Figura 1: Camadas do coração embrionário de camundongo. Diagrama esquemático de uma visão coronal de um coração embrionário de camundongo E13-14. As três principais camadas celulares do coração são representadas em amarelo (endocárdio), vermelho (miocárdio) e azul (epicárdio). O pericárdio é representado em uma linha marrom. As quatro câmaras do coração são abreviadas como VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito; AE, átrio esquerdo; AD, átrio direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Visão geral esquemática do protocolo de eletroporação cardíaca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da CNIC e em conformidade com a legislação vigente, incluindo a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE, conforme aplicado pela Lei Espanhola sob o Real Decreto 53/2013. Para este protocolo, foram empregadas fêmeas de camundongos CD-1 do tipo selvagem com idade entre 15 e 21 semanas. Detalhes sobre os animais, reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de plasmídeo e ferramenta

  1. Primeiro, prepare a mistura de eletroporação adicionando o DNA plasmidial desejado no gelo a uma concentração final de 1 μg / μL. Em seguida, complete a mistura adicionando sacarose na concentração final de 6% (dissolvida em PBS), um corante biocompatível a 0,01% e complete com PBS até um volume final de 30 μL.
    NOTA: Aproximadamente 1-2 μL da mistura de eletroporação são usados por amostra. Dimensionar as proporções da mistura de eletroporação de acordo com o número de amostras no experimento. Lembre-se de que o DNA para eletroporação deve ser purificado da cultura bacteriana, garantindo estabilidade ideal e contaminantes mínimos. Para obter mais detalhes sobre os plasmídeos usados para este estudo, consulte a seção de resultados representativos.
  2. Prepare o meio de crescimento suplementando o meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2% de tampão Hepes e 1% de penicilina / estreptomicina. Manter o meio numa estufa a 37 °C até à utilização. Além disso, aqueça 1x PBS a 37 °C, juntamente com o meio de crescimento.
  3. Preparar as agulhas esticando um capilar de vidro de 20 μm de diâmetro utilizando um extrator de pipetas com as seguintes condições: calor = 550; puxar = 100; velocidade = 250; tempo = 120. O diâmetro final após o arrancamento deve ser aproximadamente entre 5-8 μm.
  4. Configure os parâmetros do eletroporador para cinco ciclos de 50 ms a 40 V com intervalos de 900 ms. Prepare os eletrodos, a pipeta bucal e a agulha romba (Figura 3A). Equipar a pipeta com a agulha para carregar o ADN (Figura 3A).

2. Dissecção de embriões e extração de coração

  1. Configure um cruzamento entre camundongos CD-1 do tipo selvagem. Na manhã seguinte, selecione as fêmeas que exibem um tampão vaginal e anote esse horário como dia embrionário E0.5. Eutanásia dos animais no dia embrionário E12-12.5 por luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  2. Extraia cuidadosamente o útero do camundongo e coloque-o em uma toalha de papel seca. Em seguida, corte o útero com uma tesoura fina, inserindo a ponta da tesoura no lado mesometrial e passando lentamente a ponta da lâmina por todo o comprimento. Expor as decíduas e transferi-las para o meio de cultura. Para mais detalhes, consulte o trabalho de Behringer et al.20.
  3. Dissecar as decíduas para extrair os embriões e, em seguida, colocá-los numa placa de Petri de 60 mm com meio de crescimento quente. Usando uma pinça fina, corte cuidadosamente a cauda e a cabeça do embrião para que apenas o tronco do corpo permaneça. O estágio dos embriões pode ser verificado por meio da avaliação de características anatômicas, conforme descrito por Wong et al.21.
  4. Em seguida, remova com cautela o máximo possível de tecido do tronco do embrião sem danificar o coração ou as artérias pulmonares e aorta. Uma vez exposto o coração, coloque-o imediatamente em um meio de crescimento novo e quente e mantenha-o em uma incubadora a 37 °C até a eletroporação.
    NOTA: Manter a temperatura do coração é crucial para sua sobrevivência. Certifique-se de que o meio esteja sempre quente e substitua-o a cada 5-10 min. Por outro lado, as amostras podem ser manuseadas sem manter a esterilidade, pois isso não afetará a eficiência do procedimento. Observe que o meio de crescimento contém antibióticos.

3. Eletroporação cardíaca e cultura ex vivo

  1. Carregue aproximadamente 10 μL de mistura de plasmídeo (preparada na etapa 1.1) na agulha aspirando cuidadosamente com a pipeta bucal.
  2. Prepare um único coração para eletroporação, colocando-o em uma placa de Petri limpa de 60 mm com 1x PBS estéril aquecido a 37 °C. Coloque o prato sob o microscópio de dissecação (Figura 3A).
  3. Prepare os eletrodos ajustando a distância entre os pólos positivo e negativo para aproximadamente 4 mm (Figura 3B).
    NOTA: 4 mm é a distância de abertura na qual os corações de camundongo E12.5 se encaixam nos eletrodos usados neste trabalho. Considere alterar essa distância com base em diferentes tamanhos de amostra ou especificações de eletrodo.
  4. Perfure suavemente a camada mais superficial do coração com a agulha na pipeta da boca. Pipete cuidadosamente 1-2 μL da mistura de plasmídeos e remova a agulha. Várias injeções podem ser realizadas para garantir a penetração ideal, bem como para expandir o número de células eletroporadas.
  5. Segure os eletrodos no lugar de forma que o coração fique localizado entre os dois pólos (Figura 3C). Em seguida, eletropore o coração com as condições especificadas acima.
    NOTA: Para garantir a máxima eficiência de eletroporação, é possível alternar a polaridade dos eletrodos e fornecer outro pulso.
  6. Transfira o coração eletroporado para uma nova placa de 12 poços contendo 1 mL de meio de crescimento e coloque-o a 37 ° C, 5% de CO2.
  7. Repita as etapas 3.1 a 3.6 até que todas as amostras do experimento sejam eletroporadas. Finalmente, incubar todos os corações em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO2, por 24 h ou até a análise.
    NOTA: Em nossas mãos, os corações podem ser deixados em cultura por até 48 h sem sinais aparentes de deterioração (Filme Suplementar 1; Filme Suplementar 2; Figura Suplementar 1).

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Figura 3: Configuração de eletroporação. (A) Configuração usada para eletroporação. As setas vermelhas indicam o eletroporador, os eletrodos e a placa de Petri onde os corações são eletroporados. (A') Detalhe próximo da agulha de eletroporação, conforme destacado em (A) pelo retângulo branco. (B) Detalhe da distância ajustada dos eletrodos usados nos corações E12.5. (C) Representação esquemática da eletroporação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Classificação celular e análise imuno-histoquímica

  1. Para a análise de classificação celular das amostras, prepare um meio de digestão para dissociar o tecido misturando 400 μL de liberase (5 mg / ml), 300 μL de dispase (0,1 g / mL), 4 μL de CaCl2 (0,4 μM), 50 μL de MgCl2 (5 μM) e complete até 10 mL de DMEM. Mantenha no gelo até o uso. Cada coração precisa de aproximadamente 1 mL de meio de digestão. Ajuste os volumes de acordo com o número de amostras.
    NOTA: Para imuno-histoquímica, fixe diretamente os corações em 1,5 mL de PFA a 4% por 2 h em RT ou durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lave os corações 3x com PBS e prossiga para os procedimentos histológicos e de imunocoloração a jusante. Para um protocolo de imuno-histoquímica detalhado, consulte Morris et al.22.
  2. Transfira cada coração em cultura para um novo tubo contendo 1 mL de meio de digestão gelada.
  3. Para facilitar a dissociação, pique o tecido aplicando suavemente o prazer com uma seringa 3-4 vezes e incube imediatamente em uma placa quente a 37 °C, 600 rpm por 45 min.
  4. Filtrar a mistura de digestão através de um filtro de células de 70 μm para um novo tubo e deixá-la esvaziar por fluxo de gravidade. Em seguida, resgate o volume de passagem e filtre-o novamente usando um filtro de células de 40 μm em um novo tubo de 50 mL.
  5. Adicione 500 μL de soro fetal bovino (FBS) e complete até 30 mL usando DMEM frio.
  6. Centrifugue a mistura a 240 x g por 10 min em temperatura ambiente.
  7. Descarte o sobrenadante e coloque o tubo de 50 mL de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel para secar completamente.
    NOTA: Este é um ponto conveniente para pausar o experimento congelando o pellet de célula. Em caso afirmativo, ressuspenda as células com 10% de DMSO em FBS e armazene a -80 °C.
  8. Para classificação de células, ressuspenda as células em 300 μL de tampão de classificação (1% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina em PBS) e adicione 0,3 μL de DAPI (1000x). Execute a classificação de células.

Resultados

Para demonstrar a eficácia desta técnica na realização de experimentos de ganho de função (GOF) para reguladores relevantes do desenvolvimento cardíaco, uma construção foi eletroporada superexpressando o fator de transcrição Meis1. Para isso, o RNA foi extraído de embriões E9.5 e a transcrição reversa foi realizada para obter DNA complementar (cDNA). Usando o cDNA como modelo, a sequência codificadora Meis1 foi clonada (Tabela Suplementar 1) em um plasmídeo de expressão pCAG (doravante referido como pCAG::Meis1), enquanto um plasmídeo constitutivo que expressa GFP (pCAG::GFP) foi usado como controle. Os corações foram então eletroporados apenas com pCAG::GFP ou em combinação com pCAG::Meis1.

Após 24 h pós-eletroporação (hpe), os corações estavam batendo e pareciam estar em boas condições (Figura 4A; Filme Suplementar 1; Filme Suplementar 2). Para avaliar a viabilidade das células eletroporadas, a apoptose foi analisada por meio da coloração imuno-histoquímica da caspase 3. Embora algumas células positivas tenham sido detectadas no coração, nem o miocárdio nem o epicárdio, onde a maioria das células eletroporadas estão localizadas, foram afetados pela apoptose (Figura 1C suplementar). Quando a atividade de fluorescência foi avaliada, um sinal de GFP em mosaico foi observado em quase todas as quatro câmaras do coração, indicando que esse protocolo é capaz de atingir a maioria das estruturas cardíacas (Figura 4A). Para determinar quais tipos de células cardíacas foram eletroporadas, os corações eletroporados pCAG::GFP foram imunomarcados contra marcadores do epicárdio, WT12, e miocárdio, MF2023, e então fotografados usando um microscópio confocal (Figura 4B). A maioria das células GFP+ estava preferencialmente localizada na região externa do coração, o que correspondia em grande parte ao sinal WT1, indicando que esse método é mais eficiente para atingir as células epicárdicas (Figura 4B, pontas de setas brancas).

Por outro lado, os corações pCAG::Meis1-eletroporados ou controle (pCAG::GFP apenas) foram dissociados, e as células foram submetidas à classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar as células GFP+ de todo o órgão, conforme descrito na etapa 4 do protocolo. O RNA foi extraído das células selecionadas e a PCR quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR) foi realizada para avaliar os níveis de expressão de Meis1 nas células transfectadas (Figura 4C, Tabela Suplementar 1). A expressão total do gene Meis1 foi normalizada usando os níveis de expressão do gene de manutenção de camundongos Eef224, e a expressão gênica relativa foi calculada usando o método ΔΔCt25. Uma regulação positiva significativa dos níveis de RNA Meis1 foi observada nos corações eletroporados com o plasmídeo pCAG::Meis1 em comparação com aqueles com apenas o plasmídeo pCAG::GFP (Figura 4C). Assim, isso demonstra o potencial da técnica para superexpressar genes de interesse e abordar o resultado molecular.

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Figura 4: Análise molecular de corações E12.5 eletroporados. (A) Fluorescência GFP de um coração eletroporado CAG::GFP 24 h após a eletroporação. A imagem inferior mostra a fluorescência da GFP, enquanto a imagem superior mostra uma fusão de GFP e um campo brilhante do mesmo coração. (B) Imunofluorescência de cortes histológicos cardíacos eletroporados E12.5. MF20 marca cardiomiócitos, enquanto WT1 marca células epicárdicas. As imagens à direita correspondem aos zoom-ins do retângulo branco. As pontas das setas brancas indicam células GFP+ localizadas no epicárdio, aproximadamente delimitadas por uma linha branca pontilhada. (C) Análise de RT-qPCR de corações eletroporados com pCAG::Meis1 ou pCAG::GFP (controle). Cada ponto representa uma réplica biológica obtida do agrupamento de três corações. No total, a análise de qPCR foi realizada em triplicatas com três réplicas biológicas distintas. A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student (*P < 0,05). Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Eficiência da eletroporação cardíaca e viabilidade celular. (A) Expressão de GFP em dois corações E12.5 distintos eletroporados com o plasmídeo de controle pCAG::GFP em 24 h ou 48 h pós-eletroporação (hpe). A imagem do sinal GFP foi sobreposta a uma imagem de campo brilhante do mesmo coração. (B) Quantificação de células GFP+ em corações de 24 hpe e 48 hpe eletroporados com controle pCAG::GFP. Os pontos indicam amostras distintas; As linhas sólidas indicam a média, enquanto as barras de erro indicam o desvio padrão. Não foi observada diferença significativa entre as duas condições ( teste t não paramétrico; P > 0,9). (C) Imagem confocal de um coração E12.5 eletroporado com pCAG::GFP imunocorado contra caspase clivada 3 e MF20. A linha pontilhada representa a camada miocárdica do coração. As imagens à direita são ampliadas a partir do retângulo branco. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Resumo e sequências do primer. Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme suplementar 1: pCAG::GFP-coração eletroporado após 24 h. Filme capturando um coração eletroporado com plasmídeo de controle pCAG::GFP 24 h após o procedimento. O coração continua a bater e as células eletroporadas expressam sinais de GFP. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme Suplementar 2: pCAG::GFP-coração eletroporado após 48 h. Filme mostrando um coração eletroporado com controle pCAG::GFP, 48 h após eletroporação. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Discussão

No geral, a metodologia descrita aqui oferece uma estrutura robusta para expressar construções transgênicas no epicárdio em desenvolvimento (Figura 4B), conforme demonstrado pela superexpressão de Meis1 (Figura 4C). Com as construções apropriadas, este protocolo pode ser usado para avaliar transitoriamente o impacto do ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de um gene específico. O LOF pode ser implementado na técnica transfectando um plasmídeo direcionado a um gene candidato por meio de interferência de RNA26. A avaliação rápida do gene GOF ou LOF é particularmente vantajosa, especialmente considerando a grande heterogeneidade transcriptômica das células epicárdicas12, tornando impraticável a geração de animais transgênicos para avaliar cada gene candidato individualmente.

Como esse protocolo utiliza cultura ex vivo, ele oferece a possibilidade de investigar o destino das células epicárdicas dentro de uma janela temporal. O epicárdio em desenvolvimento desempenha um papel fundamental na formação de regiões distintas dentro do coração adulto 13,27,28; Assim, entender suas contribuições para o desenvolvimento cardíaco é fundamental para dissecar a base das malformações cardíacas congênitas. Embora este artigo não se aprofunde nessa aplicação, as diretrizes descritas no protocolo podem ser úteis para futuros estudos de mapeamento de destino do epicárdio

Apesar da utilidade prática do método atual, certas limitações precisam ser reconhecidas. Como essa metodologia depende da transgênese transitória, a expressão do plasmídeo pode ser perdida ou diminuída ao longo do tempo, limitando o alcance do protocolo para estudar uma janela de desenvolvimento específica29. No entanto, neste estudo, a superexpressão de GFP foi mantida durante toda a duração das culturas pós-eletroporação (48 hpe). Além disso, as limitações potenciais nas atuais tecnologias de cultura ex vivo dificultam a aplicabilidade do método para avaliar estágios tardios de desenvolvimento embrionário ou pós-natal, especialmente onde a cultura ex vivo após eletroporação se torna desafiadora30. Embora existam métodos mais sofisticados de cultura de embriões ex vivo 31,32, eles podem exigir o uso de equipamentos menos acessíveis aos pesquisadores e podem não garantir a sobrevivência da amostra.

Embora o protocolo apresentado aqui seja projetado para ser o mais simples possível para aumentar a reprodutibilidade, ele inclui etapas críticas que são fundamentais para o sucesso. Em primeiro lugar, a dissecção do embrião deve ser realizada com cuidado e rapidez para minimizar os danos cardíacos, o que pode comprometer a sobrevivência do órgão após a eletroporação. Cuidados especiais durante esta etapa, juntamente com o uso de equipamentos de dissecação ideais, são fortemente recomendados. Outro aspecto crítico do protocolo é a realização da eletroporação em si, pois a injeção inadequada de plasmídeo pode resultar em resultados indesejáveis. Portanto, é aconselhável realizar várias injeções em um único coração, e injetar a amostra de maneira bastante superficial pode ser benéfico para aumentar a sobrevivência do órgão. Por fim, a dissociação celular durante o processamento cardíaco precisa ser rigorosamente realizada, respeitando os tempos previstos no protocolo para maximizar a viabilidade celular.

Em conclusão, a identificação de genes-chave na formação do coração é fundamental para a compreensão dos mecanismos subjacentes das doenças congênitas cardíacas e da regeneração. A metodologia aqui estabelecida permite a triagem rápida dos efeitos de ganho de função (GOF) e perda de função (LOF) do gene no coração em desenvolvimento. Embora reconheça certas limitações, este método exibe um potencial considerável para extrapolação para diferentes estágios de desenvolvimento ou para mapear o destino das células epicárdicas embrionárias. Por meio das diretrizes visuais fornecidas neste artigo, pretendemos oferecer uma caixa de ferramentas valiosa para avaliar a imensa complexidade e potencial do epicárdio em desenvolvimento.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pela bolsa RTI2018-097617-J-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e Acción 9 da Universidad de Jaén para O.H.O. Concessão PGC2018-096486-B-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e bolsa H2020-MSCA-ITN-2016-722427 do programa Horizonte 2020 da UE para M.T. JMG foi apoiado por uma bolsa de doutorado do Ministério da Ciência da Espanha e da Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Tanto o CNIC quanto o CBMSO são apoiados pelo Ministério da Ciência da Espanha, e o CNIC é apoiado pela Fundação ProCNIC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#55 FórcepsDumont 11295-51
Placa de Cultura de Células Multipoços de Fundo Plano Transparente de 12 poçosBD Falcon353043
mesa de torno de 35 mm GrandadoSKU 8798771617573
40 µ Filtro de Células MFischer Scientific08-771-1
Tubos de 50 mLBD Falcon352070
70 µ m Filtro de célulasCorningCLS431751
Anti-GFP Anticorpo PoliclonalInvitrogenA10262diluição 1:1000 usado
Anti-Miosina 4 (MF20) Anticorpo MonoclonalInvitrogen14-6503-82diluição 1:500 usado
CD1 CamundongosFornecido pela Unidade Animalária (CNIC)
Caspase-3 clivada (Asp175) AnticorpoSinalização Celular Tecnologias9661Diluição 1:400 usada
DAPICell Signalling Technologies4083Diluição 1:1000 usada
Dispase/colagenaseRoche10269638001
Água
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco10313021
Fetal Bovine SerumInvitrogen10438-026
Heracell 150i Incubadora de CO2Thermo Scientific51032720
Microscópio Estereoscópico Leica S8AP0Leica11524102
LiberaseRoche5401119001
Extrator de Micropipeta Modelo P-97Instrumento SutterSU-P-97
plasmídeo de expressão pCAGAddgene#89689
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen15070-063
Placas de Petri 35 &vezes; 10 mmBD Falcon351008
Placas de Petri 60 &vezes; 15 mmBD Falcon353002
Fenol Vermelho Pontas
Reutilizadas de equipamentos
Embrião de cultura de soro de rato, ratos machos SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Anticorpo recombinante anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1)Abcamab89901diluição 1:300 usado
Eletroporador de onda quadrada CUY21SCGeneNepa CUY664-10X15
PBSFornecido e autoclavado pela unidade técnica
Sucrose Eletrodos de pinça Millipore84100
com gap variávelNepa GeneCUY650P5
Tipo Selvagem destilada de pipeta Merck P3532 de laboratório antigos estéril

Referências

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