PyOKR: um método semiautomatizado para quantificar a capacidade de rastreamento do reflexo optocinético

Resumo

Descrevemos aqui o PyOKR, um método de análise quantitativa semiautomatizado que mede diretamente os movimentos oculares resultantes de respostas visuais ao movimento bidimensional da imagem. Uma interface de usuário baseada em Python e um algoritmo de análise permitem maior rendimento e medições quantitativas mais precisas dos parâmetros de rastreamento ocular do que os métodos anteriores.

Resumo

O estudo das respostas comportamentais aos estímulos visuais é um componente chave para a compreensão da função do sistema visual. Uma resposta notável é o reflexo optocinético (OKR), um comportamento inato altamente conservado necessário para a estabilização da imagem na retina. O OKR fornece uma leitura robusta da capacidade de rastreamento de imagens e tem sido extensivamente estudado para entender os circuitos e a função do sistema visual em animais de diferentes origens genéticas. O OKR consiste em duas fases: uma fase de rastreamento lento, pois o olho segue um estímulo até a borda do plano visual e uma sacada de fase rápida compensatória que redefine a posição do olho na órbita. Os métodos anteriores de quantificação de ganho de rastreamento, embora confiáveis, são trabalhosos e podem ser subjetivos ou derivados arbitrariamente. Para obter uma quantificação mais rápida e reprodutível da capacidade de rastreamento ocular, desenvolvemos um novo programa de análise semi-automatizado, o PyOKR, que permite a quantificação do movimento de rastreamento ocular bidimensional em resposta a qualquer estímulo direcional, além de ser adaptável a qualquer tipo de equipamento de vídeo-oculografia. Este método fornece filtragem automatizada, seleção de fases de rastreamento lento, modelagem de vetores oculares verticais e horizontais, quantificação dos ganhos de movimento ocular em relação à velocidade do estímulo e organização dos dados resultantes em uma planilha utilizável para comparações estatísticas e gráficas. Esse pipeline de análise quantitativa e simplificada, prontamente acessível por meio da importação do PyPI, fornece uma medição rápida e direta das respostas OKR, facilitando assim o estudo das respostas comportamentais visuais.

Introdução

A estabilização da imagem depende de respostas oculomotoras precisas para compensar o fluxo óptico global que ocorre durante o automovimento. Essa estabilização é impulsionada principalmente por duas respostas motoras: o reflexo optocinético (OKR) e o reflexo vestíbulo-ocular (RVO)^1,2,3. O movimento global lento através da retina induz o OKR, que provoca a rotação reflexiva do olho na direção correspondente para estabilizar a imagem ^1,2. Esse movimento, conhecido como fase lenta, é interrompido por sacadas compensatórias, conhecidas como fase rápida, nas quais o olho se reinicia rapidamente na direção oposta para permitir uma nova fase lenta. Aqui, definimos essas sacadas de fase rápida como movimentos de rastreamento ocular (ETMs). Enquanto o RVO depende do sistema vestibular para provocar movimentos oculares para compensar os movimentos da cabeça³, o OKR é iniciado na retina pelo disparo de ON e subsequente sinalização para o Sistema Óptico Acessório (AOS) no mesencéfalo ^4,5. Devido à sua dependência direta dos circuitos da retina, o OKR tem sido frequentemente usado para determinar a capacidade de rastreamento visual em ambientes clínicos e de pesquisa ^6,7.

O OKR tem sido estudado extensivamente como uma ferramenta para avaliar a capacidade visual básica ^2,6,8, o desenvolvimento de DSGC ^9,10,11,12, respostas oculomotoras¹³ e diferenças fisiológicas entre os antecedentes genéticos⁷. A OKR é avaliada em animais com cabeça fixa e com estímulo em movimento¹⁴. As respostas oculomotoras são normalmente capturadas usando uma variedade de ferramentas de vídeo, e os movimentos de rastreamento ocular são capturados como formas de onda OKR nas direções horizontal e vertical⁹. Para quantificar a capacidade de rastreamento, duas métricas primárias foram descritas: ganho de rastreamento (a velocidade do olho em relação à velocidade do estímulo) e frequência ETM (o número de sacadas de fase rápida em um determinado período de tempo). O cálculo do ganho tem sido usado historicamente para medir diretamente a velocidade angular do olho para estimar a capacidade de rastreamento; no entanto, esses cálculos são trabalhosos e podem ser derivados arbitrariamente com base em métodos de coleta de vídeo-oculografia e quantificação subsequente. Para uma avaliação mais rápida do OKR, a contagem da frequência do ETM tem sido usada como um método alternativo para medir a acuidade de rastreamento⁷. Embora isso forneça uma estimativa bastante precisa da capacidade de rastreamento, esse método depende de uma métrica indireta para quantificar a resposta de fase lenta e introduz vários vieses. Isso inclui um viés do observador na determinação da sacádica, uma dependência de respostas sacádicas temporalmente consistentes em uma época definida e uma incapacidade de avaliar a magnitude da resposta de fase lenta.

Para abordar essas preocupações com as abordagens atuais de avaliação de OKR e permitir uma quantificação aprofundada de alto rendimento dos parâmetros OKR, desenvolvemos um novo método de análise para quantificar as formas de onda OKR. Nossa abordagem usa uma plataforma de software acessível baseada em Python chamada "PyOKR". Usando este software, a modelagem e quantificação das respostas de fase lenta OKR podem ser estudadas em maior profundidade e com maior parametrização. O software fornece avaliações quantitativas acessíveis e reprodutíveis de respostas a uma miríade de estímulos visuais e também rastreamento visual bidimensional em resposta ao movimento horizontal e vertical.

Protocolo

Todos os experimentos com animais realizados na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins (JHUSOM) foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no JHUSOM. Todos os experimentos realizados na Universidade da Califórnia, São Francisco (UCSF) foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Programa Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF.

1. Coleta de dados comportamentais

1. Registre os movimentos oculares OKR usando o método de vídeo-oculografia de escolha para gerar dados de onda (ou seja, uma série temporal do ângulo do olhar do olho em coordenadas esféricas).
   NOTA: Os dados representativos coletados no JHUSOM foram obtidos por meio de cirurgia de implante de cabeceira e vídeo-oculografia, conforme descrito anteriormente ^9,13 (Figura 1). Os dados representativos coletados da UCSF foram obtidos por meio da cirurgia de implante de cabeceira e do método de video-oculografia, conforme descrito anteriormente¹⁰ (Figura 7).
   1. Anote os parâmetros de estímulo e gravação: taxa de quadros de gravação, velocidade e direção do estímulo e períodos de tempo entre e após as épocas do estímulo. Para estímulos senoidais, observe também a amplitude e a frequência da onda de estímulo.
2. Exporte os dados de onda coletados como um arquivo . CSV contendo dados de onda horizontal e vertical (azimute e elevação).
   1. Organize os dados da onda como um arquivo . CSV com duas colunas contendo dados horizontais (epxWave) e dados verticais (epyWave).

2. Instalação de software de análise

1. Baixe e instale o Python.
   1. Para supervisão de gráficos, instale o Spyder via Anaconda.
   2. Para garantir que os gráficos funcionem corretamente no Spyder, vá para Ferramentas > Preferências > Console Ipython > Backend de gráficos > gráficos. Defina Inline como Automático.
2. Crie um novo ambiente Anaconda com Python.
3. Instale o PyOKR via PyPi com pip install PyOKR para instalar a versão mais recente junto com as dependências do pacote (Arquivo de Codificação Suplementar 1 e Arquivo de Codificação Suplementar 2)
4. Se um computador Windows estiver sendo usado, execute a partir do OKR_win de importação PyOKR como o e, em seguida, o.run().
5. Se um computador Mac estiver sendo usado, execute a partir do PyOKR import OKR_osx as o e, em seguida, o.run().

3. Análise de dados de ondas

1. Inicialização de análises e importações de arquivos
   1. Execute o.run() em um script .py para abrir a interface do usuário.
   2. Em Arquivo, use a função Abrir ou o comando Ctrl+O [comando iOS] para abrir um navegador que permitirá ao usuário selecionar o arquivo de onda desejado.
   3. Em Arquivo, use o botão Exportar pasta ou o comando Ctrl+E para abrir um navegador de pastas que permitirá a seleção de uma pasta de saída para a qual as análises finais serão exportadas.
   4. Insira o nome do arquivo de análise final no arquivo de saída em um formato recomendado, como AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Defina o programa para um animal individual usando o comando Definir assunto em Arquivo ou o comando Ctrl+S para inicializar o conjunto de dados de um animal individual.
2. Definição de parâmetros do arquivo de onda
   1. Para começar a definir os parâmetros de estímulo, defina a direcionalidade em Selecionar direção do estímulo selecionando uma das quatro direções cardeais. Para estímulos senoidais, selecione um que contenha (Horizontal) ou (Vertical) de acordo, com a direção cardinal definindo a direção inicial da onda senoidal.
   2. Defina o tipo de estímulo em Selecionar tipo de estímulo como Unidirecional, Oscilatório ou Oblíquo.
   3. Depois de definir a direcionalidade, importe o próprio conjunto de dados de posição de estímulo (Importar dados de vetor de estímulo próprio) ou gere automaticamente um vetor com base em parâmetros (Gerar vetor de estímulo a partir de parâmetros). Se estiver importando um vetor de estímulo, prossiga com 3.2.3.1 e pule para a etapa 3.3. Se estiver gerando um vetor de estímulo, prossiga com as próximas etapas.
      1. Se estiver importando seus próprios dados vetoriais, importe os valores de distância do estímulo (ou seja, uma série temporal que descreve a distância que o estímulo se move entre cada quadro de aquisição adjacente) no mesmo formato descrito na etapa 3.2.1. Além disso, analise todo o conjunto de dados como uma época em vez de dividi-lo em épocas individuais, pois a funcionalidade para subconjunto de valores de estímulo importados não foi adicionada a partir do PyOKR v1.1.2.
   4. Em Parâmetros de estímulo, defina os parâmetros do estímulo usado para coleta de dados.
      1. Defina o período de tempo sem estímulo no início (cabeça) e no final (cauda) de uma determinada tentativa com Cabeça e Cauda.
      2. Defina a quantidade de tempo que um estímulo é mostrado, a quantidade de tempo sem estímulo após e o número de épocas totais em uma determinada tentativa com Duração da época, Duração do pós-estímulo e Número de épocas, respectivamente.
      3. Para estímulos unidirecionais e oblíquos, defina a velocidade do estímulo em graus por segundo com Velocidade horizontal e Velocidade vertical.
      4. Defina a taxa de captura da câmera de coleta com Taxa de quadros de captura.
      5. Para estímulos senoidais, gere a onda senoidal para modelar estímulos oscilatórios com Frequência e Amplitude.
   5. Após a parametrização, faça o modelo apropriado a partir das informações de estímulo inseridas acima com Gerar vetor de estímulo a partir de parâmetros.
   6. Selecione uma determinada época para o estímulo inserido usando Selecionar época para percorrer o arquivo de onda total.
3. Seleção supervisionada de fases de rastreamento
   1. Para identificar regiões de rastreamento lento, selecione automaticamente sacadas de fase rápida com ajuste preliminar clicando em Dados não filtrados ou Dados filtrados, que rotularão sacádicos potenciais com base nas mudanças de velocidade máxima.
   2. Em Dados não filtrados, confirme se as sacádicos são selecionadas com precisão com um ponto azul. Se a seleção automática não for precisa, remova manualmente os pontos com o botão esquerdo do mouse (LMB) ou adicione pontos com o botão direito do mouse (RMB). Quando as sacadas de fase rápida forem selecionadas adequadamente, salve os pontos com o botão do meio do mouse (MMB) e feche o gráfico.
   3. Se a filtragem automática for desejada, defina um Limite de pontuação Z e clique em Dados filtrados para filtrar sacada automaticamente. Se necessário, use a mesma supervisão manual descrita na etapa 3.3.2 para remover qualquer ruído.
   4. Após a seleção adequada da sacada, pressione Ajuste de ponto para selecionar a região a ser removida. Altere os pontos superior e inferior por meio de um esquema de controle semelhante, conforme descrito anteriormente na etapa 3.3.2. Edite os pontos superiores (verdes) com o LMB ou o RMB e edite os pontos inferiores (vermelhos) com Shift+LMB ou Shift+RMB. Quando os pontos estiverem posicionados corretamente, use o MMB para salvá-los.
      NOTA: se estiver usando um Mac, o ajuste do ponto inferior e superior está em dois botões separados e segue o mesmo esquema de controle descrito na etapa 3.3.2.
4. Análise de fases de rastreamento lento
   1. Defina a ordem do modelo polinomial usando Definir ordem polinomial para definir o modelo polinomial que será ajustado a fases lentas individuais.
      NOTA: Para estímulos unidirecionais ou oblíquos, o valor padrão é 1, pois a linearidade é necessária para calcular o ganho de rastreamento. Para estímulos senoidais, uma ordem superior é necessária para modelar a curva da onda, com um padrão de 15.
   2. Para analisar o traço, selecione Análise Final para gerar os modelos de fase lenta (Figura 2) para as fases lentas selecionadas (consulte a Figura 2A-D) e calcule as distâncias, velocidades e ganhos de rastreamento médios ao longo da época (Figura 2E).
   3. Para exibir o gráfico bidimensional (2D) ou tridimensional (3D) das regiões selecionadas, selecione Exibir gráfico 2D ou Exibir gráfico 3D , respectivamente.
   4. Selecione Adicionar época para salvar os valores coletados gerados na etapa 3.4.2. Para exibir todos os valores adicionados para um determinado animal, bem como as médias dos ensaios coletados, selecione Exibir conjunto de dados atual.
   5. Depois que uma época for adicionada, percorra o restante do arquivo com Selecionar época, seguindo as etapas 3.3.1 a 3.4.4.
   6. Depois que um arquivo de onda for totalmente analisado, repita esse processo para todos os outros arquivos de um determinado animal, abrindo novos arquivos, definindo os parâmetros apropriados e analisando-os de acordo. Repetindo as etapas 3.2.1-3.4.5 para cada arquivo, gere um conjunto de dados final contendo todos os dados de onda de um determinado animal.
5. Exportação final de dados
   1. Após a conclusão da análise de dados para um determinado animal, com todas as direções ou estímulos analisados, exporte o conjunto de dados por meio de Exportar dados.
      NOTA: O conjunto de dados bruto será exportado com base no nome do arquivo de saída e salvo ao longo do caminho definido pela pasta de saída como um CSV contendo dados de época individuais com a média total de cada parâmetro de estímulo.
   2. Depois de exportar um animal individual, reinicialize o conjunto de dados com Ctrl+S e repita todas as etapas anteriores para analisar um novo animal.
   3. Se necessário, reorganize todos os dados de saída coletados para vários animais para facilitar a análise usando o comando Classificar dados na guia Análise .
      NOTA: Esta função compilará e classificará todos os valores médios de todos os arquivos de animais analisados armazenados na pasta de saída para permitir a geração mais fácil de gráficos e comparações estatísticas. A classificação depende da nomenclatura dos arquivos a partir da v1.1.2. Use o esquema de nomenclatura recomendado conforme descrito na etapa 3.1.4 para cada arquivo (por exemplo, WT_123_Analysis).

Resultados

Para validar o método de análise descrito acima, quantificamos o ganho de rastreamento OKR em traços de onda coletados de camundongos do tipo selvagem e um mutante nocaute condicional com um déficit de rastreamento conhecido. Além disso, para testar a aplicabilidade mais ampla de nosso método de análise, analisamos traços derivados de uma coorte separada de camundongos do tipo selvagem adquiridos usando um método diferente de coleta de video-oculografia. A filtragem automática de sacádicos facilita o processamento e a análise de dados OKR (Figura 3). Usando registros de estímulos unidirecionais e senoidais (Figura 1D), calculamos os ganhos de rastreamento OKR nas quatro direções cardeais (Figura 2F) para animais selvagens (n = 13) para estímulos unidirecionais e também rastreamos os ganhos em resposta a estímulos senoidais horizontais e verticais (Figura 4). A disparidade na capacidade de rastreamento em relação à direção do estímulo para estímulos unidirecionais e senoidais é consistentemente observada em todos os camundongos do tipo selvagem, com respostas horizontais igualmente robustas que demonstram ganhos de rastreamento significativamente maiores do que as respostas verticais, como foi descrito². Além disso, ganhos de rastreamento assimétrico entre as respostas para cima e para baixo também são observados em camundongos do tipo selvagem usando ambos os métodos de coleta de vídeo-oculografia, como foi relatado anteriormente ^2,10. As magnitudes relativas e a consistência dos ganhos de rastreamento em comparação com a caracterização publicada das respostas OKR indicam que os ganhos de rastreamento calculados usando o software refletem com precisão a capacidade de rastreamento. Além dos cálculos de ganho unidirecional, o movimento ocular horizontal e vertical pode ser modelado simultaneamente (Figura 5), permitindo uma reconstrução tridimensional do movimento ocular em resposta a um determinado estímulo. Isso fornece uma capacidade de quantificação adicional que é útil para estudos futuros que investigam respostas horizontais e verticais acopladas cruzadas⁹.

Para validar a utilidade do software para identificar mudanças comportamentais significativas em diferentes condições experimentais, reanalisamos nossos dados publicados⁹ para confirmar que os déficits no rastreamento vertical avaliados naquele estudo pela contagem manual de sacadas de fase rápida são refletidos no rastreamento de ganhos usando a metodologia aqui apresentada. Trabalhos anteriores mostram que a inativação genética na retina do fator de transcrição T-box Transcription Factor 5 (Tbx5) por nocaute condicional usando protocaderina 9-Cre (Pcdh9-Cre) causa perda específica de células ganglionares seletivas de direção ON sintonizadas para cima (up-oDSGCs), e que Tbx5 Flox / Flox (Tbx5f / f); Os mutantes Pcdh9-Cre exibem perda específica de rastreamento OKR vertical⁹. A análise quantitativa usando o método descrito aqui mostra que Tbx5f/f; Os animais Pcdh9-Cre mantêm ganhos normais de rastreamento horizontal (Figura 6A), semelhantes aos descritos anteriormente e obtidos por contagem manual de sacádicos de fase rápida (ETMs) (Figura 2F); no entanto, esses camundongos mostram perda significativa de rastreamento vertical, com ganhos quase nulos em resposta a estímulos para cima e para baixo (Figura 6B, C). Além disso, a análise das respostas senoidais confirma que os animais Tbx5 cKO exibem maiores ganhos de rastreamento horizontal, mostrando rastreamento vertical significativamente diminuído (Figura 6D-F). Uma reanálise desse fenótipo descrito anteriormente usando PyOKR demonstra a precisão e sensibilidade dessa nova metodologia, que permite comparações quantitativas das respostas OKR em camundongos de diferentes cepas genéticas.

Finalmente, analisamos traços verticais de OKR do tipo selvagem coletados na UCSF para validar a utilidade do aplicativo de software com diferentes métodos de videooculografia e parâmetros de estímulo. Os dados do UCSF foram coletados usando um sistema de projeção hemisférica no qual grades móveis são apresentadas ao camundongo por meio da reflexão de um projetor de comprimento de onda de 405 nm em um hemisfério ao redor do animal com a cabeça fixa¹⁰ (Figura 7A). Grades verticais unidirecionais foram apresentadas a camundongos a uma velocidade de 10 graus por segundo, e as respostas OKR foram registradas em intervalos de 60 s ( Figura 7B , C ). Os traços verticais foram analisados quantitativamente por meio do PyOKR, e as respostas para cima foram comparadas com as respostas para baixo (Figura 7D). As respostas para cima foram significativamente mais fortes do que para baixo, como esperado¹⁰; no entanto, os ganhos de rastreamento foram ligeiramente reduzidos em comparação com os traços registrados no JHUSOM (Figura 2F). Além disso, a quantificação das respostas senoidais foi analisada via PyOKR (Figura 7E), e uma assimetria significativa nas respostas verticais a estímulos em movimento senoidal é refletida nos ganhos calculados (Figura 7F). As diferenças entre os valores de ganho coletados no JHUSOM e no UCSF podem ser atribuídas a diferenças entre os parâmetros de estímulo, incluindo diferentes velocidades, tipos e comprimentos de onda de estímulo; no entanto, a consistência geral que observamos em nossa análise dos dados obtidos usando cada método de coleta mostra que nosso PyOKR pode ser facilmente adaptado além do nosso sistema de coleta de dados JHUSOM OKR e aplicado a outras gravações OKR, independentemente dos métodos de video-oculografia. Esses resultados demonstram que a plataforma de software descrita aqui é precisa e pode ser aplicada de forma geral ao estudo das respostas oculomotoras, permitindo comparações quantitativas precisas entre animais pertencentes a diferentes grupos para aprofundar o estudo dos circuitos de estabilização de imagem visual.

Figura 1: Coleta de dados de resposta OKR. (A) Aparelho de arena virtual OKR para estimulação comportamental, conforme descrito anteriormente ^9,13. Quatro monitores cercam um animal com a cabeça fixa (1), exibindo um estímulo quadriculado em movimento contínuo (2). O tambor virtual pode apresentar movimento unidirecional em todas as quatro direções cardeais, bem como estímulos sinusoidais oscilatórios. O olho esquerdo do mouse é iluminado por uma luz infravermelha (IR) e gravado com uma câmera (3) para registrar as respostas do sistema visual refletidas no rastreamento ocular. (B) A análise do rastreamento ocular ocorre capturando a pupila e um reflexo da córnea gerado pela luz infravermelha. A coleta de dados e o cálculo dos movimentos oculares em resposta ao tambor virtual foram realizados conforme descrito anteriormente ^9,13. (C) Esquema dos vetores oculares movendo-se verticalmente (onda Y) e horizontalmente (onda X). (D) Traços de amostra da resposta de rastreamento de um olho ao movimento unidirecional para cima e para trás, e também movimento senoidal vertical e horizontal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise de rastreamento de respostas visuais unidirecionais. (A-D) Identificação e seleção de fases de rastreamento lento para análise de ganho. Os traços unidirecionais da amostra são mostrados com respostas visuais ao movimento para frente (A), para trás (B), para cima (C) e para baixo (D) em relação ao olho do camundongo. As fases lentas são identificadas pela adição de pontos vermelhos e verdes descritos na Etapa 3 para remover sacadas, e as fases lentas selecionadas são destacadas em amarelo. As regressões polinomiais são sobrepostas nos traços como linhas. (E) Quantificação dos traços da amostra (A-D) conforme organizado na leitura do PyOKR. Para cada traço, são calculadas as velocidades totais de XY e os respectivos ganhos, independentemente da direcionalidade. Em respostas unidirecionais, essas velocidades totais geralmente refletem a velocidade individual em uma determinada direção; no entanto, para respostas senoidais, esse valor refletirá a velocidade geral média do olho. Os componentes de velocidade horizontal e vertical são divididos para mostrar a velocidade em cada direção respectiva. O ganho é então calculado com base nas velocidades de estímulo apresentadas. (F) Ganhos de rastreamento calculados de animais selvagens (n = 13) nas quatro direções cardeais em comparação com a quantificação ETM associada. Os dados são apresentados como média ± DP. Dados analisados com uma ANOVA de uma via com comparações múltiplas. *p<0,05, **p<0,01,***p<0,005, ****p<0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A filtragem automática de sacádicos facilita o processamento e a análise de dados OKR. (A-D) A filtragem automática de traços da Figura 2A-D remove sacádicos e modela apenas o movimento de fase lenta, removendo mudanças rápidas de velocidade e costurando fases lentas. A inclinação final representa o movimento total do olho ao longo de uma determinada época. (E) Quantificação dos ganhos dos dados da amostra filtrada, conforme organizado na leitura do PyOKR. (F) A comparação dos valores de ganho entre traços oculares de amostra não filtrados e filtrados não reflete diferenças significativas. Os dados são apresentados como média ± DP. Dados analisados com um teste U de Mann-Whitney entre resultados não filtrados e filtrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Derivação de ganhos de rastreamento em resposta a estímulos visuais oscilatórios. (A, B) As respostas do movimento ocular vertical (A) e horizontal (B) a estímulos em movimento sinusoidal podem ser modeladas em relação aos parâmetros de estímulo oscilatório definidos. As regiões selecionadas são rotuladas em amarelo com a aproximação polinomial sobreposta na parte superior do traço. Um modelo do estímulo é apresentado como uma onda sinusóide laranja atrás do traço para permitir a referência ao que é o estímulo em cada ponto. (C) Os cálculos de ganho das respostas sinusoidais do tipo selvagem (n = 7) refletem as respostas assimétricas entre a capacidade de rastreamento horizontal e vertical. Os dados são apresentados como média ± DP. Dados analisados com uma ANOVA de uma via com comparações múltiplas. **p<0,01,***p<0,005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O rastreamento direcional pode ser modelado em seus componentes horizontal e vertical. (A) Componente vertical de uma onda de rastreamento ocular em resposta a um estímulo ascendente. (B) Componente horizontal de uma onda de rastreamento ocular em resposta a um estímulo ascendente. (C) Trajetória geral do olho nas direções vertical e horizontal. (D) Modelo tridimensional do vetor de movimento do olho ao longo do tempo em resposta ao movimento descendente. Os dados brutos de rastreamento são exibidos em vermelho e o modelo de regressão da trajetória é exibido em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise do OKR em Tbx5f/f; Os camundongos Pcdh9-Cre mostram déficits significativos nos ganhos de rastreamento vertical unidirecional. (A) Tbx5f/f; Animais Pcdh9-Cre não apresentam mudança significativa no ganho de rastreamento horizontal. (B, C) Tbx5f/f; Os animais Pcdh9-Cre apresentam uma redução significativa do ganho em suas respostas verticais: para cima (B) e para baixo (C). (D, E) Respostas sinusoidais de Tbx5f/f; Animais Pcdh9-Cre em resposta a estímulos oscilatórios horizontais (D) e verticais (E). (f) Quantificação de Tbx5f/f; As respostas oscilatórias de Pcdh9-Cre mostram aumentos significativos nos ganhos de rastreamento horizontal, mas mostram diminuições nas respostas verticais. Os dados são apresentados como média ± DP. Dados analisados com o teste U de Mann-Whitney. *p<0,05, **p<0,01, **** p<0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Aplicação de PyOKR a dados adquiridos de métodos alternativos de video-oculografia. (A) Aparelho para estimulação de tambor virtual OKR, conforme descrito¹⁰. Um projetor DLP de comprimento de onda de 405 nm é refletido por meio de um espelho convexo em um hemisfério para criar um tambor virtual que envolve o campo de visão do animal. Os movimentos oculares são medidos usando uma câmera NIR posicionada fora do hemisfério. Grades de barra unidirecionais e senoidais são mostradas a um animal com a cabeça fixa em direções verticais. (B, C) As fases de rastreamento ascendente (B) e descendente (C) são identificadas e selecionadas para análise quantitativa. As fases lentas são destacadas em amarelo. (D) Ganhos de rastreamento calculados a partir do rastreamento vertical de animais selvagens (n = 5) usando os métodos descritos aqui. Observa-se uma capacidade de rastreamento assimétrico, com uma diminuição significativa no rastreamento descendente. (E) Resposta oscilatória a estímulos senoidais modelados para quantificar ganhos de rastreamento em animais selvagens (n = 8). As fases lentas são destacadas em amarelo. (F) A quantificação dos ganhos senoidais revela ganhos de rastreamento descendentes reduzidos em comparação com ganhos ascendentes. Os dados são apresentados como média ± DP. Dados analisados com o teste U de Mann-Whitney. *p<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo de codificação suplementar 1: PyOKR Windows Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: PyOKR Mac Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O PyOKR oferece várias vantagens para estudar as respostas visuais refletidas nos movimentos oculares. Isso inclui opções de precisão, acessibilidade e coleta de dados, além da capacidade de incorporar parametrização e velocidades de estímulo variáveis.

A avaliação direta do ganho de rastreamento ocular fornece uma caracterização precisa do movimento ocular que é uma métrica quantitativa mais direta do que a contagem manual tradicional de sacadas de fase rápida (ETMs). Embora útil, a contagem de sacádicos fornece uma avaliação indireta do movimento real de rastreamento. A plataforma de software PyOKR fornece quantificação direta das velocidades de rastreamento, levando em consideração parâmetros adicionais, incluindo amplitudes sacádicas e a duração das fases lentas. Além disso, a contagem de sacádicos em fase rápida depende da avaliação da frequência sacádica durante um determinado período de tempo, exigindo que cada traço tenha pouco ou nenhum ruído, incluindo sacádicos aleatórios de estresse animal. Esses fatores resultam em muitos vestígios coletados inutilizáveis e, portanto, adicionam um tempo significativo para a coleta de dados, a fim de avaliar com precisão o rastreamento ocular. No entanto, o software descrito aqui aborda esse problema quantificando diretamente as fases lentas individuais dentro de um determinado traço e calculando os ganhos em pontos instantâneos ao longo do traço. Ele consegue isso comparando a velocidade do movimento do olho com a velocidade do estímulo em um determinado ponto. Como a frequência sacádica não é mais o parâmetro definidor da análise, o ruído pode ser facilmente removido pela supervisão do usuário, reduzindo o impacto do ruído na qualidade da análise. Isso permite dados coletados mais utilizáveis e maior poder estatístico ao analisar esses dados, aumentando a precisão e a reprodutibilidade ao quantificar o rastreamento ocular e caracterizar os parâmetros OKR para camundongos individuais e diferentes grupos de camundongos. A filtragem automatizada de sacadas com base em mudanças rápidas na velocidade ocular encontradas por meio de um método Z-score também foi usada para caracterizar o ganho de rastreamento¹⁰. Para incorporar esse método de filtragem no software, incluímos esse tipo de filtragem de velocidade, mas com ferramentas adicionais, como parametrização de limite e supervisão sacádica manual para reduzir possíveis erros gerados por essa abordagem. Se traços brutos forem usados para análise em vez de usar filtragem automatizada, mudanças rápidas no movimento ocular causadas por sacadas, piscadas ou angústia do mouse são identificadas por meio de mudanças de velocidade máxima por meio de uma estimativa de densidade de kernel gaussiano da velocidade do traço. Isso permite a seleção automática de regiões de segmentação e, eventualmente, a remoção com base na supervisão manual do usuário. A supervisão manual fornece uma maior tolerância a traços ruidosos, permitindo que os usuários corrijam rapidamente marcações falsas positivas ou falsas negativas para mudanças rápidas nos olhos. Além disso, como o PyOKR usa aproximações polinomiais para modelar o movimento geral dos olhos em uma determinada direção, o ruído em pontos individuais é suavizado, permitindo que as velocidades da trajetória sejam avaliadas com alguma tolerância ao ruído no traço. Somente no caso de qualidade de dados extremamente ruim em todo o traço ou calibração inadequada durante a coleta de dados, o software não poderá gerar análises de dados precisas. Em conjunto, ao incorporar ferramentas de supervisão do usuário, filtragem e cálculo de ganho instantâneo, o aplicativo de software PyOKR descrito aqui gera ganhos de rastreamento com alta precisão e métricas mais diretas do que os métodos anteriores.

O PyOKR também possui muitos recursos que permitem que as análises de OKR sejam personalizadas para atender às necessidades do usuário. A entrada de parâmetros de estímulo, bem como vetores de estímulo brutos, permite ao usuário definir com precisão qualquer estímulo desejado. Isso pode incluir estímulos unidirecionais, sinusoidais ou oblíquos, todos os quais o software pode usar para gerar ganhos de rastreamento precisos para as respostas visuais associadas. Com a parametrização de estímulo desta metodologia, os ganhos instantâneos calculados em cada quadro podem ser gerados de forma confiável com alta precisão, independentemente do estímulo inserido. Embora os dados de estímulos oblíquos não tenham sido analisados aqui, ganhos precisos podem ser calculados por meio de vetores de velocidade XY decompostos para reconstruir um ângulo oblíquo, permitindo cálculos precisos de ganho de estímulos oblíquos. Por meio da parametrização acessível das configurações de estímulos, nossa ferramenta é amplamente aplicável ao rastreamento de ondas em resposta a qualquer estímulo visual. Além disso, o software facilita maior rendimento e quantificação reprodutível em comparação com os métodos anteriores. A classificação por meio de rastreamentos OKR é demorada e trabalhosa; no entanto, a interface de usuário simplificada do PyOKR é capaz de filtrar facilmente muitos rastreamentos a uma taxa mais alta do que era possível anteriormente. Isso não apenas permite uma quantificação mais rápida do traço, mas também revela parâmetros adicionais de OKR, incluindo quantificação direta das velocidades dos olhos, componentes vetoriais direcionais do movimento ocular e ganhos instantâneos em relação ao estímulo nos componentes horizontal e vertical do vetor de movimento. Além disso, dada a identificação automatizada de sacádicos e o cálculo das velocidades de rastreamento proporcionadas por nosso método, o potencial viés do experimentador na análise de dados é bastante reduzido em comparação com outros métodos de quantificação, como contagem manual de ETM ou filtragem automatizada de rastreamento, que podem gerar falsos negativos. Além disso, grandes quantidades de dados comportamentais podem ser geradas e compiladas automaticamente para análise simplificada a jusante. Por meio das funções de exportação e classificação de dados disponíveis no PyOKR, os dados de rastreamento de vários animais e condições podem ser processados automaticamente para permitir o armazenamento organizado de dados, bem como uma análise estatística rápida. Para a realização de experimentos que empregam várias condições durante a mesma sessão de gravação, como manipulação de circuitos ou respostas visuais, recomendamos a coleta de dados em arquivos de ondas discretas ou épocas subdivididas que permitem o armazenamento de conjuntos de dados separados com base nas variáveis independentes de interesse derivadas desta única sessão de gravação. Um exemplo seria se alguém estiver testando diferenças nas respostas a diferentes frequências de ondas senoidais dentro de um paradigma experimental, recomendamos salvar diferentes parâmetros em diferentes arquivos de onda para análise separada, como WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis e WT_1_Freq0.3Analysis. Na versão atual, uma vez que as épocas são analisadas, não há funcionalidade para selecionar valores de época individuais no conjunto de dados, embora isso possa ser adicionado no futuro, se necessário.

Finalmente, nosso método é adaptável a vários métodos de coleta de vídeo-oculografia e fornece uma plataforma de análise robusta que pode ser facilmente adaptada às necessidades específicas de um laboratório. Por meio da análise de dados OKR de tipo selvagem e mutantes existentes, e também dados de OKR de tipo selvagem coletados usando diferentes métodos e estímulos, mostramos aqui que nossa ferramenta de análise é capaz de a) quantificar o rastreamento de OKR de qualquer estímulo direcional com alta precisão e rendimento; b) identificar diferenças comportamentais do sistema visual resultantes de perturbações genéticas; e c) avaliar dados de rastreamento visual de diferentes métodos de video-oculografia. A acessibilidade e a adaptabilidade geral de nossa plataforma de análise facilitam o estudo adicional das respostas OKR e aprimorarão os estudos comportamentais que caracterizam a montagem e a dinâmica do circuito neural no contexto das respostas oculomotoras.

Para obter medições precisas e subsequentes análises de dados úteis, várias etapas são necessárias para a coleta de dados. Recomendamos coletar dados OKR em várias sessões para permitir que o animal se acostume ao aparato de teste comportamental e reduza o impacto do estresse animal nas respostas comportamentais; no entanto, o registro excessivo pode levar à potencialização da resposta OKR¹³, portanto, recomenda-se cuidado na elaboração de regimes de teste. Durante a coleta de dados OKR, a calibração adequada do equipamento de video-oculografia é fundamental para uma quantificação precisa, uma vez que a qualidade dos dados analisados é uma função direta do traço processado. É importante ressaltar que o uso do Spyder IDE é necessário para a supervisão de grafos por meio do Matplotlib. Dada a acessibilidade e o design da estrutura de nossa plataforma, todas as ferramentas necessárias estão disponíveis para que outros expandam os recursos do software e adaptem essa plataforma a paradigmas experimentais comportamentais distintos.

Em conclusão, descrevemos aqui uma ferramenta nova, acessível e versátil para a análise das respostas comportamentais do OKR com mais profundidade e com mais poder quantitativo do que está disponível atualmente usando metodologias existentes. O PyOKR pode ser facilmente usado por usuários iniciantes do Python e contém um pipeline de análise e uma interface estabelecidos para a análise rápida e precisa das ondas OKR com maior rigor e reprodutibilidade. A adaptabilidade deste software fornece uma estrutura flexível que os usuários podem adaptar facilmente para atender às suas necessidades específicas e procedimentos de coleta de dados. Prevemos que esse método quantitativo avançará no estudo das respostas oculomotoras e aprofundará nossa compreensão do desenvolvimento e da função dos circuitos neurais que impulsionam os comportamentos do sistema visual.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos C57BL/6J	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Câmara de gravação de reflexo optocinético - JHUSOM	N	/A	Conforme descrito em Al-Khindi et al.(2022)9 e Kodama et al. (2016)13
Câmara de gravação de reflexo optocinético - UCSF	Personalizado N	/A	Conforme descrito em Harris e Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Presente de B. Bruneau	N/A	Conforme descrito em Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Estoque # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD