Isolamento de Núcleos do Tecido Adiposo Intermuscular Humano e Sequenciamento de RNA de Núcleo Único a Jusante

Resumo

A biologia do tecido adiposo intermuscular (MAT) é amplamente inexplorada devido à acessibilidade limitada do tecido humano. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento de núcleos e preparação de biblioteca de IMAT humano congelado para sequenciamento de RNA de núcleo único para identificar a composição celular deste depósito adiposo único.

Resumo

O tecido adiposo intermuscular (TAMI) é um depósito adiposo relativamente pouco estudado, localizado entre as fibras musculares. O conteúdo de IMAT aumenta com a idade e o IMC e está associado a doenças metabólicas e degenerativas musculares; no entanto, uma compreensão das propriedades biológicas do IMAT e sua interação com as fibras musculares circundantes é severamente deficiente. Nos últimos anos, o sequenciamento de RNA de célula única e núcleo nos forneceu atlas específicos de vários tipos de células de tecidos humanos. No entanto, a composição celular do IMAT humano permanece amplamente inexplorada devido aos desafios inerentes à sua acessibilidade a partir da coleta de biópsia em humanos. Além da quantidade limitada de tecido coletado, o processamento do IMAT humano é complicado devido à sua proximidade com o tecido muscular esquelético e a fáscia. A natureza carregada de lipídios dos adipócitos os torna incompatíveis com o isolamento de uma única célula. Portanto, o sequenciamento de RNA de núcleo único é ideal para obter transcriptômica de alta dimensão com resolução de célula única e fornece o potencial de descobrir a biologia desse depósito, incluindo a composição celular exata do IMAT. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento de núcleos e preparação de biblioteca de IMAT humano congelado para sequenciamento de RNA de núcleo único. Este protocolo permite o perfil de milhares de núcleos usando uma abordagem baseada em gotículas, fornecendo assim a capacidade de detectar tipos de células raras e pouco abundantes.

Introdução

O tecido adiposo intermuscular (TAMI) é um depósito adiposo ectópico que reside entre e ao redor das fibras musculares¹. Conforme descrito em detalhes em uma revisão recente de Goodpaster et al., o IMAT pode ser detectado usando tomografia computadorizada (TC) de alta resolução e ressonância magnética (RM) (Figura 1A,B) e é encontrado ao redor e dentro das fibras musculares em todo o corpo¹. A quantidade de IMAT varia muito entre os indivíduos e é influenciada pelo IMC, idade, sexo, raça e sedentarismo ^2,3,4. Além disso, a deposição de IMAT é comumente observada em condições patológicas associadas à degeneração muscular⁵, e vários estudos documentaram aumento da massa de IMAT em indivíduos com obesidade, diabetes tipo 2, síndrome metabólica e resistência à insulina ^6,7,8,9. No entanto, as propriedades celulares e biológicas do IMAT estão apenas começando a ser desvendadas. A acessibilidade limitada e a variação nos locais e conteúdo do IMAT em todo o corpo desafiaram a coleta de amostras deste depósito adiposo único². Além disso, as amostras são facilmente "contaminadas" com músculo esquelético (MS) após a coleta, dificultando a separação entre a contribuição biológica dos diferentes tecidos (Figura 1C). Para esse fim, o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq), que ganhou considerável atenção durante a última década, serve como uma metodologia ideal para permitir a separação de padrões de expressão gênica derivados de IMAT e SM com resolução de célula única. Além disso, o isolamento de núcleos é particularmente útil para o tecido adiposo devido aos grandes adipócitos carregados de lipídios, que são impossíveis de dissociar em suspensão unicelular sem comprometer a integridade das células. Por fim, essa tecnologia tem o potencial de descobrir novos marcadores de adipócitos específicos do IMAT e descobrir a composição e a presença de diferentes populações de células progenitoras, bem como estudar a variação da composição celular em condições patológicas e normais.

Figura 1: Imagens do IMAT. Imagem representativa de ressonância magnética (MRI) de IMAT de (A) uma mulher magra de meia-idade e (B) um homem de meia-idade com obesidade. Vermelho: tecido adiposo subcutâneo, amarelo: tecido adiposo intermuscular, verde: músculo esquelético, azul: osso. Imagem cortesia de Heather Cornnell, AdventHealth Translational Research Institute. (C) Amostra de tecido fresco com IMAT (circundada por linha preta tracejada). Imagem cortesia de Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute e Bryan Bergman, Universidade do Colorado. Essa figura foi modificada com permissão de Goodpaster et ^al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vários estudos foram publicados na indústria pecuária investigando o marmoreio da carne (IMAT em particular) em porcos, galinhas e bovinos usando célula única (sc) e snRNA-seq¹⁰. Esses estudos identificaram várias subpopulações de adipócitos e marcadores de potenciais células progenitoras de IMAT 11,12,13; no entanto, não se sabe se essas composições celulares se traduzem em IMAT humano. Até onde sabemos, apenas um estudo analisou a heterogeneidade celular do músculo humano com infiltração gordurosa, obtida de pacientes do sexo masculino com osteoartrite do quadril, usando snRNA-seq¹⁴. Os pesquisadores relataram uma pequena população de adipócitos e várias subpopulações de progenitores fibroadipogênicos (FAP) dentro da grande população de mionúcleos¹⁴. Nosso estudo é o primeiro a desenvolver um método para interrogar diretamente o IMAT dissecado manualmente do músculo humano quanto à composição celular usando snRNA-seq.

É importante ressaltar que os protocolos para snRNA-seq precisam ser personalizados para o tecido específico estudado, pois a quantidade de tecido disponível e as propriedades físicas do tecido específico ditarão as etapas ideais de processamento. O rendimento tecidual para IMAT é tipicamente pequeno, muitas vezes não excedendo 50 mg, mesmo ao realizar biópsias guiadas por ultrassom. Portanto, o processamento adequado desse tecido escasso é essencial. Acreditamos que este protocolo servirá como um recurso valioso para pesquisadores que estudam IMAT humano.

Protocolo

A amostra utilizada para esse protocolo fez parte do Estudo de Músculo, Mobilidade e Envelhecimento (SOMMA)^15, que foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Western IRB-Copernicus Group (WCG) e foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque. Os participantes forneceram consentimento informado por escrito para sua participação no estudo.

NOTA: Este protocolo é adaptado de um protocolo anterior usando 100 mg de tecido adiposo subcutâneo abdominal humano em uma plataforma baseada em nanopoços¹⁶. O protocolo atual é otimizado para 50 mg de IMAT humano e preparação de biblioteca usando uma plataforma baseada em gotículas. Pode ser necessária uma otimização adicional deste protocolo para isolamentos de núcleos de IMAT não humano ou outros depósitos adiposos.

1. Preparação de tampões e reagentes (Tabela 1 e Tabela 2)

NOTA: Prepare os tampões frescos no dia do experimento e não reutilize.

1. Pré-arrefecer uma centrífuga a 4 °C.
2. Prepare o tampão de homogeneização e o meio de isolamento dos núcleos.
   1. Obtenha dois baldes de gelo e pré-resfrie 2 tubos cônicos de 15 mL.
   2. Misture todos os reagentes para o tampão de homogeneização (HB) em um tubo cônico de 15 mL na ordem listada na Tabela 1. Mantenha no gelo. Misture por vórtice.
   3. Misture todos os reagentes para o meio de isolamento de núcleos (como secundário) num tubo cónico de 15 ml na lista ordenada do quadro 2. Mantenha no gelo. Misture por vórtice.
   4. Prepare 10% de Triton-X adicionando 100 μL de Triton X-100 a 900 μL de água livre de nuclease. Vórtice para garantir a mistura adequada. Manter à temperatura ambiente (RT).

Reagente	Volume (μL)		Concentração final (mM)
	1x	2x
1 M MgCl2	10	20	5
Tampão Tris de 1 M, pH 8,0	20	40	10
2 M KCl	25	50	25
1,5 M Sacarose (-4oC)	334	668	250
1mM TDT	2	4	0,001 (~1 μM)
100x inibidor de protease	20	40	1x
Superasina 20 U/μL	40	80	0,4 U/μL
Água livre de nuclease	1549	3098	-
Total Volume	2000	4000	-

Tabela 1: Tampão de homogeneização (HB). Mantenha no gelo. Misture por vórtice.

Reagente	Volume (μL)		Concentração final (mM)
	1x	2x
EDTA	0.4	0.8	0.1
Inibidor de RNAse de Ribolock (40U/μL)	40	80	0,8 U/μL
1% BSA-PBS (-/-)	1959.6	3919.2	-
Total Volume	2000	4000	-

Tabela 2: Meio de isolamento de núcleos (como secundário). Mantenha no gelo. Misture por vórtice.

2. Pulverização de tecido congelado (Figura 2A)

1. Configure a estação de trabalho para homogeneização.
   1. Encher o recipiente com azoto líquido (LN₂).
      CUIDADO: ao trabalhar com LN_2, use sempre óculos de proteção e luvas criogênicas.
   2. Obtenha 2 pilões, 1 pilão, 1 espátula de microcolher, 1 polo de vidro e 1 pilão de aço inoxidável para o pompão automático.
   3. Configure o regulador automático.
   4. Encha um copo com gelo e pré-resfrie o copo dounce.
2. Encha os 2 almofarizes (contendo o pilão e a espátula) com LN₂ para resfriar os instrumentos. Deixe o LN₂ evaporar e repita.
3. Enquanto os instrumentos estão esfriando, adicione 1 mL de HB ao copo de vidro.
4. Encha ambas as argamassas com LN₂ uma última vez e despeje a amostra de IMAT de 50 mg em uma das argamassas.
5. Pulverize o IMAT usando o pilão, pressionando-o suavemente sobre o pedaço de tecido para quebrá-lo em pedaços pequenos. Certifique-se de que todas as peças estejam pulverizadas.
6. O LN₂ evaporará lentamente enquanto pulveriza o tecido. Quando o tecido estiver devidamente pulverizado e ainda restar 1/4 - 1/2 de uma argamassa de LN₂ , incline a argamassa em direção à borda da argamassa para coletar o tecido pulverizado pela borda. Deixe o LN₂ evaporar completamente.
7. Imediatamente após a evaporação do último LN₂ , coloque o tecido pulverizado no copo contendo 1 mL de HB.

3. Homogeneização do tecido pulverizado

1. Homogeneizar o tecido pulverizado usando o douncer automático. Traga o dounce de vidro para cima e para baixo no pilão de aço inoxidável por 10 golpes na direção para frente, seguidos por 10 golpes na direção reversa.
2. Certifique-se de que a solução esteja turva após a homogeneização e não contenha pedaços visíveis de tecido. Uma cor rosa claro é frequentemente esperada devido à contaminação com o tecido muscular.
3. Transfira o homogeneizado para um tubo pré-resfriado de 1,7 mL de baixa ligação no gelo.
4. Use 400 μL de HB para enxaguar o dounce para garantir que todo o material seja transferido e adicione-o ao tubo.
   NOTA: Duas amostras podem ser processadas por vez. Para fazer isso, dobre a quantidade de HB e NIM. Pulverizar e homogeneizar uma amostra de tecido e, imediatamente a seguir, pulverizar e homogeneizar a segunda amostra de tecido para poder executar as etapas de isolamento e limpeza em paralelo.

4. Isolamento e limpeza de núcleos (Figura 2B)

1. Adicione 14 μL de Triton-X (10%) ao homogenato para uma concentração de 0,1%.
2. Mantenha o tubo no gelo e no escuro por 10-15 min enquanto vórtice a cada 3 min.
3. Pré-umedeça um filtro de células de 100 μm e um filtro de células de 40 μm (por amostra) com 100 μL de RT DPBS para cada um em um tubo cônico de 50 mL.
4. Filtrar o homogeneizado através do filtro de células de 100 μm.
5. Enxágue o tubo de 1,7 mL com 400 μL de HB e filtre através do filtro de células de 100 μm.
6. Em seguida, filtre a solução através do filtro de células de 40 μm.
7. Transfira uma quantidade igual de solução para dois tubos pré-resfriados de 1,7 mL de baixa ligação, correspondendo a ~ 900 μL em cada tubo.
8. Centrifugue os tubos durante 10 min a 2700 x g a 4 °C. Deve haver um pequeno pellet visível após a centrifugação.
9. Remova e descarte a camada lipídica superior e o sobrenadante restante, deixando ~ 50 μL de solução do primeiro tubo.
10. Repita para o segundo tubo.
11. Ressuspenda completamente o pellet no primeiro tubo, pipetando suavemente para cima e para baixo 20x e transfira para um novo tubo de baixa ligação de 1,7 mL. Evite criar bolhas.
12. Repita este procedimento para o segundo tubo e transfira a solução ressuspensa para o mesmo tubo.
13. Adicione 500 μL de NIM e misture com pipetagem.
14. Centrifugar o tubo com uma balança a 1000 x g durante 10 min a 4 °C.
15. Remova o sobrenadante, deixando ~ 50 μL, e pipete suavemente para cima e para baixo até que o pellet seja ressuspenso. Opcionalmente, transfira o pellet ressuspenso para um novo tubo limpo se algum lipídio restante permanecer na lateral do tubo.
16. Adicione 200 μL de NIM e misture por pipetagem.

5. Coloração e contagem de núcleos (Figura 2C e Figura 3)

NOTA: Para facilitar a contagem, configure um protocolo de 'contagem de núcleos' em um contador de células automatizado, pois o ajuste do campo claro e dos canais DAPI pode afetar muito a contagem. Ajuste os canais para que apenas os núcleos e não os detritos sejam capturados. Certifique-se de que o canal de campo claro marque apenas 'objetos' que também tenham uma coloração DAPI.

1. Adicione 1 gota da solução de coloração de células vivas e deixe no escuro, no gelo, por 15 min.
2. Filtrar a solução através de um filtro de células de 30 μm.
3. Misturar a solução de núcleos por pipetagem e adicionar 10 μl da solução a uma lâmina de câmara de contagem de células.
4. Conte os núcleos usando um contador de células automatizado.
   NOTA: A concentração ideal é de 1000 núcleos/μL correspondendo a 1,0 x 10⁶/mL.
   1. Certifique-se de que não haja aglomerados de núcleos, pois isso pode entupir o chip para gerar gotículas de núcleos únicos (Figura 3).
   2. Se a concentração de núcleos não for alta o suficiente, gire a solução a 1000 x g por 10 min a 4 ° C para obter um pellet, remova o sobrenadante e ressuspenda em um volume menor.
   3. Se o grau de detritos na solução for alto, ressuspenda a solução de núcleos em um volume maior de NIM (ou seja, 1 mL) e filtre novamente através de um filtro de células de 30 μm. Em seguida, gire para baixo a 1000 x g por 10 min a 4 ° C e ressuspenda em volume apropriado em relação à concentração de núcleos.
5. Após obter a concentração dos núcleos, prossiga diretamente para a primeira etapa da preparação da biblioteca.

Figura 3: Coloração de núcleos isolados. Imagem do contador de células de núcleos corados com NucBlue/DAPI (imagem à esquerda) e a imagem de campo claro correspondente (imagem à direita). A presença de pequenas quantidades de detritos é evidente na imagem de campo brilhante. O contador de células automatizado usado aqui não tem a opção de incluir barras de escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Parâmetros de preparação e sequenciamento da biblioteca

1. Consulte um protocolo completo para preparação de bibliotecas usando a abordagem de núcleos únicos baseada em gotículas disponível na página do provedor¹⁷.
   1. Apontar para uma recuperação de núcleos alvo de 10.000. No entanto, para amostras com alto nível de detritos ou núcleos frágeis, seria esperado um número menor de núcleos recuperados.
   2. Armazene as amostras a 4°C por até 72 h após a etapa 2.3. no protocolo de preparação da biblioteca para combinar o processamento de mais amostras em paralelo. Faça isso processando duas amostras até a etapa 2.3 em dois dias consecutivos e, no terceiro dia, processe as 4 amostras juntas da etapa 3 em diante no protocolo de preparação da biblioteca.
2. Parâmetros de sequenciamento: Sequência em uma plataforma de sequenciamento visando 50.000 leituras de extremidade emparelhada por núcleo.
   NOTA: Os dados apresentados neste protocolo foram sequenciados na plataforma NovaSeq 6000, visando 50.000 leituras de extremidade emparelhada por núcleo.

Figura 2: Fluxo de trabalho do protocolo. Ilustração esquemática do fluxo de trabalho nas etapas 2 e 3 (A), (B) etapa 4 e (C) etapa 5 do protocolo. A figura foi criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Tratamento e análise de dados

NOTA: Neste protocolo, alguns dos softwares recomendados e pacotes R usados para processar os dados de sequenciamento resultantes são brevemente introduzidos, com foco nas etapas após o pré-processamento inicial (Tabela 3). Este estudo fornece métricas gerais de controle de qualidade (CQ) e um exemplo de aproximação e projeção de variedades uniformes (UMAP) na Figura 4. No entanto, uma descrição detalhada da análise bioinformática está fora do escopo deste protocolo. Portanto, os leitores podem consultar a recente revisão sobre as melhores práticas para análise de célula única por Heumos et ^al.18.

1. Pré-processamento de dados de sequenciamento
   1. Mapeie as leituras de núcleos individuais para o genoma de referência humano GRCh38.
   2. Inclua leituras de íntrons na contagem.
2. Execute o controle de qualidade e a filtragem dos dados usando o pacote Seurat R ¹⁹.
   1. Calcule uma pontuação de complexidade celular dividindo o número log(10) de genes detectados pelo número log(10) de leituras detectadas.
   2. Trace as métricas de CQ mais importantes usando um histograma ou gráfico de violino, incluindo o número de genes detectados por núcleo, porcentagem de leitura mitocondrial e pontuação de complexidade celular.
   3. Filtre núcleos com menos de 200 ou mais de 10.000 genes por núcleo, mais de 10% de leituras mitocondriais e uma pontuação de complexidade abaixo de 0,8.
3. Normalize os dados e execute a redução da dimensionalidade.
   1. Use a função SCTransform do Seurat para normalizar os dados usando recursos de variáveis 2000.
   2. Agrupe dados usando as seguintes funções do pacote Seurat R : RunPCA, FindNeighbors, FindClusters e RunUMAP.
   3. Plote um UMAP para visualizar o agrupamento dos dados.
4. Filtre os dupletos previstos usando o pacote DoubletFinder R ²⁰ e reagrupe os dados.
5. Anote clusters usando marcadores genéticos conhecidos dos tipos de células que se espera estarem presentes no tecido (abordagem supervisionada) ou com base nos 5 principais genes diferencialmente expressos entre os clusters (abordagem não supervisionada).
6. Use decontX²¹para determinar o grau de contaminação do RNA ambiente e ajustar a matriz de expressão gênica para o RNA ambiente.
   1. Inclua a matriz genética bruta como plano de fundo.
7. Salve o objeto Seurat para exploração futura dos dados.
   NOTA: O código para análise de CQ e agrupamento está disponível no Arquivo Suplementar 1.

Pacotes de software/R usados no fluxo de trabalho de dados	Software/pacotes alternativos	Etapa de processamento
CellRanger	STARsolo, kallisto	Corte, alinhamento, mapeamento
Seurat	SingleCellExperiment, Cellranger	CQ, análise e exploração de dados
DoubletFinder	scds, scdblFinder, Scrublet	Detecção de dupletos
DecontX	SoupX, CellBender	Ajuste de RNA ambiente

Tabela 3: Software/ferramentas para fluxo de trabalho de dados.

Resultados

Este fluxo de trabalho foi projetado para orientar o processamento de amostras IMAT humanas congeladas para obter perfis de expressão gênica em resolução de núcleo único, permitindo a identificação do tipo de célula. Aqui, uma amostra representativa do IMAT de um participante do estudo SOMMA é apresentada.

O primeiro passo de qualquer análise de dados de snRNA-seq é avaliar a qualidade dos dados para identificar núcleos de baixa qualidade, que devem ser potencialmente removidos do conjunto de dados. É importante ressaltar que as etapas e limites de filtragem devem ser determinados para o tipo específico de amostra e conjunto de dados que você tem em mãos, pois as métricas comumente avaliadas podem diferir entre tecidos e tipos de células^22,23. A Figura 4A fornece imagens de algumas das principais métricas usadas para avaliar a qualidade dos dados snRNA-seq gerados. O número de genes detectados por núcleo depende da profundidade do sequenciamento e do tipo de célula, mas espera-se que esteja acima de 200 para núcleos de boa qualidade ^18,23. Verificou-se que os dados gerados usando este protocolo estão dentro da faixa esperada com uma mediana de 1134 genes por núcleo, de um total de 4662 núcleos.

A porcentagem de leituras mitocondriais é avaliada, uma vez que um alto grau de contaminação mitocondrial pode surgir de núcleos danificados ou RNA ambiente ligado aos núcleos, indicando núcleos de baixa qualidade. No conjunto de dados aqui apresentado, foi encontrada uma porcentagem mediana de leitura mitocondrial de 2,65, bem abaixo do limite de 5% a 20% comumente usado na literatura 24,25,26. A porcentagem de leituras ribossômicas difere entre os tipos de células e tecidos. No entanto, como grandes proporções de genes ribossômicos podem influenciar o agrupamento dos dados, recomenda-se verificar a porcentagem de leitura ribossômica e potencialmente remover genes ribossômicos ou núcleos com altos níveis de genes ribossômicos do conjunto de dados antes do agrupamento. Os dados gerados com este protocolo mostraram um baixo nível de leituras ribossômicas com mediana de 2,46% e máxima de 16,5% e, portanto, não filtramos com base nessa métrica. Por fim, uma pontuação de complexidade celular foi calculada com base no número log(10) de genes detectados dividido pelo número log(10) de leituras detectadas. Espera-se que os núcleos de boa qualidade estejam acima de 0,8, e uma mediana de 0,92 foi obtida na amostra utilizada neste estudo. Com base nessas métricas de CQ, pode-se decidir quais núcleos filtrar do conjunto de dados. Para análise, optamos por filtrar núcleos com menos de 200 ou mais de 10.000 genes por núcleo, mais de 10% de leituras mitocondriais e uma pontuação de complexidade abaixo de 0,8.

Após a avaliação inicial da qualidade e a etapa de filtragem, um UMAP pode ser gerado para visualizar o agrupamento dos núcleos. O agrupamento foi realizado com base nos 2000 genes mais variáveis usando a transformação SCT. As etapas iniciais de agrupamento podem ser usadas para verificar se algum dos recursos de CQ se agrupa, por exemplo, núcleos com altas leituras mitocondriais. Além disso, as informações de agrupamento são necessárias para alguns métodos de detecção de duplet, incluindo o DoubletFinder²⁰, que foi usado neste protocolo. O DoubletFinder foi usado com uma taxa de multiplicação esperada definida para 4,8%, conforme sugerido pelos provedores da plataforma baseada em gotículas. Após a remoção do duplo, o nível de contaminação do RNA ambiente foi estimado, o que é particularmente comum em preparações de núcleos únicos, pois o RNA é liberado do citoplasma após a lise celular e é dispensado nas esferas de gel em emulsão (GEMs) e amplificado nas etapas de preparação da biblioteca a seguir. Assim, várias ferramentas foram desenvolvidas para corrigir o problema inerente da contaminação do RNA ambiente (ver Tabela 3). Usamos o pacote R decontX^21, no qual a matriz de fundo bruta (incluindo apenas gotículas vazias) é usada para ajustar a matriz de expressão gênica, aumentando a assinatura real da expressão gênica.

O agrupamento e a capacidade de detectar tipos de células pouco abundantes dependem do número de núcleos. Este estudo detectou todos os principais tipos de células esperados no IMAT (Figura 4B) de um total de 3817 núcleos após filtragem de CQ, remoção de dupleto e ajuste de RNA ambiente. Estes incluíram células-tronco, progenitores fibroadipogênicos (FAPs) e adipócitos maduros, bem como pericitos, células musculares lisas, células imunes, células progenitoras musculares e mionúcleos da contaminação de células musculares esqueléticas.

No geral, demonstramos que este protocolo produz dados de núcleos únicos de alta resolução, permitindo a detecção de anotações de tipo de célula importantes para desvendar a biologia e as origens celulares do IMAT.

Figura 4: Avaliação de qualidade, agrupamento e anotação do tipo de célula dos dados de sequenciamento. (A) Gráficos de violino de métricas essenciais para avaliação da amostra e desempenho de sequenciamento, incluindo o número de genes detectados por núcleo, porcentagem de leituras mitocondriais, porcentagem de leituras ribossômicas e complexidade celular medida como o número log(10) de genes detectados dividido pelo número log(10) de leituras detectadas. Os valores medianos para cada métrica são fornecidos em caixas fechadas. Número total de núcleos: 4662. (B) UMAP exibindo agrupamento de núcleos individuais e DotPlot correspondente mostrando a expressão gênica relativa de genes marcadores de tipo de célula para cada cluster após a filtragem. Número de núcleos: 3817. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: O código para análise de CQ e clustering. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Existem vários desafios inerentes ao trabalho com o IMAT. Além de sua acessibilidade limitada, o rendimento do material da amostra é muitas vezes muito escasso e a "contaminação" do músculo esquelético é quase impossível de evitar. Para obter a amostra de melhor qualidade, deve-se penetrar na fáscia muscular ao inserir a agulha de biópsia (para garantir que não colete tecido adiposo subcutâneo) e remover o máximo de tecido muscular possível, dissecando a amostra ao microscópio imediatamente após a coleta, seguido de processamento subsequente para histologia, congelamento instantâneo, etc. Este é o primeiro método a utilizar amostras IMAT coletadas prospectivamente e dissecadas do músculo esquelético. Comparativamente, os dados anteriores de snRNA-seq no IMAT foram por meio de isolamentos de núcleos de uma mistura de biópsias do músculo esquelético com infiltração gordurosa conhecida e não apenas do IMAT.

O IMAT é de natureza mais densa em comparação com os tecidos adiposos subcutâneos, tornando a pulverização adequada do tecido durante o isolamento dos núcleos essencial para liberar os núcleos da estrutura do tecido. A pulverização inadequada pode levar a um menor rendimento de núcleos, o que é desfavorável com uma quantidade limitada de tecido. Além disso, calcular o número correto de núcleos na solução de núcleos preparada é uma etapa crítica para garantir núcleos suficientes (mas não muitos) para carregar no chip para geração de GEM. Muitos núcleos, ou a presença de grandes aglomerados de núcleos ou detritos, podem resultar em entupimento, afetando a concentração final de cDNA e, em última análise, a saída do sequenciamento. Contornar a aglomeração de núcleos e detritos na preparação de núcleos únicos é difícil e afetado pela qualidade da amostra. A aglomeração de núcleos e/ou a presença de detritos podem ser reduzidas incluindo uma etapa extra de filtragem com o filtro de células de 30 μm.

É importante processar amostras rapidamente para reduzir o risco de degradação do RNA. Manter as soluções no gelo ou resfriadas durante todas as etapas possíveis de isolamento dos núcleos, bem como a adição de uma quantidade suficiente de inibidores de RNAse, pode minimizar a degradação. Devido à importância do tempo de processamento de cada amostra, recomendamos executar no máximo duas amostras por vez. Além disso, a solução dos núcleos deve ser manuseada com cuidado para não tornar os núcleos muito frágeis. Núcleos frágeis são suscetíveis a estourar na geração de GEM, o que pode resultar em grandes quantidades de RNA ambiente na amostra. Nesse protocolo, a etapa de filtragem com seringa (descrita no protocolo STAR¹⁶) foi excluída para preservar a integridade dos núcleos.

A escolha do método de preparação da biblioteca depende da questão de pesquisa. Trabalhamos com uma abordagem de núcleos únicos baseada em gotículas e nano-poços. A abordagem baseada em nano-poços traça perfis de 1200-1600 núcleos e aproximadamente 3000-6000 genes detectados por núcleos¹⁶. Além disso, essa abordagem suporta transcriptômica completa, o que permite a investigação de variação estrutural, pseudogenes e variantes de splice²⁷. Em comparação, mais de 10.000 núcleos podem ser perfilados usando a abordagem baseada em gotículas, mas às custas de um número menor de genes detectados por núcleo (2-3 vezes menor). Para este protocolo, optamos por usar uma das plataformas baseadas em gotículas, pois o maior número de núcleos perfilados nos dá uma maior capacidade de detectar tipos de células raras com baixa abundância²⁸.

A principal limitação do snRNA-seq é a perda de conteúdo citosólico, restringindo a análise de expressão a transcritos nucleares. O núcleo contém 10-100 vezes menos mRNA do que o de toda a célula²⁹, o que pode ser preocupante para descobrir todos os tipos de células em um tecido. No entanto, um estudo recente de Gupta et al. descobriu que a transcriptômica nuclear - em comparação com a transcriptômica de células inteiras²⁹ - detectou populações de células semelhantes e perfis de expressão de genes biologicamente relevantes em pré-adipócitos cultivados e adipócitos maduros. Resultados semelhantes foram encontrados em outros tipos celulares^30,31.

O isolamento de núcleos únicos tem suas vantagens em fornecer padrões de expressão gênica de resolução de célula única (sc) de células frágeis incompatíveis com scRNA-seq. Além disso, amostras congeladas de biobanco podem ser usadas, e o isolamento de núcleos não requer digestão enzimática do tecido, o que pode induzir uma resposta ao estresse nas células, afetando o transcriptoma³². Usando snRNA-seq, fomos capazes de traçar o perfil transcricional de adipócitos e outros tipos de células presentes no IMAT, o que não seria possível com scRNA-seq devido aos adipócitos serem carregados de lipídios e incompatíveis com a abordagem baseada em gotículas.

Uma aplicação importante do snRNA-Seq do IMAT é decifrar a composição celular e as diferenças transcricionais do IMAT em estados metabólicos variados. Além disso, os conjuntos de dados de snRNA-seq podem ser usados para deconvoluir o RNA-seq em massa no IMAT para avaliar as diferenças de composição celular em uma escala maior³³. Além disso, a análise pseudo-temporal dos dados de snRNA-seq pode servir para identificar trajetórias de maturação celular, o que é de particular interesse em tecidos como o IMAT, no qual as origens celulares dos adipócitos maduros ainda são debatidas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,2 µ Filtros de Seringa M Corning	Millipore Sigma	CLS431229
1.7 mL Tubos de DNA LoBind	Eppendorf	22431021	tubos de baixa ligação
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x inibidor de protease	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Separador Magnético 10X	Adaptador de
Genômica 10X
Tubos canônicos de 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
tubos cônicos de 50 mL	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Kit de acessórios Chromium iX	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Contador
Countess 3	Células Automatizado AMQAX2000 Contador de Células Thermo	Fisher Scientific
Countess Slides de câmara de contagem de células	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (sem cálcio, sem magnésio)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Kit de Índice Duplo TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genômica	PN2000048
Falcon 100 µ Filtro de células m	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µ Filtro de células	m Corning Life Science	352340
Glicerina (glicerol), 50% (v/v) Solução Aquosa	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µ m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortar and pestel	Logística de cuidados de saúde	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagente	Thermo Fisher Scientific	R37605
Água Livre de Nuclease (não tratada com DEPC)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumina Soro Bovino Albumina Livre de Ácidos Graxos, Pó	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Ribolock Inibidor de RNAse	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µ L	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf
Homogeneizador de tecidos	Glass-Col	099C K54
Tris buffer pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020