Este estudo descreve um protocolo combinado de ressonância magnética (RM) e ultrassom focalizado pulsado de baixa intensidade (FUS), utilizando ratos vivos com cateterismo da veia jugular para monitorar a abertura da barreira hematoencefálica (BHE).
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Artigo de método
Monitorando a abertura da barreira hematoencefálica em ratos com um sistema de ultrassom focalizado pré-clínico
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O cérebro tem uma barreira sanguínea semipermeável altamente seletiva, denominada barreira hematoencefálica (BHE), que impede a entrega de agentes macromoleculares terapêuticos ao cérebro. A integração do ultrassom focalizado pulsado de baixa intensidade (FUS) guiado por RM com pré-injeção de microbolhas é uma técnica promissora para a modulação não invasiva e não tóxica da BHE. A ressonância magnética pode oferecer contraste superior de tecidos moles e várias avaliações quantitativas, como permeabilidade vascular, perfusão e distribuição espaço-temporal dos agentes de contraste de ressonância magnética. Notavelmente, as técnicas de ressonância magnética com contraste com agentes de contraste à base de gadolínio demonstraram ser o padrão-ouro para detectar aberturas de BHE. Este estudo descreve uma metodologia abrangente envolvendo protocolos de ressonância magnética e procedimentos em animais para monitorar a abertura da BHE em um modelo de rato. O modelo de rato oferece o benefício adicional da utilização do cateter da veia jugular, o que facilita a administração rápida de medicamentos. Um transdutor FUS pré-clínico guiado por estereotáxica facilita o refinamento e a simplificação de procedimentos em animais e protocolos de ressonância magnética. Os métodos resultantes são caracterizados pela reprodutibilidade e simplicidade, eliminando a necessidade de conhecimento cirúrgico especializado. Esta pesquisa se esforça para contribuir para a otimização de procedimentos pré-clínicos com modelos de ratos e incentivar novas investigações sobre a modulação da BHE para melhorar as intervenções terapêuticas em distúrbios neurológicos.
Introdução
A BBB regula o movimento de íons, moléculas e células entre os vasos sanguíneos e os tecidos cerebrais1. Essa função permite a manutenção da função neuronal e da saúde, evitando a entrega de agentes macromoleculares terapêuticos aos tecidos cerebrais. A permeabilidade limitada da BHE pode resultar na diminuição da eficácia e eficácia dos tratamentos para tumores cerebrais e doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e doença de Alzheimer2. Assim, várias abordagens, como entrega aprimorada por convecção, injeções intracranianas diretas, interrupção osmótica e design aprimorado de medicamentos, foram investigadas para contornar o BBB para entrega controlada de agentes terapêuticos3,4,5.
No entanto, essas abordagens têm limitações intrínsecas, como invasividade, risco de infecção, risco de hemorragia, heterogeneidade e rápido efluxo de drogas. O ultrassom focalizado pulsado (FUS) de baixa intensidade com injeção de microbolhas é uma técnica não invasiva promissora que permite a interrupção localizada e reversível da BHE. Os efeitos mecânicos do ultrassom acoplado a microbolhas podem alterar transitoriamente a permeabilidade da BHE (ou seja, abertura da BHE)6,7. Para avanços adicionais nas aplicações de tratamento utilizando a abertura BBB, experimentos in vivo com pequenos animais são essenciais.
Neste estudo, introduzimos protocolos de ressonância magnética e procedimentos em animais para monitorar a abertura da BHE em um modelo de rato. O protocolo incluiu um modelo de rato com cateter de veia jugular canulado por uma organização comercial (ver Tabela de Materiais). Um modelo de cateterismo da veia jugular em ratos tem os benefícios potenciais da administração rápida de medicamentos, testes de monitoramento hemodinâmico e cateterismo estável. A abertura da BHE foi realizada usando um sistema FUS pré-clínico. Projetado especificamente para abertura BBB em modelos de pequenos animais, como ratos e camundongos, este sistema incorpora componentes essenciais, como um sistema de bancada, computador de controle, transdutor, desgaseificador de água e acessórios que o acompanham. O uso deste sistema FUS pré-clínico guiado por estereotáxica não apenas aumenta a precisão, mas também agiliza os procedimentos em animais e os protocolos de ressonância magnética, contribuindo para a reprodutibilidade e simplicidade do protocolo experimental geral.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, São Francisco (UCSF). Ratos machos da raça Sprague-Dawley (200-250 g) foram utilizados neste estudo. Os ratos foram alojados e cuidados de acordo com as Diretrizes de Uso e Cuidados com Animais do Escritório do National Institutes of Health em camundongos e ratos. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação dos animais
NOTA: Para os procedimentos internos, os animais foram transportados para a sala de preparo e os procedimentos foram conduzidos da seguinte forma:
- Coloque os ratos individualmente em uma câmara de Lucite e exponha o isoflurano (2%-3%) misturado com oxigênio extraído de um tanque de oxigênio medicinal até que fiquem inconscientes (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
NOTA: A anestesia com isoflurano permite a implementação de um protocolo de ressonância magnética de longo prazo. - Remova os ratos da câmara e raspe os pelos das áreas anterior e posterior do pescoço usando um creme depilatório.
- Aplique pomada lubrificante nos olhos.
- Coloque o nariz no cone do nariz para manter a anestesia com respiração espontânea (vaporizador de isoflurano entre 2%-2,5%, medidor de fluxo de oxigênio para 1-1,5 L/min).
- Coloque o rato anestesiado em uma mesa cirúrgica aquecida e confirme com uma pitada no dedo do pé.
NOTA: O protocolo de RM incluiu sequências com contraste, como imagem de eco gradiente ponderada em T1 e imagem de spin eco ponderada em T2. Essas sequências foram conduzidas antes e depois da injeção de agentes de contraste à base de gadolínio (GAD) para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Isso envolve a administração de agentes de contraste GAD enquanto o rato está em um scanner de ressonância magnética7. Para facilitar esse processo, foi utilizado um tubo de cateter que se estende do cateter canulado no rato. A extensão incluiu um conector de cateter e tubo de polietileno medindo 30 cm. Para garantir a permeabilidade e evitar vazamentos, o tubo de extensão foi lavado com glicerol heparinizado (250 UI de heparina/1 mL de glicerol).
2. Sistema de ultrassom focalizado guiado por estereotáxica
NOTA: Os animais foram transferidos e colocados em uma mesa em um sistema FUS estereotáxico. O nariz do rato foi colocado no cone do nariz para manter a anestesia. O sistema FUS compreende um gerador de funções, um amplificador de RF e um osciloscópio. Antes de configurar o transdutor, garantimos a conexão adequada de todos os dispositivos com o sistema. A configuração do transdutor foi concluída usando as seguintes etapas:
- Coloque um ponteiro afiado na posição do Bregma no crânio e salve a posição. A posição de Bregma pode ser identificada apontando a localização de 9,0 mm anterior a Lambda na linha média8. O Lambda pode ser encontrado no centro da linha entre tímpanos bilaterais9.
- Coloque gel de ultrassom na cabeça do rato, na bolsa de acoplamento de água e no transdutor (frequência de 1 MHz). Certifique-se de que não haja bolhas de ar entre a pele do rato, a bolsa de acoplamento de água e o transdutor.
- Conecte um cabo BNC coaxial do transdutor à entrada do módulo do sistema FUS.
- Em um computador de controle) Clique em carregar para imagens de ratos pré-registradas; Vários pontos focais e pressão acústica são escolhidos.
- Em um computador de controle) Clique no teste de movimento no módulo de tratamento para garantir que o transdutor possa mudar entre os pontos dentro de um período de ruptura.
- Configure os parâmetros de sonicação descritos na etapa 3.
3. Infusão e sonicação de microbolhas
- Ative o microbubble.
NOTA: A microbolha utilizada neste estudo foi caracterizada por um diâmetro de 1,7 μm e uma concentração de 0,2 × 109 partículas por mililitro10. O frasco de microbolhas foi ativado com base nas instruções de prescrição fornecidas pelo fornecedor e em um relatório publicado anteriormente11.- Prepare uma seringa de 5 mL com uma ponta luer lock e preenchida com 5 mL de injeção de cloreto de sódio a 0,9% sem aditivos.
- Remova a tampa verde e conecte a seringa ao pino dispensador ventilado (consulte a Tabela de Materiais) aparafusando-a no sentido horário.
- Remova a proteção do pino e coloque-a no centro da rolha de borracha do frasco. Pressione com firmeza até que o espigão esteja totalmente inserido na rolha.
- Esvazie toda a seringa de 5 ml no frasco para injetáveis empurrando a haste do êmbolo.
- Agite o frasco vigorosamente durante 20 s para misturar todo o conteúdo. Um líquido leitoso branco consistente mostrará que as microesferas lipídicas de hexafluoreto de enxofre se formaram.
- Para obter a dose necessária, inverta a seringa e retire lentamente o volume pretendido da suspensão para uma seringa de 5 ml.
- Use uma bomba de infusão.
NOTA: A abordagem de infusão12 foi usada para administrar microbolhas a ratos usando uma bomba de seringa. Uma seringa contendo microbolhas foi conectada a um conector de cateter inserido no rato. As microbolhas foram transferidas através de tubos de polietileno e a vazão da bomba de infusão foi ajustada para 0,66 mL/min. Esta taxa de perfusão permite a injeção de 2 ml de microbolhas de uma seringa de 3 ml durante 3 min. A infusão começou antes da sonicação por 1 min e continuou durante todo o período de sonicação de 2 min. - Execute sonication.
NOTA: Neste estudo, os pulsos FUS foram escolhidos com os seguintes parâmetros: (1) Região alvo: hipocampo esquerdo; (2) Número de manchas: 6 para cobrir o hipocampo no cérebro; (3) Comprimento da explosão: 10 ms; (4) Período de explosão: 1200 ms; (5) Pressão acústica: 0,65 MPa; (6) «Modo de disparo contínuo» no menu do modo de sonicação do sistema FUS; (7) Tempo de sonicação: 120 s.
4. Procedimento de ressonância magnética usando um scanner pré-clínico 3T
- Após a sonicação, transferir os animais para uma mesa num scanner pré-clínico 3T sem criogénio.
- Posicione os ratos na posição de bruços. Mantenha a temperatura da almofada de aquecimento no scanner e monitore a frequência respiratória usando um sensor pneumático de travesseiro. Realize o protocolo de ressonância magnética para testar vários tipos de imagens de ressonância magnética (Tabela 1).
- Inclua outras técnicas de imagem quantitativa, como imagem ponderada em difusão (DWI), mapeamento T2*, mapeamento T1 e ressonância magnética com contraste dinâmico (DCE), além de ressonância magnética com contraste, para demonstrar sua praticidade potencial para diversos estudos de imagem. Consulte a Tabela 1 para os protocolos de ressonância magnética usados neste estudo.
- Injete agentes de contraste de ressonância magnética baseados em GAD (Gadavist, 1 mmol/kg) após a sequência de eco gradiente de RM ponderada em T1 e adquira imagens pós-TAG.
NOTA: Para um rato de 200 g, injetamos 200 μL do agente de contraste de ressonância magnética e seguimos com uma solução salina de 200 μL para lavar o tubo.
5. Exame macroscópico do cérebro de rato
NOTA: Após a ressonância magnética, 2 mL de solução de azul de Evans (2% diluída com solução salina tamponada com fosfato) foram injetados e o rato foi deixado em repouso por pelo menos 30 minutos para permitir que a solução se espalhasse e circulasse por todo o corpo. Posteriormente, os ratos foram sacrificados com uma overdose de isoflurano (5%) para exame macroscópico do cérebro (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Para confirmar a eutanásia, foi necessário socar o dedo do pé e o animal foi observado quanto à cessação da respiração por pelo menos 1 min. O procedimento de perfusão foi realizado, seguido de um exame do cérebro do rato. O procedimento de perfusão é resumido da seguinte forma:
- Realize uma toracotomia usando uma tesoura cirúrgica para expor os órgãos do tórax e visualizar a região cardíaca.
- Incisar (~5 mm) o átrio direito.
- Introduza solução salina no ventrículo esquerdo para fins de perfusão.
- Abra o osso do crânio com uma tesoura cirúrgica para desvendar e apresentar o cérebro.
NOTA: A perfusão adequada deve resultar em uma aparência uniformemente brilhante do cérebro, enquanto as áreas azuis persistentes indicam vazamento de albumina associado à BHE, conforme detectado pelo azul de Evans.
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Resultados
Este estudo apresenta um protocolo pré-clínico para monitorar a abertura da BHE em um modelo de rato utilizando um sistema FUS comercial. O sistema FUS foi montado sobre uma bancada ou um carrinho grande (Figura 1). Os ratos foram anestesiados com isoflurano misturado com oxigênio por meio de um cone nasal no suporte com o porta-transdutor. Um hidrofone ressonante em 500 kHz para detecção de cavitação acústica foi inserido no transdutor FUS com frequência ressonante de 1,0 MHz.
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Discussão
Um protocolo e procedimento animal usando um modelo de cateterismo da veia jugular em ratos para estudos de abertura da BHE foram desenvolvidos. Embora existam vários protocolos pré-clínicos, este protocolo incorpora um sistema FUS disponível comercialmente e um modelo de rato, minimizando os procedimentos de preparação animal e, assim, garantindo a reprodutibilidade experimental.
Neste protocolo, a seleção das microbolhas foi baseada em sua estabilidade e armazenamento em temperatura ambiente...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse relevantes a declarar.
Agradecimentos
Este estudo foi parcialmente apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIDCR) Grant K99DE032397, UCSF Department Seed Grant (No. 7504831), UCSF RAP grant (PI: Kazim Narsinh, MD) e a Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, GA 3535/1-1).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de 1 mL | BD plastipak | ||
| 20 mL, Cloreto de Sódio 0,9% | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| Seringa de 3 mL | BD plastipak | ||
| Seringa de 5 mL | BD plastipak | ||
| Agulha romba, tecnologias | infusão de 21 G SAI | B21-50 | |
| 21 G | SAI technologies | CC-25-25 | |
| Solução de bloqueio de cateter | Tecnologias de infusão SAI | Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) Glicerol |
| Evans | Blue Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israel | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE Vaporizador de isoflurano | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS | Inovenso | IPS-12 | |
| isoflurano USP | Vet um | 501017 | |
| Microbbuble Lumason | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| Ratos Sprague-Dawley Machos (200– 250 g) | Agulha Charles River Laboratories | ||
| , 18 G | BD Precisionglide | ||
| Solução salina tamponada com fosfato | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Tubo de polietileno | BD Intramédico | ||
| pré-clínico 3T livre de criogênio Scanner Bruker Biospin | Bruker | Biospec3T | |
| Rato com cateterismo de veia jugular | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 transdutor de ultrassom focalizado | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 sistema de ultrassom focalizado de bancada | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, EUA | ||
| pino de dispensação ventilado | B Braun | 4550560 |
Referências
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