Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes

Resumo

Este protocolo apresenta um guia acessível para coletar, armazenar e descongelar células mononucleares do sangue periférico adequado para análises e fluxos de trabalho a jusante, como citometria de fluxo e sequenciamento de RNA. Coleções de plasma e pelagem leucocitária também são demonstradas.

Resumo

As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são comumente usadas em pesquisas biomédicas sobre o sistema imunológico e sua resposta a doenças e patógenos. Este protocolo detalhado descreve o equipamento, suprimentos e etapas para isolar, criopreservar e descongelar PBMCs de alta qualidade e altamente viáveis de células sanguíneas totais, adequadas para aplicações a jusante, como citometria de fluxo e sequenciamento de RNA. Protocolos para processamento de plasma e buffy coat do sangue total em paralelo e simultaneamente com PBMCs também são descritos. Este protocolo passo a passo fácil de seguir, que utiliza centrifugação de gradiente de densidade para isolar PBMCs, é acompanhado por uma lista de verificação de suprimentos, equipamentos e etapas de preparação. Este protocolo é adequado para indivíduos com qualquer experiência prévia com técnicas laboratoriais e pode ser implementado em laboratórios clínicos ou de pesquisa. A viabilidade celular de alta qualidade e o sequenciamento de RNA resultaram de PBMCs coletadas por operadores sem experiência laboratorial anterior usando este protocolo.

Introdução

Este protocolo demonstra um método acessível e um fluxo de trabalho para o isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) do sangue total. Este protocolo é especialmente direcionado a técnicos de pesquisa iniciantes, estudantes e equipe de laboratório clínico com o objetivo de facilitar a coleta e criopreservação de PBMCs sem pressupor treinamento prévio em técnicas de laboratório.

Este protocolo utiliza centrifugação para separar os componentes do sangue total por densidade. O sangue total consiste em quatro componentes principais listados em ordem decrescente de densidade: glóbulos vermelhos/eritrócitos (~45% do volume), glóbulos brancos (<1% do volume), plaquetas (<1% do volume) e plasma (~55% do volume)1,2,3,4,5,6. Os glóbulos brancos podem ser subdivididos em duas categorias com base nas características de seus núcleos: redondos ou multinucleados⁶. As PBMCs são definidas como glóbulos brancos com núcleos redondos e consistem nos seguintes tipos celulares: linfócitos (células T, células B, células NK), células dendríticas e monócitos⁶. Os glóbulos brancos multinucleados incluem granulócitos, que consistem nos seguintes tipos de células: neutrófilos, basófilos e eosinófilos⁶. Os glóbulos brancos multinucleados são mais densos que os PBMCs⁶. As densidades de cada componente do sangue total estão detalhadas na Tabela 1.

Neste protocolo, o sangue total é coletado em tubos de centrifugação com gradiente de densidade. Esses tubos contêm um meio de gradiente de densidade pré-embalado com densidade de 1,077 g/mL. Após a centrifugação, as células mais densas, incluindo leucócitos e eritrócitos multinucleados, são separadas das PBMCs e plaquetas pelo meio de gradiente de densidade (Figura 1A)^6,7. O PBMC e a fração plaquetária são então coletados, lavados e centrifugados para remover as plaquetas. Os PBMCs purificados resultantes são coletados e armazenados a -80 °C ou em nitrogênio líquido. As PBMCs criopreservadas podem ser descongeladas de forma viável e usadas diretamente em análises posteriores ou processadas adicionalmente para isolar tipos específicos de células componentes.

Este protocolo foi otimizado para sequenciamento de RNA de alta qualidade de PBMCs altamente viáveis. Neste artigo, as PBMCs foram isoladas e criopreservadas de pacientes em um ambulatório. Posteriormente, os monócitos foram isolados de PBMCs por FACS e analisados via sequenciamento de RNA. No entanto, o protocolo pode ser amplamente adaptado a outras necessidades experimentais, como cultura de células, edição de genes, estudos funcionais ex-vivo, análises de células únicas, fenotipagem por citometria de fluxo ou citometria por tempo de voo, isolamento de DNA/RNA ou proteínas, lâminas para imuno-histoquímica, entre outros 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Além da coleta de PBMC de tubos de centrifugação com gradiente de densidade, este protocolo analisa como coletar plasma e revestimento leucocitário por centrifugação usando um tubo de EDTA. Após a centrifugação, o sangue total é separado em plasma, eritrócitos e uma fina camada de interface denominada buffy coat contendo leucócitos (Figura 1B)⁶. O buffy coat é comumente usado para extração de DNA e análises genômicas subsequentes^19,20. A camada plasmática contém os componentes livres de células do sangue total e pode ser usada para ensaios de biomarcadores^21,22.

Protocolo

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Programa de Proteção Humana da UCSD e KUMC e está em conformidade com a Declaração de Helsinque. Todos os indivíduos forneceram consentimento informado para participação e coleta de sangue.

1. Processamento e criopreservação de PBMCs

1. Um dia antes da colheita de sangue, imprima a lista de verificação dos materiais e reagentes enumerados no Quadro 2 e prepare e rotule em conformidade.
   NOTA: Este protocolo foi projetado para a coleta de 6 tubos de centrifugação com gradiente de densidade. Cada tubo produz cerca de 12 milhões de PBMCs, dos quais aproximadamente 50% e 20% serão linfócitos e monócitos vivos, respectivamente. Dimensione de acordo com as necessidades experimentais. Observe que o número absoluto de células pode diferir significativamente entre pacientes ou condições de tratamento.
2. Usando a técnica padrão de flebotomia, colete sangue total em 6 tubos de centrifugação com gradiente de densidade e 1 tubo de EDTA até encher, aproximadamente 6 mL de volume.
   NOTA: Se forem necessárias amostras de vários pacientes ou condições de tratamento, os tubos coletados podem ser armazenados por até 4 h e depois processados simultaneamente.
3. Após a coleta, centrifugue todos os tubos a 1.800 x g por 20 min em temperatura ambiente.
   NOTA: Consulte o Vídeo Suplementar 1 para obter uma demonstração de como operar uma centrífuga.
4. Após a centrifugação, abra cuidadosamente o tubo de centrifugação do gradiente de densidade. Use uma pipeta de transferência para remover e descartar a camada amarela translúcida contendo plasma. Não perturbe a camada nebulosa de células diretamente acima do meio gradiente de densidade. Erre por excesso de cautela, deixando o excesso de plasma em vez de descartar PBMCs. Repita para todos os tubos.
   NOTA: Após a centrifugação do tubo contendo o meio de gradiente de densidade, o plasma e os PBMCs estarão acima do meio de gradiente de densidade; eritrócitos e granulócitos se depositarão no fundo. Consulte a Figura 1A para obter uma visualização.
5. Com uma nova pipeta de transferência, pipetar o volume restante contendo células e plasma residual em cada tubo para cima e para baixo suavemente várias vezes acima do meio de gradiente de densidade.
6. Após a ressuspensão, pipete o conteúdo ressuspenso do tubo em um tubo cônico de 50 mL rotulado. Repita para todos os tubos.
7. Despeje a Solução 1 (Meio RPMI) no tubo de 50 mL até atingir a linha de 50 mL.
8. Repita as etapas 1.4 a 1.7 para cada paciente ou condição de tratamento, conforme necessário.
   NOTA: Certifique-se de que amostras diferentes não sejam misturadas e use uma nova pipeta de transferência para evitar contaminação.
9. Centrifugue o tubo de 50 ml a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
   NOTA: O protocolo de coleta de plasma e buffy detalhado na Seção 2 pode ser concluído durante esse período.
10. Descarte o máximo possível de sobrenadante. Toque conforme necessário para remover gotas residuais.
    NOTA: Após a centrifugação, o pellet contém PBMCs e o sobrenadante contém plaquetas e plasma residual.
11. Despeje um tubo de 15 mL de Solução 2 (meio RPMI + 12,5% de albumina sérica humana + 1 μM de flavopiridol) no tubo cônico de 50 mL contendo o pellet PBMC. Inverta suavemente o tubo para ressuspender o pellet celular.
12. Aspire 15 mL de Solução 3 (Meio RPMI + 11,25% de Albumina Sérica Humana + 1 μM de Flavopiridol + 10% de DMSO) usando uma pipeta de transferência. Adicione gota a gota ao tubo de 50 mL.
    NOTA: A solução 3 contém DMSO, que é tóxico para as células à temperatura ambiente. Não adicione a Solução 3 até que ela esteja pronta para ser processada imediatamente.
13. Inverta o tubo suavemente 3 vezes para misturar.
14. Encha cada criovial pré-rotulado e pré-resfriado com 1 mL de PBMCs usando uma pipeta de distribuição múltipla.
    NOTA: Consulte o Vídeo Suplementar 2 para obter uma demonstração de como operar uma pipeta de distribuição múltipla.
15. Coloque os criogeniais dentro de um recipiente de congelamento pré-resfriado. Em seguida, mova o recipiente para um freezer a -80 °C.
16. Repita as etapas 1.9 a 1.13 para cada paciente ou condição de tratamento, conforme necessário.
17. Mantenha os criogenianos dentro do recipiente de congelamento por no mínimo 12 h e, em seguida, transfira-os para uma caixa de armazenamento rotulada a -80 °C.
    NOTA: Como alternativa, transfira os criotubos congelados para nitrogênio líquido (<-135 ° C) para armazenamento de longo prazo.

2. Processamento de plasma e revestimento leucocitário de tubos de EDTA

1. Centrifugue a 1.800 x g por 10 min em temperatura ambiente.
   NOTA: Após a centrifugação, a camada superior consiste em plasma, a inferior contém eritrócitos e a interface será o revestimento leucocitário. Consulte a Figura 1B para obter uma visualização.
2. Usando uma nova pipeta de transferência, extraia o máximo de plasma possível sem perturbar a camada de revestimento leucocitário. Em seguida, dispense alíquotas de 0,5 mL em criogenias pré-marcadas. Aspire a camada de revestimento leucocitário e transfira-a para o criogênico devidamente marcado.
   NOTA: Alguns plasmócitos e eritrócitos podem contaminar a coleção de pelagem leucocitária.
3. Repita a etapa 2.2 para cada paciente ou condição de tratamento, conforme necessário.
4. Após a coleta, armazene os criogenianos em um freezer a -80 °C.
   NOTA: Como alternativa, armazene em nitrogênio líquido (<-135 °C) para armazenamento de longo prazo.

3. Descongelamento de PBMCs

1. Um dia antes do descongelamento, imprima uma lista de verificação de materiais e reagentes listados na Tabela 3 e prepare e rotule de acordo.
   NOTA: Este protocolo foi projetado para o descongelamento de 1 tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBMCs. Cada tubo produz aproximadamente 2 milhões de PBMCs, dos quais aproximadamente 50% e 20% serão linfócitos vivos e monócitos, respectivamente. Dimensione de acordo com as necessidades experimentais. Observe que o número absoluto de células pode diferir significativamente entre pacientes ou condições de tratamento.
2. Transfira PBMCs congelados do armazenamento usando gelo seco e descongele em uma incubadora a 37 ° C por 4 minutos ou imediatamente antes do último descongelamento do cristal de gelo.
   NOTA: Se desejado, uma alíquota pode ser tomada para contagem de células e medições de viabilidade, conforme detalhado na Seção 4.
3. Após o descongelamento, adicione 1 mL de Solução 4 (PBS + 2 mM EDTA) a cada criogenial. Em seguida, despeje o conteúdo em um tubo pré-rotulado de 50 mL contendo 10 mL da Solução 4 para cada tubo de PBMC descongelado. Toque para remover gotas residuais.
4. Coloque o filtro de células no tubo vazio de 50 mL e, em seguida, despeje a suspensão de células através do filtro de células.
   NOTA: Se necessário, bata levemente para quebrar a tensão superficial.
5. Centrifugue cada tubo contendo as células coadas a 400 x g por 7 min em temperatura ambiente.
6. Após centrifugação, despeje o sobrenadante contendo DMSO. Toque conforme necessário para remover gotas residuais.
7. Ressuspenda o pellet celular no meio desejado apropriado para as necessidades experimentais a jusante (por exemplo, meio de cultura celular, coquetel de anticorpos por citometria de fluxo, etc.).

4. Contagem e viabilidade de células

1. Imediatamente após o descongelamento dos PBMCs congelados na etapa 3.2, pipetar 20 μL de células em um tubo de 1,5 mL. Adicione um volume igual de solução de Trypan Blue a 0,4% e pipete para cima e para baixo suavemente 3-4 vezes para misturar.
2. Usando um contador de células automatizado, siga o protocolo do fabricante para contar as células e avaliar a viabilidade. Certificar-se de que o factor de diluição de 2 é tido em conta.
   NOTA: Como descrito em outro artigo, um hemocitômetro pode ser usado como um método alternativo para avaliar a contagem e a viabilidade celular²³.

Resultados

Após a coleta e criopreservação de PBMC, a viabilidade de PBMCs, monócitos e linfócitos descongelados de 56 amostras únicas foi avaliada por citometria de fluxo usando reagentes listados na Tabela 4 seguindo as instruções dos fabricantes (Figura 2A-F). Foi alcançada uma viabilidade média ± DS de PBMCs, monócitos e linfócitos de 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% e 93 ± 5,6%, respectivamente (Figura 2G). A medição da viabilidade pela exclusão do Azul de Tripano produziu uma viabilidade média de 88 ± 7,5% e uma contagem de células de 2,3 x 10⁶ ± 1,9 x 10⁶. A análise por citometria de fluxo também demonstrou que os monócitos vivos compreenderam 17 ± 5,9% e os linfócitos constituídos por 53 ± 13,0% do total de PBMCs.

Posteriormente, os monócitos foram separados de PBMCs descongelados de 59 amostras únicas por citometria de fluxo e submetidos à preparação da biblioteca e sequenciamento de RNA, conforme descrito em outro lugar²⁴. Uma contagem média de sequências totais ± SD de 18,0 ± 16,3 milhões foi alcançada com um alinhamento de leitura de 93 ± 6,3% e 49,6 ± 1,4% de conteúdo de GC (Figura 3A-B). Uma porcentagem média de leituras mapeadas exclusivamente ± SD de 88 ± 3,6% foi encontrada com um subconjunto de 56 amostras únicas. Esses parâmetros demonstram que PBMCs altamente viáveis adequados para aplicações downstream, incluindo sequenciamento de RNA de alta qualidade, podem ser obtidos por operadores com qualquer nível de treinamento laboratorial usando este protocolo.

Componente	Densidade	Citação
Plasma	1,022 g/mL a 1,026 g/mL	1
Plaquetas	<1,061 g/mL a >1,070 g/mL	2
PBMCs	<1,077 g/mL	6
Neutrófilos de baixa densidade*	<1,077 g/mL	3
Granulócitos (neutrófilos*, basófilos e eosinófilos)	>1,077 g/mL	6
Eritrócitos	1,11 g/ml	4

Tabela 1: Componentes do sangue total listados por ordem decrescente de densidade.

Reagant/Material	Quantidade (por 6 tubos CPT e 1 tubo EDTA)	Ponta					Declarações de cuidado
Tubos CPT	6	Etiqueta de acordo com o ID do paciente ou da amostra.
Tubo de EDTA	1	Etiqueta de acordo com o ID do paciente ou da amostra.
Tubo cônico de 50 mL	2	Além do ID do paciente ou da amostra, rotule 1 tubo para PBMCs e 1 para resíduos.
Criogenias	39	Rótulo 30 para PBMCs, 8 para plasma EDTA e 1 para buffy coat. Nem todos os criogenianos podem ser usados.
Sr. Gelado	2	Encha até a metade com isopropanol e pré-resfrie durante a noite a -20 ° C.					O isopropanol é um irritante inflamável. Mantenha longe de faíscas/chamas. Evite inalar e manuseie com luvas e cuidados.
Flavopiridol	100 μL de estoque 1000X	Para preparar o estoque de flavopiridol 1000X, suspenda 5 mg de flavopiridol em 1,14 mL de DMSO para uma concentração de 10 mM. Alíquota de 200 μL em recipientes individuais e depois congelar. Para usar, descongele alíquotas individuais e dilua 1:10 em água destilada livre de DNase / RNase e, em seguida, use como uma solução 1000X.					O flavopiridol é um irritante. Manuseie com luvas e cuidados.
Solução 1	50 mL	RPMI Médio. Para fazer 50 mL de solução estoque, use 50 mL de meio RPMI.
Solução 2	15 mL	Meio RPMI + 12,5% de albumina sérica humana + 1 μM de flavopiridol. Para fazer 50 mL de solução-estoque, use 25 mL de meio RPMI + 25 mL de albumina sérica humana + 50 μL de flavopiridol 1000X.					O flavopiridol é um irritante. Manuseie com luvas e cuidados.
Solução 3	15 mL	Meio RPMI + 11,25% de albumina sérica humana + 1 μM de flavopiridol + 10% de DMSO. Para fazer 50 mL de solução estoque, use 22,5 mL de meio RPMI + 22,5 mL de HSA + 5 mL de DMSO + 50 μL de flavopiridol 1000X.					O flavopiridol é um irritante e o DMSO é tóxico e é facilmente absorvido pela pele. Manuseie com luvas e cuidados.

Tabela 2: Lista de verificação de reagentes e materiais a serem preparados e rotulados para coleta e criopreservação de PBMCs.

Reagant/Material	Quantidade (por alíquota de 1 mL de PBMCs congelados)	Ponta		Declarações de cuidado
Solução 4	10 mL	PBS + 2 mM EDTA Para fazer 50 mLs de solução estoque, use 5 mL de PBS 10X + 200 μL de EDTA 0,5M + 44,8 mL de água destilada livre de DNase / RNase
Tubo cônico de 50 mL	3	Além do ID do paciente ou da amostra, rotule 1 tubo para PBMCs pré-tensionados, 1 para PBMCs pós-tensionados e 1 para resíduos. Encher o tubo rotulado para PBMCs pré-corados com 9 ml de solução 4 por ml de PBMCs congelados
Tubo de 1,5 mL	1	Para contagem de células; etiqueta com paciente ou ID da amostra
Solução de 0,4% de Trypan Blue	20 μL	Para contagem de células; pode ser adicionado ao tubo de 1,5 mL com antecedência no dia anterior.		O azul de tripano é cancerígeno. Manuseie com luvas e cuidados.

Tabela 3: Lista de verificação de reagentes e materiais a serem preparados e rotulados para descongelamento e contagem de PBMCs.

Reagente/Material	Quantidade (por milhão de células)
Mancha de Morto-Vivo	5 μL
Confiança Humana FcX	5 μL
CD3 Anticorpo	5 μL
CD19 Anticorpo	5 μL
CD56 Anticorpo	5 μL
CD66b Anticorpo	5 μL
Anticorpo HLA-DR	5 μL
CD14 Anticorpo	5 μL
Anticorpo CD16	2,5 μL
RNAsina	100 unidades

Tabela 4: Tabela de reagentes para isolamento de monócitos de PBMCs por citometria de fluxo.

Figura 1: Componentes do sangue total separados por centrifugação em centrifugação com gradiente de densidade ou tubos de EDTA. (A) A centrifugação do sangue total em tubos de centrifugação com gradiente de densidade resulta na separação de plasma, plaquetas e PBMCs acima do meio de gradiente de densidade com multinucleados e eritrócitos abaixo do meio de gradiente de densidade. (B) A centrifugação do sangue total em tubos de EDTA resulta na separação do plasma na camada superior, eritrócitos na camada inferior e o revestimento leucocitário na interface. Criado com Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A viabilidade dos PBMCs criopreservados descongelados foi avaliada por coloração de fluxo vivo / morto e citometria de fluxo. (A) Os detritos, denotados por um asterisco *, são excluídos dos PBMCs por meio de dispersão frontal e lateral. (B) Análise representativa de PBMCs inteiros (C) Os pan-monócitos são considerados HLA-DR positivos e negativos para os seguintes antígenos de superfície marcados com FITC: CD3, CD19, CD56 e CD66b. (D) Análise representativa de monócitos vivos/mortos. (E) Linfócitos controlados pelos seguintes antígenos de superfície marcados com FITC: CD3, CD19, CD56 e CD 66b. (F) Análise representativa de linfócitos vivos/mortos. (G) Porcentagem de viabilidade de cada tipo de célula quantificada a partir de 56 amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Qualidade de sequenciamento de RNA de monócitos classificados a partir de PBMCs criopreservados. 56 amostras únicas foram sequenciadas e uma média ± DP 18,0 ± 16,3 milhões de sequências totais foram geradas. (A) O alinhamento foi alto, com 92,5% ± 6,3% das sequências alinhadas com o genoma de referência. (B) O conteúdo de GC dessas sequências foi de 49,6 ± 1,4%. Criado com FastQC²⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Demonstração de como usar a centrífuga Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 2: Demonstração de como operar uma pipeta multidispensadora. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo para coleta e criopreservação de PBMC foi implementado com sucesso por indivíduos com e sem treinamento prévio em laboratório de pesquisa. Em nossa aplicação, o FACS e o sequenciamento de RNA de monócitos altamente viáveis purificados de PBMCs armazenados resultaram em sequências de alta qualidade.

Um dos principais pontos fortes deste protocolo é sua acessibilidade. A técnica apresentada no protocolo utiliza tubos pré-embalados com um meio gradiente de densidade sólida. Como resultado, o sangue total pode ser coletado diretamente no tubo e, em seguida, processado imediatamente para isolar PBMCs. É necessário um número relativamente pequeno de soluções pré-fabricadas e equipamentos especializados, facilitando a colaboração entre o laboratório de pesquisa, onde os reagentes podem ser preparados, e o laboratório clínico, onde as amostras são coletadas e processadas. Os protocolos escritos e de vídeo são voltados para operadores em qualquer nível de treinamento.

Embora este protocolo utilize sangue total fresco para isolar PBMCs e, portanto, tenha um rendimento e pureza esperados relativamente altos de >90%, ele pode não ser adequado para aplicações que necessitem de purezas excepcionalmente altas de >98%^26,27. Além disso, os tubos de centrifugação com gradiente de densidade podem ser caros de obter, especialmente se um grande número de amostras precisar ser coletado.

Métodos alternativos de coleta de PBMC incluem o uso de um meio de gradiente de densidade líquida ou depleção imunomagnética^28,29. Resumidamente, o primeiro envolve a camada de um meio de gradiente de densidade pré-fabricado sob sangue total heparinizado, seguido de centrifugação. Este último utiliza anticorpos marcados magneticamente para rotular não-PBMCs, que são então retidos em uma coluna magnética enquanto os PBMCs não marcados passam sem serem afetados.

Em relação ao protocolo apresentado, o uso de um meio de gradiente de densidade líquida é menos dispendioso e requer muito menos material devido à falta de tubos de centrifugação de gradiente de densidade; O isolamento de PBMC pode ser realizado em um tubo padrão de 50 mL⁸. No entanto, essa técnica é mais elaborada, tem um tempo de processamento mais longo e pode estar sujeita a um risco maior de erro do usuário. A heparina deve ser adicionada com precisão para evitar a diluição excessiva e o meio gradiente de densidade deve ser cuidadosamente colocado em camadas nas quantidades corretas para garantir uma boa separação do PBMC²⁶.

Em relação ao protocolo apresentado, o uso de depleção imunomagnética oferece maior rendimento e pureza, manuseio reduzido devido à falta de centrifugação, tempo de processamento mais rápido e requer muito menos material 30,31,32. No entanto, a principal desvantagem é que esse método é o mais caro dos três métodos descritos, especialmente em escala.

Embora este protocolo seja robusto, certas etapas críticas podem exigir atenção adicional. Ao longo do protocolo, certifique-se de que as amostras não sejam misturadas e colocadas nos tubos devidamente rotulados, especialmente ao trabalhar com vários pacientes ou condições simultaneamente. Para a etapa 1.4, certifique-se de que nenhum PBMCs seja descartado; o excesso de plasma apenas diminuirá a concentração de PBMCs, o que é menos crítico na manutenção da viabilidade e qualidade da amostra. Separadamente, a presença de precipitados em PBMCs coletados sugere que pedaços do meio de gradiente de densidade foram desalojados. Pipete mais suavemente na etapa 1.5 para evitar esse problema. Nas etapas 1.10 e 3.6, certifique-se de que o pellet de célula centrifugada não seja descartado. Trabalhar rapidamente é fundamental para as etapas 1.12 e 3.3, pois a Solução 3 contém DMSO, que é tóxico para as células à temperatura ambiente³³. Também é importante observar que o armazenamento de PBMCs em nitrogênio líquido é recomendado em vez do armazenamento a -80 ° C. O armazenamento de longo prazo a -80 ° C tem sido associado à diminuição da viabilidade celular e alteração da expressão gênica^34,35.

Este protocolo pode ser adaptado de acordo com as necessidades experimentais. A adição de flavopiridol, um inibidor da RNA polimerase e da síntese de mRNA, nas soluções 2 e 3 destina-se a evitar qualquer manuseio e artefato induzido por estresse com o sequenciamento de RNA³⁶. No entanto, o flavopiridol pode ser omitido se forem desejados estudos funcionais ou ex vivo utilizando PBMCs.

O plasma coletado dos tubos de EDTA ficará contaminado com EDTA, um agente quelante. Como resultado, o plasma de EDTA é inadequado para ensaios envolvendo coagulação ou íons cálcio^37,38. Se desejado, a camada de plasma nos tubos do meio de gradiente de densidade pós-centrifugação pode ser coletada na etapa 1.4. Esses tubos contêm heparina sódica como anticoagulante, que pode ser removida com a adição de heparinase³⁹. Notavelmente, a heparina inibe a transcriptase reversa e a amplificação por PCR, tornando o plasma coletado inadequado para experimentos de PCR sem a adição de um agente bloqueador de heparina⁴⁰.

O revestimento leucocitário coletado dos tubos de EDTA não é armazenado em uma solução contendo DMSO ou flavopiridol. O DMSO é importante na redução da formação de cristais de gelo e da morte celular⁴¹. O flavopiridol é importante para a inibição da síntese de RNA³⁶. Assim, o revestimento leucocitário é inadequado para análises ex vivo e transcriptômicas. Se desejado, as etapas 1.6 a 1.15 podem ser executadas usando o revestimento buffy coletado para maximizar a viabilidade celular e inibir a síntese de RNA.

Embora este protocolo tenha sido projetado para sequenciamento de RNA, aplicações potenciais adicionais de PBMCs coletadas e criopreservadas usando este protocolo incluem cultura de células, edição de genes, estudos funcionais ex-vivo, análises de células únicas, fenotipagem por citometria de fluxo ou citometria por tempo de voo, isolamento de DNA / RNA ou proteínas, lâminas para imuno-histoquímica, entre outros.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1000 µ L Tips	Gilson	F174501	Aproximadamente 3 pontas necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tubo de 15 mL	Biopioneeer	CNT-15	Para segurar Soluções 2/3 2 necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection 2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Aproximadamente 40 crioviais necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µ L Dicas	Gilson	F174201	Para uso na contagem de células; o volume necessário depende do método de contagem de células usado. 1 ponta é necessária por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados
50 mL Tubo cônico	CEM Corporation	50-187-7683	2 necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 necessário por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados
CD14 Anticorpo Biolegend		325621
Anticorpo CD16	Biolegend	360723
Anticorpo CD19	Biolegend	363007
Anticorpo CD3	Biolegend	300405
Anticorpo CD56	Biolegend	318303
Anticorpo CD66b	Biolegend	305103
Filtro de Células	Biopioneeer	DGN258367	1 necessário por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados para serem descongelados Tubo de
Preparação de Células Mononucleares CPT	BD Biosciences 362753		6 tubos necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Contém 81 tubos 1 necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Armazena até 50 criogeniais
DMSO	Invitrogen	15575020	Aproximadamente 2,5 mL necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Destilada Livre de DNase/RNase	Invitrogen	10977015	Aproximadamente 2 mL necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Aproximadamente 9 mL necessários por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados
Tubos EDTA	BD Biosciences	366643	1 tubo necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Anticorpo	Biolegend	307609
Soro Humano Albumina	GeminiBio	800-120	Aproximadamente 25 mL necessários por paciente ou condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	Para uso na Impressora de Etiquetas Mr. Frosty
	Phomemo	M110-WH
Mancha de Mortos-Vivos	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Comporta até 18 tubos. 2 Mr. Frostys necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Pipeta Multidispense	Brandtech	705110
Pontas de Pipeta Multidispense	Brandtech	705744	Aproximadamente 3 ponteiras necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection P1000 Pipeta	Gilson	F144059M
Pipeta P20	Gilson	F144056M	Para uso na contagem de células; o volume necessário depende do método de contagem de células usado.
Etiquetas de impressora	Phomemo	PM-M110-3020	Aproximadamente 45 etiquetas necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Aproximadamente 5 etiquetas necessárias por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados
EDTA livre de RNase (0,5 M)	Invitrogen	AM9260G	Aproximadamente 40 µ L necessário por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados
PBS livre de RNase (10X)	Invitrogen	AM9625	Aproximadamente 1 mL necessário por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Aproximadamente 80 mL necessários por paciente ou condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Pipetas de transferência	Fisherbrand	13-711-7M	Aproximadamente 5 necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy
Coat Collection Tube	Holder Endicott-Seymour	14-781-15	Suporta até 80 Tubos CPT/EDTA