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Artigo de método

Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes

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DOI:

10.3791/66794

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25 de outubro de 2024

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um guia acessível para coletar, armazenar e descongelar células mononucleares do sangue periférico adequado para análises e fluxos de trabalho a jusante, como citometria de fluxo e sequenciamento de RNA. Coleções de plasma e pelagem leucocitária também são demonstradas.

Resumo

As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são comumente usadas em pesquisas biomédicas sobre o sistema imunológico e sua resposta a doenças e patógenos. Este protocolo detalhado descreve o equipamento, suprimentos e etapas para isolar, criopreservar e descongelar PBMCs de alta qualidade e altamente viáveis de células sanguíneas totais, adequadas para aplicações a jusante, como citometria de fluxo e sequenciamento de RNA. Protocolos para processamento de plasma e buffy coat do sangue total em paralelo e simultaneamente com PBMCs também são descritos. Este protocolo passo a passo fácil de seguir, que utiliza centrifugação de gradiente de densidade para isolar PBMCs, é acompanhado por uma lista de verificação de suprimentos, equipamentos e etapas de preparação. Este protocolo é adequado para indivíduos com qualquer experiência prévia com técnicas laboratoriais e pode ser implementado em laboratórios clínicos ou de pesquisa. A viabilidade celular de alta qualidade e o sequenciamento de RNA resultaram de PBMCs coletadas por operadores sem experiência laboratorial anterior usando este protocolo.

Introdução

Este protocolo demonstra um método acessível e um fluxo de trabalho para o isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) do sangue total. Este protocolo é especialmente direcionado a técnicos de pesquisa iniciantes, estudantes e equipe de laboratório clínico com o objetivo de facilitar a coleta e criopreservação de PBMCs sem pressupor treinamento prévio em técnicas de laboratório.

Este protocolo utiliza centrifugação para separar os componentes do sangue total por densidade. O sangue total consiste em quatro componentes principais listados em ordem decrescente de densidade: glóbulos vermelhos/eritrócitos (~45% do volume), glóbulos brancos (<1% do volume), plaquetas (<1% do volume) e plasma (~55% do volume)1,2,3,4,5,6. Os glóbulos brancos podem ser subdivididos em duas categorias com base nas características de seus núcleos: redondos ou multinucleados6. As PBMCs são definidas como glóbulos brancos com núcleos redondos e consistem nos seguintes tipos celulares: linfócitos (células T, células B, células NK), células dendríticas e monócitos6. Os glóbulos brancos multinucleados incluem granulócitos, que consistem nos seguintes tipos de células: neutrófilos, basófilos e eosinófilos6. Os glóbulos brancos multinucleados são mais densos que os PBMCs6. As densidades de cada componente do sangue total estão detalhadas na Tabela 1.

Neste protocolo, o sangue total é coletado em tubos de centrifugação com gradiente de densidade. Esses tubos contêm um meio de gradiente de densidade pré-embalado com densidade de 1,077 g/mL. Após a centrifugação, as células mais densas, incluindo leucócitos e eritrócitos multinucleados, são separadas das PBMCs e plaquetas pelo meio de gradiente de densidade (Figura 1A)6,7. O PBMC e a fração plaquetária são então coletados, lavados e centrifugados para remover as plaquetas. Os PBMCs purificados resultantes são coletados e armazenados a -80 °C ou em nitrogênio líquido. As PBMCs criopreservadas podem ser descongeladas de forma viável e usadas diretamente em análises posteriores ou processadas adicionalmente para isolar tipos específicos de células componentes.

Este protocolo foi otimizado para sequenciamento de RNA de alta qualidade de PBMCs altamente viáveis. Neste artigo, as PBMCs foram isoladas e criopreservadas de pacientes em um ambulatório. Posteriormente, os monócitos foram isolados de PBMCs por FACS e analisados via sequenciamento de RNA. No entanto, o protocolo pode ser amplamente adaptado a outras necessidades experimentais, como cultura de células, edição de genes, estudos funcionais ex-vivo, análises de células únicas, fenotipagem por citometria de fluxo ou citometria por tempo de voo, isolamento de DNA/RNA ou proteínas, lâminas para imuno-histoquímica, entre outros 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Além da coleta de PBMC de tubos de centrifugação com gradiente de densidade, este protocolo analisa como coletar plasma e revestimento leucocitário por centrifugação usando um tubo de EDTA. Após a centrifugação, o sangue total é separado em plasma, eritrócitos e uma fina camada de interface denominada buffy coat contendo leucócitos (Figura 1B)6. O buffy coat é comumente usado para extração de DNA e análises genômicas subsequentes19,20. A camada plasmática contém os componentes livres de células do sangue total e pode ser usada para ensaios de biomarcadores21,22.

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Protocolo

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Programa de Proteção Humana da UCSD e KUMC e está em conformidade com a Declaração de Helsinque. Todos os indivíduos forneceram consentimento informado para participação e coleta de sangue.

1. Processamento e criopreservação de PBMCs

  1. Um dia antes da colheita de sangue, imprima a lista de verificação dos materiais e reagentes enumerados no Quadro 2 e prepare e rotule em conformidade.
    NOTA: Este protocolo foi projetado para a coleta de 6 tubos de centrifugação com gradiente de densidade. Cada tubo produz cerca de 12 milhões de PBMCs, dos quais aproximadamente 50% e 20% serão linfócitos e monócitos vivos, respectivamente. Dimensione de acordo com as necessidades experimentais. Observe que o número absoluto de células pode diferir significativamente entre pacientes ou condições de tratamento.
  2. Usando a técnica padrão de flebotomia, colete sangue total em 6 tubos de centrifugação com gradiente de densidade e 1 tubo de EDTA até encher, aproximadamente 6 mL de volume.
    NOTA: Se forem necessárias amostras de vários pacientes ou condições de tratamento, os tubos coletados podem ser armazenados por até 4 h e depois processados simultaneamente.
  3. Após a coleta, centrifugue todos os tubos a 1.800 x g por 20 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Consulte o Vídeo Suplementar 1 para obter uma demonstração de como operar uma centrífuga.
  4. Após a centrifugação, abra cuidadosamente o tubo de centrifugação do gradiente de densidade. Use uma pipeta de transferência para remover e descartar a camada amarela translúcida contendo plasma. Não perturbe a camada nebulosa de células diretamente acima do meio gradiente de densidade. Erre por excesso de cautela, deixando o excesso de plasma em vez de descartar PBMCs. Repita para todos os tubos.
    NOTA: Após a centrifugação do tubo contendo o meio de gradiente de densidade, o plasma e os PBMCs estarão acima do meio de gradiente de densidade; eritrócitos e granulócitos se depositarão no fundo. Consulte a Figura 1A para obter uma visualização.
  5. Com uma nova pipeta de transferência, pipetar o volume restante contendo células e plasma residual em cada tubo para cima e para baixo suavemente várias vezes acima do meio de gradiente de densidade.
  6. Após a ressuspensão, pipete o conteúdo ressuspenso do tubo em um tubo cônico de 50 mL rotulado. Repita para todos os tubos.
  7. Despeje a Solução 1 (Meio RPMI) no tubo de 50 mL até atingir a linha de 50 mL.
  8. Repita as etapas 1.4 a 1.7 para cada paciente ou condição de tratamento, conforme necessário.
    NOTA: Certifique-se de que amostras diferentes não sejam misturadas e use uma nova pipeta de transferência para evitar contaminação.
  9. Centrifugue o tubo de 50 ml a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
    NOTA: O protocolo de coleta de plasma e buffy detalhado na Seção 2 pode ser concluído durante esse período.
  10. Descarte o máximo possível de sobrenadante. Toque conforme necessário para remover gotas residuais.
    NOTA: Após a centrifugação, o pellet contém PBMCs e o sobrenadante contém plaquetas e plasma residual.
  11. Despeje um tubo de 15 mL de Solução 2 (meio RPMI + 12,5% de albumina sérica humana + 1 μM de flavopiridol) no tubo cônico de 50 mL contendo o pellet PBMC. Inverta suavemente o tubo para ressuspender o pellet celular.
  12. Aspire 15 mL de Solução 3 (Meio RPMI + 11,25% de Albumina Sérica Humana + 1 μM de Flavopiridol + 10% de DMSO) usando uma pipeta de transferência. Adicione gota a gota ao tubo de 50 mL.
    NOTA: A solução 3 contém DMSO, que é tóxico para as células à temperatura ambiente. Não adicione a Solução 3 até que ela esteja pronta para ser processada imediatamente.
  13. Inverta o tubo suavemente 3 vezes para misturar.
  14. Encha cada criovial pré-rotulado e pré-resfriado com 1 mL de PBMCs usando uma pipeta de distribuição múltipla.
    NOTA: Consulte o Vídeo Suplementar 2 para obter uma demonstração de como operar uma pipeta de distribuição múltipla.
  15. Coloque os criogeniais dentro de um recipiente de congelamento pré-resfriado. Em seguida, mova o recipiente para um freezer a -80 °C.
  16. Repita as etapas 1.9 a 1.13 para cada paciente ou condição de tratamento, conforme necessário.
  17. Mantenha os criogenianos dentro do recipiente de congelamento por no mínimo 12 h e, em seguida, transfira-os para uma caixa de armazenamento rotulada a -80 °C.
    NOTA: Como alternativa, transfira os criotubos congelados para nitrogênio líquido (<-135 ° C) para armazenamento de longo prazo.

2. Processamento de plasma e revestimento leucocitário de tubos de EDTA

  1. Centrifugue a 1.800 x g por 10 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Após a centrifugação, a camada superior consiste em plasma, a inferior contém eritrócitos e a interface será o revestimento leucocitário. Consulte a Figura 1B para obter uma visualização.
  2. Usando uma nova pipeta de transferência, extraia o máximo de plasma possível sem perturbar a camada de revestimento leucocitário. Em seguida, dispense alíquotas de 0,5 mL em criogenias pré-marcadas. Aspire a camada de revestimento leucocitário e transfira-a para o criogênico devidamente marcado.
    NOTA: Alguns plasmócitos e eritrócitos podem contaminar a coleção de pelagem leucocitária.
  3. Repita a etapa 2.2 para cada paciente ou condição de tratamento, conforme necessário.
  4. Após a coleta, armazene os criogenianos em um freezer a -80 °C.
    NOTA: Como alternativa, armazene em nitrogênio líquido (<-135 °C) para armazenamento de longo prazo.

3. Descongelamento de PBMCs

  1. Um dia antes do descongelamento, imprima uma lista de verificação de materiais e reagentes listados na Tabela 3 e prepare e rotule de acordo.
    NOTA: Este protocolo foi projetado para o descongelamento de 1 tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBMCs. Cada tubo produz aproximadamente 2 milhões de PBMCs, dos quais aproximadamente 50% e 20% serão linfócitos vivos e monócitos, respectivamente. Dimensione de acordo com as necessidades experimentais. Observe que o número absoluto de células pode diferir significativamente entre pacientes ou condições de tratamento.
  2. Transfira PBMCs congelados do armazenamento usando gelo seco e descongele em uma incubadora a 37 ° C por 4 minutos ou imediatamente antes do último descongelamento do cristal de gelo.
    NOTA: Se desejado, uma alíquota pode ser tomada para contagem de células e medições de viabilidade, conforme detalhado na Seção 4.
  3. Após o descongelamento, adicione 1 mL de Solução 4 (PBS + 2 mM EDTA) a cada criogenial. Em seguida, despeje o conteúdo em um tubo pré-rotulado de 50 mL contendo 10 mL da Solução 4 para cada tubo de PBMC descongelado. Toque para remover gotas residuais.
  4. Coloque o filtro de células no tubo vazio de 50 mL e, em seguida, despeje a suspensão de células através do filtro de células.
    NOTA: Se necessário, bata levemente para quebrar a tensão superficial.
  5. Centrifugue cada tubo contendo as células coadas a 400 x g por 7 min em temperatura ambiente.
  6. Após centrifugação, despeje o sobrenadante contendo DMSO. Toque conforme necessário para remover gotas residuais.
  7. Ressuspenda o pellet celular no meio desejado apropriado para as necessidades experimentais a jusante (por exemplo, meio de cultura celular, coquetel de anticorpos por citometria de fluxo, etc.).

4. Contagem e viabilidade de células

  1. Imediatamente após o descongelamento dos PBMCs congelados na etapa 3.2, pipetar 20 μL de células em um tubo de 1,5 mL. Adicione um volume igual de solução de Trypan Blue a 0,4% e pipete para cima e para baixo suavemente 3-4 vezes para misturar.
  2. Usando um contador de células automatizado, siga o protocolo do fabricante para contar as células e avaliar a viabilidade. Certificar-se de que o factor de diluição de 2 é tido em conta.
    NOTA: Como descrito em outro artigo, um hemocitômetro pode ser usado como um método alternativo para avaliar a contagem e a viabilidade celular23.

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Resultados

Após a coleta e criopreservação de PBMC, a viabilidade de PBMCs, monócitos e linfócitos descongelados de 56 amostras únicas foi avaliada por citometria de fluxo usando reagentes listados na Tabela 4 seguindo as instruções dos fabricantes (Figura 2A-F). Foi alcançada uma viabilidade média ± DS de PBMCs, monócitos e linfócitos de 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% e 93 ± 5,6%, respectivamente (Figura 2G). A medição da viabilidade pela exclusão ...

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Discussão

Este protocolo para coleta e criopreservação de PBMC foi implementado com sucesso por indivíduos com e sem treinamento prévio em laboratório de pesquisa. Em nossa aplicação, o FACS e o sequenciamento de RNA de monócitos altamente viáveis purificados de PBMCs armazenados resultaram em sequências de alta qualidade.

Um dos principais pontos fortes deste protocolo é sua acessibilidade. A técnica apresentada no protocolo utiliza tubos pré-embalados com um meio grad...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros ou não financeiros relevantes a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer aos pacientes que ofereceram seu consentimento, tempo e doação de amostras de sangue. Também agradecemos ao Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton e Mark McClellen do Centro Médico da Universidade do Kansas por sua colaboração e pela implementação deste protocolo em um local remoto. CY recebeu apoio de pesquisa da concessão 1K08HL150271 do NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1000 µ L TipsGilsonF174501Aproximadamente 3 pontas necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tubo de 15 mLBiopioneeerCNT-15Para segurar Soluções 2/3
2 necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection 2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Aproximadamente 40 crioviais necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µ L DicasGilsonF174201Para uso na contagem de células; o volume necessário depende do método de contagem de células usado. 1 ponta é necessária por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados
50 mL Tubo cônicoCEM Corporation50-187-76832 necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 necessário por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados
CD14 Anticorpo Biolegend325621
Anticorpo CD16Biolegend360723
Anticorpo CD19Biolegend363007
Anticorpo CD3Biolegend300405
Anticorpo CD56Biolegend318303
Anticorpo CD66bBiolegend305103
Filtro de CélulasBiopioneeerDGN2583671 necessário por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados para serem descongelados Tubo de
Preparação de Células Mononucleares CPTBD Biosciences 3627536 tubos necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Contém 81 tubos
1 necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Armazena até 50 criogeniais
DMSOInvitrogen15575020Aproximadamente 2,5 mL necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Destilada Livre de DNase/RNaseInvitrogen10977015Aproximadamente 2 mL necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Aproximadamente 9 mL necessários por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados
Tubos EDTABD Biosciences3666431 tubo necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AnticorpoBiolegend307609
Soro Humano AlbuminaGeminiBio800-120Aproximadamente 25 mL necessários por paciente ou condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KPara uso na Impressora de Etiquetas Mr. Frosty
PhomemoM110-WH
Mancha de Mortos-VivosBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Comporta até 18 tubos.
2 Mr. Frostys necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Pipeta MultidispenseBrandtech705110
Pontas de Pipeta MultidispenseBrandtech705744Aproximadamente 3 ponteiras necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection P1000 PipetaGilsonF144059M
Pipeta P20GilsonF144056MPara uso na contagem de células; o volume necessário depende do método de contagem de células usado.
Etiquetas de impressoraPhomemoPM-M110-3020Aproximadamente 45 etiquetas necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Aproximadamente 5 etiquetas necessárias por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados
EDTA livre de RNase (0,5 M)InvitrogenAM9260GAproximadamente 40 µ L necessário por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados
PBS livre de RNase (10X)InvitrogenAM9625Aproximadamente 1 mL necessário por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVAproximadamente 80 mL necessários por paciente ou condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Pipetas de transferênciaFisherbrand13-711-7MAproximadamente 5 necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy
Coat Collection TubeHolder Endicott-Seymour14-781-15Suporta até 80 Tubos CPT/EDTA
Água

Referências

  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

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