Artigo de método

Modelagem in vitro da deposição de gordura na doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica

DOI:

10.3791/66810

⸱

19 de julho de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve o uso de células HepG2 induzidas por ácido oleico como modelo para doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A prevalência de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) aumentou devido a mudanças nos padrões econômicos e de estilo de vida, levando a desafios de saúde significativos. Relatórios anteriores estudaram o estabelecimento de modelos animais e celulares para MASLD, destacando diferenças entre eles. Neste estudo, foi criado um modelo celular induzindo o acúmulo de gordura em MASLD. As células HepG2 foram estimuladas com o ácido graxo insaturado ácido oleico em várias concentrações (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) para emular MASLD. A eficácia do modelo foi avaliada usando ensaios de contagem de células-8, coloração Oil Red O e análise do conteúdo lipídico. Este estudo teve como objetivo criar um modelo celular simples de operar para células MASSLD. Os resultados dos ensaios do kit de contagem de células-8 mostraram que a sobrevivência das células HepG2 foi dependente da concentração de ácido oleico, com um GI50 de 1,875 mM. A viabilidade celular nos grupos 0,5 mM e 1 mM foi significativamente menor do que no grupo controle (P < 0,05). Além disso, a coloração Oil Red O e a análise do conteúdo lipídico examinaram a deposição de gordura em concentrações variadas de ácido oleico (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) em células HepG2. O conteúdo lipídico dos grupos 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM foi significativamente maior do que o do grupo controle (P < 0,05). Além disso, os níveis de triglicerídeos nos grupos OA foram significativamente maiores do que os do grupo controle (P < 0,05).

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) engloba uma variedade de condições, incluindo esteatose simples, esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), cirrose e carcinoma hepatocelular 1,2,3,4,5,6, todas atribuídas a outros fatores além do consumo de álcool 7. A MASLD é a doença hepática mais prevalente causada por lesão hepática metabólica, afetando quase um quarto da população mundial 8,9,10,11,12. Embora a patogênese precisa do MASLD ainda não tenha sido elucidada, várias teorias tentam explicar seu desenvolvimento. Uma noção predominante sugere um afastamento da teoria clássica de "dois golpes" em direção a um modelo de "múltiplos golpes"1. Central para essas hipóteses é o papel da resistência à insulina, que se acredita ser fundamental na patogênese da MASLD13. Pesquisas indicam que a resistência à insulina nos hepatócitos leva ao aumento dos níveis de ácidos graxos livres, formando posteriormente triglicerídeos armazenados no fígado14,15.

Os pesquisadores usaram modelos in vivo e in vitro para simular a deposição de gordura em MASLD; No entanto, replicar totalmente seu mecanismo patológico continua sendo um desafio. Apesar dessa limitação, esses modelos têm sido fundamentais no estudo de potenciais alvos terapêuticos para MASLD. No entanto, o desenvolvimento de um modelo estável de MASLD é crucial. Embora os modelos animais sejam eficazes, eles são demorados e caros, destacando assim o crescente interesse em modelos celulares in vitro . Esses modelos geralmente usam ácidos graxos livres únicos ou múltiplos, como ácido oleico (OA) e ácido palmítico, para recriar MASLD induzido por dieta. Dentre estes, a linhagem celular de hepatoblastoma humano HepG2 é frequentemente utilizada para estabelecer modelos celulares in vitro de MASLD.

A indução da OA estimula as células HepG2 a replicar a deposição de gordura semelhante ao MASLD, um método com uma história bem estabelecida. O objetivo deste estudo foi demonstrar a viabilidade, a coloração Oil Red O (ORO), o conteúdo lipídico e o nível de triglicerídeos (TG) de células HepG2 tratadas com OA 0,25 mM. O objetivo deste experimento foi fornecer mais evidências para o desenvolvimento de estudos de modelagem MAFLD.

Protocolo

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NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Cultura de células

  1. Cultura de células HepG2 em frascos de cultura contendo Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco (contendo 10% de soro fetal bovino [FBS], 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Manter os frascos de cultura a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%.

2. Efeito do ácido oleico na viabilidade celular medida pelo kit de contagem de células-8

  1. Dissolver um volume específico de OA em dimetilsulfóxido (DMSO) até atingir uma concentração de 200 mM. Conservar a solução a -20 °C para utilização futura.
  2. Semeie células HepG2 em uma placa de 96 poços com uma densidade celular de 6 × 103 células por poço. Adicione 100 μL de DMEM a cada poço. Incubar e cultivar as células a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 por 24 h. Divida as células HepG2 em dois grupos:
    1. Grupo controle: adicionar meio de cultura celular.
    2. Grupo OA: adicione OA ao meio de cultura celular para atingir concentrações finais de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM.
  3. Após 24 h de incubação inicial, descartar o sobrenadante de cada alvéolo e adicionar OA de acordo com o agrupamento especificado, adicionando 100 μL por alvéolo. Para o grupo de controle, adicione 100 μL de meio de cultura de células a cada poço. Continue a incubar as células por mais 24 horas.
    NOTA: Certifique-se de que cada grupo tenha seis poços replicados. Para evitar a evaporação, adicione 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao anel externo de poços na placa de 96 poços.
  4. Após 24 h de incubação, adicione 10 μL de kit de contagem de células-8 (CCK-8) a cada poço, misture delicadamente e incube por 2 h no escuro. Retire a placa de 96 poços da incubadora, coloque-a no leitor de microplacas e meça o valor de absorbância a 450 nm (A450). Os valores do IG50 foram contados de acordo com a DO.

3. Coloração Oil Red O para observar a formação de gotículas lipídicas intracelulares

  1. Semeie células HepG2 em placas de cultura de células de 6 poços a uma densidade de 5 × 105 células por poço e cultive as placas em uma incubadora de temperatura constante por 24 h. Consulte a Figura 1 para obter uma representação visual das etapas descritas.
  2. Após 24 h de cultura celular, adicione 2 mL de meio de cultura celular contendo OA a cada poço, atingindo concentrações finais de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM. Após mais 24 horas, remover o meio de cultura celular de cada alvéolo e lavar duas vezes com PBS. Adicione 1 mL de fixador ORO a cada poço e incube por 30 min.
  3. Prepare a solução de coloração ORO misturando a solução de coloração A com a solução de coloração B na proporção de 3:2. Deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por 10 min e, em seguida, filtre-a uma vez com um filtro de 0,45 μm. Conservar a solução filtrada num tubo de centrifugação protegido da luz até à utilização.
  4. Descarte o fixador e lave duas vezes com água destilada. Adicione 1 mL de isopropanol a 60% em cada poço e incube por 30 s. Descarte 60% da solução de isopropanol e adicione 1 mL de solução de coloração ORO recém-preparada em cada poço antes de incubar por 20 min. Descarte a solução de coloração ORO, adicione 1 mL de isopropanol a 60% em cada poço e incube por 30 s. Lave 5x com água para remover o excesso de corante.
  5. Cubra as células com água destilada e observe ao microscópio. Depois que as imagens forem coletadas, descarte o líquido na placa e deixe secar. Em seguida, adicione 2 mL de isopropanol a cada poço e agite a placa em um agitador orbital por 10 min. Transfira o líquido para uma nova placa de 96 poços, com 16 poços em cada grupo, adicionando 100 μL por poço. Calcular o teor de lípidos medindo a densidade ótica (DO) de cada alvéolo utilizando um leitor de microplacas a 510 nm (A510).

4. Efeitos de diferentes concentrações de ácido oleico sobre triglicerídeos totais em sobrenadantes de células HepG2

  1. Equilibre o kit em temperatura ambiente por 20 min e prepare as placas necessárias para o experimento.
  2. Recolher o sobrenadante da célula e centrifugar a 1.570 × g durante 10 min. Defina poços padrão e teste de poços de amostra. Adicione 50 μL de concentração padrão ([S0 → S5] seguido por: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol / L) aos poços padrão. Além dos poços em branco e padrão, adicione 10 μL de amostras diferentes aos poços de amostra, seguido pela adição de 40 μL de diluente de amostra a cada poço. Adicionar 100 μL de peroxidase de anticorpo-rábano de detecção a cada alvéolo, selar com uma membrana de placa e incubar a 37 °C durante 1 h numa estufa de temperatura constante.
  3. Descarte o sobrenadante, seque em papel livre de poeira e lave cada poço com 1x solução de lavagem. Deixe repousar em temperatura ambiente por 1 min. Repita o processo de lavagem 5x.
  4. Adicione 50 μL de substrato A e 50 μL de substrato B a cada poço. Misture delicadamente e incube por 15 min a 37 °C. Adicione 50 μL de solução de terminação a cada poço e meça o valor OD de cada poço a 450 nm (A450) em 15 min.
  5. Plote a concentração do padrão ao longo do eixo x e o valor de absorbância (OD) correspondente ao longo do eixo y para realizar a regressão linear e derive a equação da curva para calcular o valor da concentração de cada amostra.

5. Análise estatística

  1. Determine diferenças significativas nos dados quantitativos.
  2. Calcule a média ± desvio padrão (DP) e represente graficamente os dados. Considere P < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

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Efeito do ácido oleico na viabilidade celular
As células HepG2 foram expostas a concentrações variadas de OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), resultando em uma diminuição nas taxas de sobrevivência celular em 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM em comparação com 0 mM. Observou-se significância estatística em 0,5 mM (P < 0,05) e 1 mM (P < 0,05) quando comparados a 0 mM. Os resultados do impacto da OA na viabilidade celular, conforme avaliado pelo kit CCK-8, são mostrados na Figura 2. O valor GI50 para células HepG2 tratadas com OA foi calculado como 1,875 mM.

Coloração Oil Red O para observar a formação de gotículas lipídicas intracelulares
A coloração ORO é um método comumente usado para visualização lipídica 16,17. Consequentemente, a formação de gotículas lipídicas em células HepG2 incubadas com OA por 24 h foi observada ao microscópio após a coloração ORO. Conforme mostrado na Figura 3 e na Figura 4, a intensidade da coloração vermelha nas células tratadas com OA foi maior do que nas células não tratadas. Gotículas lipídicas vermelhas estavam presentes no plasma das células HepG2 após o tratamento com OA, com as quantidades de gotículas lipídicas e lipídios aumentando com o aumento das concentrações de OA (Figura 5).

Efeitos de diferentes concentrações de ácido oleico sobre triglicerídeos totais em sobrenadantes de células HepG2
Os achados experimentais, conforme ilustrado na Figura 6, revelaram que, em comparação com o grupo controle, o tratamento de células HepG2 com concentrações variadas de OA (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) resultou em um aumento significativo no conteúdo de TG do sobrenadante celular no grupo OA (P < 0,05).

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Figura 1: Fluxograma para coloração Oil Red O. Abreviaturas: OA = ácido oleico; OD = densidade óptica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Efeito do ácido oleico na viabilidade celular, avaliado usando um ensaio de contagem de células-8. Cada barra representa a média ± DP (n = 6). *P < 0,05. Abreviatura: OA = ácido oleico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagens de coloração Oil Red O de vários pontos de tempo (direções de 3, 6, 9 e 12 horas). A formação de gotículas lipídicas foi detectada usando um microscópio invertido para cultura de células com aumento de 40x. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Efeito do ácido oleico nas gotículas lipídicas nas células, avaliado através da coloração Oil Red O. A formação de gotículas lipídicas foi detectada usando um microscópio invertido para cultura de células com aumento de 40x. Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Efeito do ácido oleico no conteúdo lipídico nas células, avaliado pelo valor da densidade óptica. As mudanças relativas de dobra são apresentadas nos valores de densidade óptica em diferentes grupos. Cada coluna representa a média ± DP (n = 16). *P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Efeitos de várias concentrações de ácido oleico nos níveis de triglicerídeos totais no sobrenadante de células HepG2. Alterações relativas de dobras são apresentadas no valor dos níveis de triglicerídeos em diferentes grupos. Cada coluna representa a média ± DP (n = 3). *P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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A MASLD é uma síndrome clínico-patológica caracterizada pela deposição excessiva de gordura intracelular nos hepatócitos devido a fatores além do álcool e outros agentes prejudiciais ao fígado estabelecidos18. A MASLD está intrinsecamente ligada à lesão hepática por estresse metabólico adquirido, notadamente associada à resistência à insulina e à suscetibilidade genética. Para estudar e rastrear efetivamente os medicamentos para MASLD, é crucial selecionar um modelo experimental apropriado. O estabelecimento de um modelo celular é particularmente vital na pesquisa do MASLD, facilitando uma compreensão mais profunda dos mecanismos patológicos e a avaliação dos efeitos de novos medicamentos.

Este protocolo descreve um modelo in vitro de MASLD estabelecido por meio de células HepG2 induzidas por OA. A coloração ORO e a análise do conteúdo lipídico servem como métodos críticos para a criação deste modelo. Além disso, avaliar a viabilidade celular e o conteúdo total de TG nos sobrenadantes celulares é essencial para avaliar a concentração apropriada de OA. O critério diagnóstico para MASLD envolve a presença de mais de 5% de TG armazenado nas células hepáticas 19,20. Os modelos de células MASLD dependem principalmente de células HepG2 21,22,23,24,25,26,27,28, conhecidas por sua utilização bem-sucedida na construção de modelos de degeneração hepática gordurosa em vários estudos nacionais e internacionais. Apesar de serem originárias de células de hepatoma, as células HepG2 compartilham muitas características fenotípicas com os hepatócitos e são facilmente cultivadas e propagadas29,30. Testes como o kit CCK-8, coloração ORO, conteúdo lipídico e medições de TG total oferecem abordagens simples, objetivas e razoáveis para avaliar a viabilidade celular, o acúmulo de gordura e o conteúdo lipídico nos sujeitos do estudo. Nesse contexto, a OA se alinha com a patogênese do MASLD31, onde o excesso de energia é armazenado na forma de lipídios quando a ingestão de energia excede o consumo.

Os pesquisadores utilizaram OA 23,28,31,32,33, ácido palmítico 34,35 e combinações de ácido oleico/palmítico26,36 para replicar o modelo MASLD. Tanto o ácido palmítico quanto a OA contribuem para a degeneração gordurosa do fígado e o acúmulo de TG. O ácido palmítico, o ácido graxo saturado mais abundante no corpo humano, apresenta lipotoxicidade significativa, levando ao acúmulo de lipídios nos hepatócitos, aumento dos radicais reativos intracelulares de oxigênio e morte ou necrose celular37. Por outro lado, a OA leva a uma deposição intracelular de TG mais pronunciada (Figura 6) e menor modulação celular38. Assim, os pesquisadores costumam utilizar células HepG2 induzidas por OA para estabelecer modelos MASLD in vitro. Conforme descrito na etapa 2.2.2 do protocolo, é crucial aquecer a solução OA ao adicioná-la. Neste estudo, a coloração ORO e a análise do conteúdo lipídico foram baseadas na deposição lipídica de células HepG2, apoiando efetivamente a exploração de modelos in vitro de MASLD com mecanismos complexos e reduzindo o tempo e o custo necessários para a pesquisa.

O ORO liga-se prontamente ao TG em forma de gotícula, produzindo coloração laranja a vermelha indicativa de gordura, com intensidade de cor dependendo da concentração de lipídios. No entanto, a solução de coloração ORO é instável e propensa a precipitação, tornando-a inadequada para preparação antecipada. Portanto, a solução de coloração ORO foi preparada após a etapa 3.2 do protocolo, com precauções tomadas para evitar a exposição à luz durante a preparação e incubação (etapas 3.2, 3.3 do protocolo). Na etapa 3.5 do protocolo, a seleção de imagens em vários pontos de tempo (direções de 3, 6, 9 e 12 horas) representa uma modificação importante do experimento que é essencial para melhorar a precisão dos resultados. Embora concentrações elevadas de OA afetem a sobrevivência celular, representando uma limitação desse método, foi demonstrado que uma concentração adequada de OA garante a viabilidade celular.

Este estudo empregou uma abordagem abrangente, usando um kit CCK-8, coloração ORO, análise do conteúdo lipídico e medição de TG total para estabelecer e validar o modelo de MASLD. O kit CCK-8 foi usado para avaliar o efeito dos medicamentos na viabilidade celular, servindo como uma etapa crucial de validação. No futuro, esse modelo é promissor para triagem de drogas e pesquisa de mecanismos destinados a entender a patogênese do MASLD e identificar possíveis alvos terapêuticos. Para garantir ainda mais a qualidade da confiabilidade da validação, os níveis de expressão das proteínas-alvo implicadas no modelo serão analisados usando análises de western blotting e reação em cadeia da polimerase quantitativa.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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O estudo atual foi concedido pelo "Estudo sobre as principais questões do efeito curativo de Koumiss nas doenças regionais da medicina mongol" em 2018 Projeto Apoiado do programa de ciência e tecnologia do Departamento de Ciência e Tecnologia da Região Autônoma da Mongólia Interior.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ filtro mMillex
0.25% Tripsina-EDTA (1x) Tripsina-EDTAGibco25200-056
0.45 µ filtro mFrascos
2 mLCORNING430659
25 cm2 Frasco de culturaCORNING430639
placa de cultura de células de 6 poçosCORNING3516
placa de cultura de células de 96 poçosCORNING3599
Placa de hemogramaShanghai Jing Jing Reagente bioquímico & Instrumento Co.
Contagem de Células Kit-8 ensaiosBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. CA1210-1000T
Incubadora de CO2NUAIRENU-5710E
  DMSO Dimetilsulfóxido Pequim Solarbio Ciência & Technology Co.,Ltd. D8371
Dulbecco Modificado Eagle MédioGibco8122691
Equipamento de Rotulagem de EnzimasTecanSpark
Soro Bovino Fetal,Gibco10099141
HepG2Pequim Norte da China Instituto de Pesquisa de Biotecnologia Chuanglian (BNCC)221031
Triglicerídeo Humano (TG) ELISA instruçãoInstituto de Bioengenharia Nanjing Jiacheng20170301
Microscópio Invertido para Cultura de CélulasLeicaDMi1 
Reagentequímico Co. de Isopropanol Tianjin Zhiyuan.
2021030141 jogo vermelho da mancha do óleo, para a ciência cultivadade Beijing Solarbio das pilhas & Technology Co.,Ltd. G1262
Ácido oleico Fornecedor verificado - Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Penicilina EstreptomicinaGibco15140122
SPSS 24.0Software
crigênicos Millex celular 02270113 Linha de células qualificada A502071 de estatística

Referências

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