Modelagem Avançada de Aneurisma da Aorta Abdominal em Camundongos por Combinação de Elastase Tópica e ß-aminopropionitrila Oral

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem cirúrgica metódica para modelar aneurismas avançados da aorta abdominal em camundongos por uma combinação de aplicação direta de elastase na aorta infrarrenal e administração de ß-aminopropionitrila através da água potável.

Resumo

O modelo murino de elastase tópica de aneurisma da aorta abdominal (AAA) é aprimorado quando combinado com água potável suplementada com ß-aminopropionitrila (BAPN) para produzir de forma confiável aneurismas infrarrenais verdadeiros com comportamentos que imitam AAAs humanos. A aplicação tópica de elastase na adventícia da aorta infrarrenal causa dano estrutural às camadas elásticas da parede aórtica e inicia a dilatação do aneurisma. A co-administração de BAPN, um inibidor da lisil oxidase, promove a degeneração sustentada da parede, reduzindo a reticulação de colágeno e elastina. Essa combinação resulta em grandes AAAs que se expandem progressivamente, formam trombo intraluminal e são capazes de se romper. O refinamento de técnicas cirúrgicas, como o isolamento circunferencial de todo o segmento aórtico infrarrenal, pode ajudar a padronizar o procedimento para uma aplicação consistente e completa da elastase pancreática suína, apesar dos diferentes operadores e variações anatômicas entre os camundongos. Portanto, o modelo elastase/BAPN é uma abordagem refinada para induzir cirurgicamente AAA em camundongos, o que pode recapitular melhor os aneurismas humanos e fornecer oportunidades adicionais para estudar o crescimento do aneurisma e o risco de ruptura.

Introdução

Um aneurisma é definido como uma dilatação patológica de um vaso sanguíneo maior que 50% do diâmetro do vaso saudável¹. Apesar de os aneurismas da aorta abdominal (AAA) serem uma condição comumente encontrada na população idosa, com incidência de cerca de >5% dos homens > 65 anos de idade, não existem estratégias terapêuticas direcionadas para o tratamento do AAA¹. O tratamento atual do AAA é limitado à redução dos fatores de risco e reparo cirúrgico com cirurgia aberta ou endovascular com base no diâmetro da aorta ou na taxa de crescimento². O maior perigo do AAA é a ruptura do aneurisma, que é fatal se não for tratada, e o reparo nesse cenário emergente pode acarretar riscos de mortalidade acima de 90%¹.

A fisiopatologia do AAA é complicada, multifatorial e não totalmente compreendida³. As características do AAA humano incluem dilatação aneurismática verdadeira da parede aórtica com infiltração de células inflamatórias, presença de trombo intraluminal e dilatação progressiva que leva a eventual ruptura ^3,4. Além disso, os AAAs estão associados à idade avançada, têm predominância sexual masculina:feminina de 9:1 e ocorrem mais comumente na aorta infrarrenal⁵. Modelar todas as características e comportamentos de AAAs humanos em animais continua sendo um desafio contínuo⁶.

A modelagem atual do AAA é conduzida principalmente em camundongos, e os aneurismas são comumente induzidos usando um dos três métodos - por infusão de angiotensina II (AngII) por meio de uma bomba osmótica implantada por via subcutânea e por aplicação direta de cloreto de cálcio (CaCl₂) ou elastase na aorta⁷. Neste último método, a elastase pancreática suína (PPE) é aplicada a um segmento da aorta infrarrenal e causa degradação enzimática das fibras de elastina dentro da lamela elástica da túnica média. Esse dano estrutural resulta no enfraquecimento da parede aórtica e na dilatação externa do aneurisma. O uso de elastase tópica isoladamente, no entanto, produz aneurismas infrarrenais relativamente pequenos, que não aumentam ou se rompem progressivamente ao longo do tempo. Mais recentemente, Lu et al. melhoraram esse modelo administrando adicionalmente β-aminopropionitrila (BAPN), um inibidor irreversível da lisil oxidase, a seus camundongos tratados com elastase⁸. Ao impedir a reticulação das fibras de elastina e colágeno, a suplementação de BAPN faz com que as aortas danificadas por elastase se dilatem progressivamente até o ponto de ruptura. O modelo elastase/BAPN também tem uma taxa de incidência de AAA maior do que o modelo de elastase tópica, e os aneurismas produzidos também são maiores e contêm trombo intraluminal⁸.

No modelo elastase/BAPN, o grau de dissecção cirúrgica e a exposição da aorta à elastase podem impactar no sucesso e na replicabilidade desse modelo. Neste manuscrito, descrevemos que a administração concomitante de água potável do BAPN e a aplicação tópica de elastase na aorta após o isolamento circunferencial de todo o segmento aórtico infrarrenal melhora a replicabilidade, explica as diferenças anatômicas entre os animais e resulta em uma maior taxa de indução de AAA, tamanhos de aneurismas e incidência de ruptura. Neste artigo, descreveremos uma abordagem padronizada para induzir de forma confiável aneurismas avançados da aorta abdominal em camundongos usando uma combinação de água suplementada com elastase tópica e BAPN.

Protocolo

Os protocolos de animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison (M005792).

1. Manutenção animal

1. Crie ratos com ração de manutenção padrão. Use camundongos adultos ou camundongos adultos jovens (8-12 semanas de idade).
   NOTA: O uso de adultos garante que os animais tenham atingido a maturidade total e limita qualquer chance de que mudanças no diâmetro da aorta possam estar relacionadas ao crescimento animal. Para este estudo, utilizamos camundongos C57BL/6J machos e fêmeas com idade entre 22 e 24 semanas no momento da cirurgia. Lu e colegas não observaram diferenças significativas na resposta aneurismática entre camundongos mais jovens e mais velhos⁸. Além disso, enquanto a maioria dos modelos de aneurisma é realizada em camundongos machos, este modelo induz com sucesso AAAs em camundongos machos e fêmeas⁹.
2. Determine a duração do estudo e atribua os animais a grupos de tratamento ou simulados (controle). Administre água potável BAPN a 0,2% aos camundongos do grupo de tratamento e submeta-os a cirurgia com aplicação tópica de elastase ativa na aorta infrarrenal. Administrar água não tratada a animais de controle e submetê-los a cirurgia com aplicação de elastase desnaturada na aorta infrarrenal.

2. Iniciação de água potável suplementada com B-aminopropionitrila (BAPN)

1. Dois dias antes da cirurgia, inicie o tratamento com camundongos com água potável BAPN a 0,2%. Prepare água BAPN em volumes maiores e armazene-a no escuro a 4 °C por até 28 dias. Certifique-se de que a água BAPN atinja a temperatura ambiente antes de dá-la aos ratos.
   NOTA: Recomendamos que a água BAPN seja substituída em gaiolas a cada 7 dias durante a duração do estudo.

3. Preparação do material do dia da cirurgia

1. Corte as luvas cirúrgicas em tiras de 5 mm x 10 mm, que serão usadas posteriormente para ajudar a isolar a aorta antes do tratamento com elastase. Prepare um campo cirúrgico cortando um oval de ~ 1,5 cm x 3 cm no centro de um campo cirúrgico. Desdobre a gaze 2 pol x 2 pol e corte ao meio para criar tiras de gaze de aproximadamente 2,5 cm x 10 cm para serem usadas posteriormente para retração do conteúdo abdominal. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos (consulte a Tabela de Materiais) e configure um campo cirúrgico estéril, conforme mostrado no exemplo na Figura 1.

Figura 1: Exemplo da configuração da cirurgia estéril em preparação para o modelo murino de elastase/BAPN de AAA. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrila; AAA = aneurisma da aorta abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Prepare uma gaiola de recuperação pós-operatória colocando uma gaiola limpa sob uma lâmpada de calor e coloque solução salina perto da lâmpada para aquecer até a temperatura corporal (37 ° C). Certifique-se de que a lâmpada de calor esteja posicionada com segurança de forma que a gaiola de recuperação e a solução salina estejam quentes, mas não ultrapassem 37 °C. Ligue a bomba de água para começar a circular água morna pela almofada de aquecimento.

4. Preparação do animal para a cirurgia

1. Coloque os camundongos em uma câmara de indução e anestesize-os com isoflurano a 5% a 200 mL / min usando um vaporizador eletrônico de baixo fluxo. Enquanto anestesiado, pese cada camundongo e administre 0,6 mg / kg de buprenorfina ER e 20 mg / kg de carprofeno por via subcutânea para analgesia. Use aparadores de cabelo elétricos para cortar o pelo do abdômen, da parte inferior do abdômen à parte inferior do processo xifóide. Use gaze ou um lenço umedecido para escovar o excesso de pelos. Retorne os camundongos à gaiola e espere pelo menos 20 minutos para que a analgesia faça efeito antes de prosseguir com a cirurgia.
2. Após pelo menos 20 minutos desde a administração da analgesia, coloque o camundongo em uma câmara de indução de anestesia e novamente administre isoflurano a 5% a 200 mL / min usando um vaporizador eletrônico de baixo fluxo até que o camundongo esteja sedado.
3. Remova o camundongo sedado da câmara de indução e coloque-o em decúbito dorsal no campo cirúrgico. Aplique gel para os olhos e prenda o cone do nariz com fita cirúrgica. Reduza o isoflurano inalado administrado para uma taxa de manutenção de 1-2% a 50 mL / min. Prenda as patas dianteiras e traseiras do mouse com fita cirúrgica.
4. Examine a parte inferior do abdômen do camundongo em busca da bexiga. Aplique suavemente pressão externa na bexiga entre os dedos polegar, indicador e médio para induzir a micção; Enquanto isso, use um pedaço de gaze para absorver a urina.
   NOTA: Tenha cuidado para não contaminar o campo cirúrgico.
5. Comece a desinfetar o abdômen aplicando um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool 70% com cotonetes. Comece no centro do abdômen e trabalhe para fora em movimentos circulares 3x. Deixe a área secar brevemente entre as aplicações.
6. Verifique se há falta de resposta ao beliscão do dedo do pé para garantir que a anestesia seja adequada. Certifique-se de que o cone e os membros do nariz estejam presos. Coloque uma cortina cirúrgica sobre o mouse, com a abertura diretamente sobre o abdômen preparado cirurgicamente.
   NOTA: Não arraste a cortina pelo mouse para evitar uma possível contaminação.

5. Indução cirúrgica de AAA

1. Entrando na cavidade abdominal:
   1. Lave as mãos e use luvas cirúrgicas limpas de nitrilo ou estéreis. Antes de entrar em contato com o campo cirúrgico, sempre borrife luvas com 70% de EtOH e esfregue as mãos enluvadas até secar.
   2. Use uma pinça romba para cobrir a pele na linha média do abdômen. Use uma tesoura cirúrgica para fazer um pequeno corte na pele e, em seguida, estenda a incisão longitudinalmente, com cerca de 2-3 cm de comprimento.
   3. Use uma pinça para levantar os músculos retos para identificar a linha alba translúcida. Use uma tesoura para entrar na cavidade abdominal através da linha alba e, em seguida, estenda ao longo da linha alba proximal e distalmente.
2. Expondo a aorta abdominal:
   1. Umedeça uma tira de gaze e dois cotonetes com soro fisiológico aquecido. Crie um rolo abdominal rolando firmemente uma extremidade da gaze até a metade, deixando uma cauda generosa.
   2. Use um afastador de pele para retrair a parede abdominal direita.
   3. Usando cotonetes umedecidos, execute uma rotação visceral medial direita varrendo suavemente os intestinos delgado e grosso para o quadrante superior esquerdo e visualize a aorta e a veia cava inferior (VCI). Use um rolo abdominal para retrair o intestino para fora da vista - dobre a extremidade enrolada da gaze embaixo do intestino e, em seguida, traga a extremidade da cauda ao redor e para fora do corpo para envolver suavemente o intestino. Aplique uma tensão suave na cauda da gaze para manter o intestino fora do campo de visão. Ajuste o rolo abdominal e o afastador de pele para obter uma visão ideal dos órgãos retroperitoneais, conforme mostrado na Figura 2A.
      NOTA: O rolo abdominal ajuda a manter o intestino úmido e protegê-lo de ser danificado inadvertidamente por instrumentos cirúrgicos. Certifique-se de que a gaze permaneça úmida durante o procedimento para evitar que o intestino seque. Tenha cuidado para não retrair o intestino com força, pois isso pode causar torção da artéria mesentérica superior e da vasculatura intestinal, o que pode causar danos isquêmicos. Além disso, ao varrer inicialmente o intestino delgado, tenha cuidado com uma fina ligação translúcida entre o intestino grosso e o fígado inferior (ligamento hepatocólico), que, se não for cuidadoso, pode facilmente arrancar a cápsula hepática e causar sangramento. Se houver tensão neste ligamento durante a retração, divida-o bruscamente com uma tesoura.

Figura 2: Representação da retração abdominal e a visão cirúrgica ideal para a exposição da aorta infrarrenal do camundongo. (A) A colocação de um rolo abdominal de gaze ajuda a retrair os órgãos intra-abdominais, enquanto um afastador oposto auxilia na visualização do retroperitônio. Uma cortina cirúrgica estéril (transparente para mostrar a orientação do animal) é colocada sobre o animal anestesiado para ajudar a manter a esterilidade. (B) A fáscia retroperitoneal (caixa verde) recobre a aorta anteriormente. (C) Exemplo da aorta infrarrenal após dissecção da fáscia retroperitoneal. O isolamento da aorta da VCI pode ser obtido começando em um espaço potencial entre a aorta e a VCI localizado distal à veia renal esquerda, à medida que ela cruza anteriormente (círculo amarelo). Abreviatura: IVC = veia cava inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Dissecção circunferencial e isolamento da aorta infrarrenal:
   1. Confirme se a VCI e a aorta infrarrenal estão totalmente visíveis. Comece a expor a aorta entrando e dividindo primeiro a fáscia retroperitoneal (RP) (Figura 2B). Identifique as artérias gonadais (testiculares ou ovarianas) que correm paralelas ao longo da aorta infrarrenal anterior (Figura 2B e Figura 3). Use uma pinça para dividir a fáscia entre as artérias gonadais e continue longitudinalmente para expor a aorta anteriormente (Figura 2C).
      NOTA: A fáscia RP é uma camada fina e translúcida de tecido conjuntivo que contém linfáticos e o plexo esplâncnico. É necessário dissecar através da fáscia do FR para expor a aorta. No entanto, não disseque através do tecido conjuntivo da adventícia aórtica. Uma ruptura na adventícia (tecido conjuntivo branco) exporá a mídia (parece vermelho brilhante), e a aorta provavelmente se romperá neste local assim que a elastase for aplicada.
   2. Em seguida, comece a isolar a aorta abdominal da VCI. Comece esta dissecção em um pequeno espaço entre a VCI e a aorta, localizado logo abaixo da borda inferior da veia renal esquerda ao cruzar a aorta (Figura 2C). Use as pontas da pinça para espalhar suavemente as fibras do tecido conjuntivo entre a aorta e a VCI e continue trabalhando circunferencialmente ao redor da aorta nesse nível.
      NOTA: A VCI tem paredes muito finas e adere à aorta por uma fina camada de tecido conjuntivo fibroso. Tenha cuidado para evitar manusear o IVC ou limpá-lo o máximo possível. Dissecar o lado direito da aorta da VCI primeiro (antes de dissecar o lado esquerdo da aorta da musculatura circundante) ajudará a aorta a "cair" da VCI.
   3. Continue dissecando sem rodeios o plano entre a aorta e a VCI, trabalhando caudalmente em direção à bifurcação aórtica. Pare a dissecção distal adicional quando atingir a bifurcação aórtica.
      NOTA: Tome cuidado extra ao dissecar ao redor da artéria mesentérica inferior (AIM), que normalmente está localizada perto da seção média da aorta infrarrenal e viaja lateralmente através da VCI.
   4. Uma vez que a borda direita da aorta esteja separada da VCI, retorne proximalmente ao nível da veia renal esquerda. Disseque a fáscia RP da borda lateral esquerda da aorta, trabalhando circunferencialmente ao redor até que a aorta esteja totalmente isolada. Consulte a Figura 3 para obter a anatomia relevante da dissecção retroperitoneal.
      NOTA: Tenha cuidado ao dissecar atrás da aorta, pois há alta variabilidade na localização e no número de veias e artérias lombares. Consulte a Figura 4 para referência de áreas com alto risco de sangramento com esta dissecção.
   5. Inspecione cuidadosamente se a aorta está circunferencialmente isolada da VCI e da musculatura circundante, tanto quanto possível, com dissecção cuidadosa ao redor dos segmentos aórticos presos pela AIM e pelas artérias lombares.
   6. Coloque uma tira de luva ao longo das bordas direita e esquerda da aorta, conforme demonstrado na Figura 5A. Tente cobrir o máximo possível do IVC.
   7. Use paquímetros portáteis para medir o diâmetro aórtico mais largo e registrar três medições. Pulverize as pontas das pinças com 70% de EtOH antes e depois das medições. Evite entrar em contato direto com a aorta com as pontas da pinça para evitar contaminação.
      NOTA: Fotos usando um microscópio calibrado com capacidade de câmera também podem ser utilizadas.

Figura 3: Anatomia do suprimento de sangue para a parte inferior do abdômen, pelve e retroperitônio do camundongo. Abreviaturas: R = direita; L = esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Locais de alto risco de lesão e hemorragia durante a dissecção retroperitoneal e isolamento circunferencial da aorta infrarrenal. Abreviaturas: L = esquerda; IMA = artéria mesentérica inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Respostas intraoperatórias à aplicação de elastase ou simulação durante o modelo AAA murino de elastase/BAPN. (A) Segmentos de luva são colocados ao longo do comprimento da aorta antes da aplicação de elastase para ajudar a proteger a VCI e o intestino da exposição à elastase, mantendo a aorta embebida em elastase (B) A aplicação de elastase desnaturada não causa dilatação da aorta (caixa azul). O diâmetro máximo da aorta mediu 0,627 mm no início do estudo, depois 0,607 mm após 5 min de elastase tópica desnaturada. (C) A aplicação de elastase causa dilatação da aorta após 5 min de tratamento. Neste exemplo, a aorta (verde) dilatou de 0,607 mm para 0,953 mm, um aumento de 57% no diâmetro. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrila; AAA = aneurisma da aorta abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Aplicação de elastase:
   1. Use um cotonete com ponta de algodão para enxugar qualquer sangue ou fluido extra da aorta.
   2. Em seguida, coloque um pedaço de gaze seca de 10 mm x 2 mm em cima da aorta. Use uma pipeta para dispensar 5 μL de elastase (ou controlar a elastase desnaturada) para saturar a gaze e a aorta. Dobre suavemente os pedaços da luva ao redor da aorta.
      NOTA: Para preparar elastase desnaturada para uso em grupos simulados ou de controle, ferva a elastase a 100 ° C por 30 min.
   3. Aguarde 5 minutos para que a elastase atue na aorta. Durante este período de incubação, se necessário, libere um pouco da tensão colocada pelo rolo abdominal e pelo afastador de pele.
      NOTA: Devido ao efeito de lote com elastase, encorajamos os investigadores a usar o mesmo frasco de elastase para todos os experimentos dentro de um determinado estudo. A cada novo frasco de elastase, recomendamos a realização de uma dose-resposta para garantir que não haja um número esmagador de rupturas precoces (antes de 4 semanas). A duração da aplicação da elastase também pode ser ajustada entre 4 e 6 min, dependendo da resposta à elastase.
   4. Após 5 min, reinicie a retração intestinal e desdobre os pedaços da luva. Irrigue a cavidade abdominal com 1 mL de solução salina normal estéril a 0,9% quente, enquanto remove cuidadosamente a gaze e os pedaços de luva da aorta. Absorva a solução salina no abdômen com gaze de 10 cm x 10 cm. Repita a irrigação do abdômen por um total de 3 x 3 mL.
   5. Use paquímetros portáteis para medir novamente a aplicação de pós-elastase de diâmetro aórtico mais amplo e registre 3x. Veja a Figura 5B,C para exemplos da dilatação aórtica para tratamento com elastase simulada e ativa.
      NOTA: As médias das três medições pré e pós-elastase podem ser usadas para calcular a variação percentual no diâmetro da aorta com o tratamento. Normalmente, há uma dilatação notável ~ 30-50% imediatamente após o tratamento com elastase, o que pode ajudar a garantir que a elastase esteja funcional e que a aorta seja tratada adequadamente. O diâmetro da aorta não deve mudar com a aplicação de elastase desnaturada ou pode ser ligeiramente menor (provavelmente devido ao espasmo).
5. Fechamento da cavidade abdominal:
   1. Remova cuidadosamente o rolo abdominal de baixo do intestino e para fora do corpo. Se necessário, aplique solução salina adicional no intestino para evitar que grude no rolo abdominal durante a remoção. Verifique se o intestino parece rosado e adequadamente perfundido.
      NOTA: Não é necessário tentar reposicionar o intestino de volta ao seu local original; tentar isso pode arriscar torção do intestino ou hérnias internas.
   2. Reaproxime a fáscia abdominal usando uma sutura de monofilamento não absorvível 5-0. Feche a pele com 3-4 grampos de pele.

6. Cuidados com animais pós-operatórios

1. Coloque o mouse na gaiola de recuperação com uma lâmpada de calor. Certifique-se de que a temperatura da gaiola esteja quente, não quente.
2. Administre um bolus de fluido subcutâneo de 0,5-1 mL de solução salina normal a 0,9%.
3. Deixe o mouse se recuperar sozinho na gaiola aquecida por ~ 20 min até ficar ativo de acordo com o protocolo institucional e, em seguida, retorne a uma gaiola de alojamento.
4. De acordo com o protocolo institucional, administrar carprofeno 20 mg/kg 24 h após a cirurgia no 1º dia de pós-operatório e continuar diariamente por 3 dias.

7. Medição da aorta e colheita de tecido

1. Após a eutanásia com isoflurano e luxação cervical, reabra a cavidade abdominal. Estenda a incisão através do esterno para acessar o tórax. Extirpar os átrios direitos e perfundir o ventrículo esquerdo com 10 mL de solução fria de DPBS a 1% durante 2 min. Ressecção os pulmões, fígado e baço.
   NOTA: Tenha cuidado para não ferir o intestino; O derramamento de conteúdo entérico pode afetar a análise tecidual.
2. Exponha a aorta abdominal e meça o diâmetro máximo da aorta infrarrenal, conforme descrito acima. Continue a dissecar toda a aorta e o coração. Uma vez que o coração e a aorta estejam isolados, corte todos os ramos arteriais e artérias ilíacas comuns, deixando segmentos curtos intactos na aorta. Coloque o coração e a aorta em um fundo contrastante ao lado de uma régua e imagem.

8. Análise e relatórios de dados

1. Para ajudar a contabilizar o erro humano, meça os diâmetros aórticos pelo menos 3x cada ao usar paquímetros portáteis e, em seguida, relate o diâmetro como o valor médio.
2. Defina AAA como um aumento de 50% no diâmetro saudável da aorta. Certifique-se de incluir os diâmetros aórticos brutos e a variação percentual no diâmetro nos resultados do estudo.

Resultados

Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas com idades entre 22 e 24 semanas foram usados neste estudo. As aortas infrarrenais foram tratadas com 5 μL de enzima elastase (6,9 mg de proteína/mL, 6 unidades/mg de proteína) ou elastase desnaturada por 5 min. Camundongos machos tratados com elastase demonstraram um aumento de 43,4% no diâmetro da aorta após 5 minutos de exposição à elastase em comparação com os diâmetros aórticos basais não tratados, enquanto as aortas fêmeas tratadas aumentaram 33,6% (P = 0,0342). Os diâmetros aórticos dos shams não exibiram relativamente nenhuma alteração ao longo de 5 min de exposição à elastase desnaturada (machos 0,5%; fêmeas -2,8%). Não houve mortes relacionadas cirurgicamente entre os 12 camundongos tratados e 6 falsos. Os dados para o estudo de 28 dias estão demonstrados na Tabela 1. Das fêmeas tratadas um no 20º dia de pós-operatório e dois no 25º dia (Figura 6). Não houve rupturas de AAA entre os machos tratados. AAAs (definidos como um aumento >50% do diâmetro basal da aorta ou morte por ruptura de AAA) foram induzidos com sucesso em todos os camundongos tratados (12 de 12). Aos 28 dias, o diâmetro médio do AAA dos machos tratados foi de 2,86 ± 0,31 mm, com uma alteração percentual média de 257 ± 54%, enquanto os diâmetros AAA dos camundongos fêmeas tratados sobreviventes foram de 3,60 ± 1,87 mm, com uma variação percentual média de 417 ± 286% (Figura 7). Os camundongos simulados não exibiram relativamente nenhuma alteração nos diâmetros da aorta.

Figura 6: Sobrevivência de camundongos B6 machos e fêmeas durante um modelo de elastase/BAPN de AAA de 28 dias. (A) A ruptura do AAA ocorreu em 3 dos 6 camundongos fêmeas tratados (um camundongo aos 20 dias, depois dois camundongos aos 25 dias), enquanto não houve rupturas entre os 6 camundongos machos tratados aos 28 dias. (B) Imagens representativas na necropsia de um camundongo fêmea que morreu de ruptura do AAA. A ruptura do AAA é demonstrada por um grande hematoma retroperitoneal (esquerda) e presença de um AAA infrarrenal com defeito na parede (direita). Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrila; AAA = aneurisma da aorta abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Diâmetros máximos da aorta de elastase/BAPN e camundongos B6 machos e fêmeas simulados em 28 dias. (A) Os camundongos tratados exibem diâmetros infrarrenais significativamente maiores em 28 dias em comparação com os simulados. (B) A combinação de elastase e BAPN produz com sucesso grandes AAAs infrarrenais em camundongos B6 machos e fêmeas. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrila; AAA = aneurisma da aorta abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

			86 macho Sham	86 fêmea Sham	86 elastase macho/8APN	86 fêmeas Elastase/8APN
Número de ratos			3	3	6	6
Idade (semanas)			22,3 ± 0,0	22,7 ± 0,7	23,1 ± 0,2	23,2 ± 0,2
Peso (g; na cirurgia)			36,3 ± 2,5	23,7 ± 1,2	32,8 ± 1,7*	23,7 ± 0,8
Diâmetro aórtico pré-tratamento (mm)			0,89 ± 0,02	0,75 ± 0,04	0,81 ± 0,07	0,73 ± 0,09
Diâmetro aórtico pós-tratamento (mm)			0,90 ± 0,03	0,73 ± 0,01	1,15 ± 0,03**	0,98 ± 0,12**
Alteração percentual após 5 min de tratamento (%)			0,5 ± 4,4	-2,8 ± 5,3	43,4 ± 10,2***	33,6 ± 4,5***
Incidência de AAA (%)			0 / 3	0 / 3	6 / 6	6 / 6
Rupturas de AAA em 28 dias			0 / 3	0 / 3	0 / 6	3 / 6
Sobrevivência até 28 dias			3 / 3	3 / 3	6 / 6	3 / 6
Diâmetro máximo da aorta em 28 dias (mm)			0,85 ± 0,01	0,64 ± 0,01	2,86 ± 0,31*	3,60 ± 1,87**
Variação percentual do diâmetro da aorta em 28 dias (%)			-4 ± 2	-16 ± 2	257 ± 54*	417 ± 286**

Tabela 1: Resultados de um modelo de 28 dias do modelo murino de elastase/BAPN de AAA. Os dados são médios ± DP. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001 em comparação com a simulação do mesmo sexo por meio do teste de Fischer ANOVA de uma via. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrila; AAA = aneurisma da aorta abdominal.

Discussão

Compreender a complexa fisiopatologia do AAA é fundamental para melhorar o manejo da doença do aneurisma da aorta. Embora novas estratégias sejam ativamente desenvolvidas para melhorar os resultados cirúrgicos, os AAAs continuam prevalentes em nossa sociedade em envelhecimento e a ruptura do aneurisma continua sendo uma das principais causas de morte nos Estados Unidos¹⁰. Portanto, as necessidades não atendidas nas estratégias de detecção, prevenção e tratamento do AAA justificam mais pesquisas fundamentais sobre aneurismas¹¹.

Modelos animais que recapitulam com precisão e eficiência as características e comportamentos dos AAAs humanos são essenciais para estudos mecanicistas da fisiopatologia do aneurisma e identificação de potenciais alvos terapêuticos. Embora os modelos animais atuais possam imitar os principais aspectos das alterações aneurismáticas que ocorrem na doença humana, nenhum modelo representa totalmente a verdadeira complexidade dos AAAs humanos. Atualmente, os camundongos são as espécies mais amplamente aceitas para modelagem de AAA animal. Os pesquisadores devem considerar os vários pontos fortes e fracos de cada modelo murino para seu estudo de aneurisma específico, como aqueles habilmente descritos nas revisões de Daugherty et al. e Busch et ^al.12,13.

O uso de elastase para induzir AAA em roedores foi descrito pela primeira vez por Anidjar et al. em 1990¹⁴. A perfusão da aorta com elastase pancreática suína usando uma bomba de seringa cria uma dilatação inicial aproximadamente entre 50% e 70%, e os segmentos dilatados demonstram favoravelmente características patológicas semelhantes aos AAAs humanos, como degeneração medial e inflamação adventícia. O modelo clássico de perfusão, no entanto, é indiscutivelmente o modelo de aneurisma tecnicamente mais desafiador, e os aneurismas que normalmente são formados na segunda semana começam a se resolver gradualmente a partir de então. Bhamidipati et al. em 2012 demonstraram que a aplicação adventícia de elastase também poderia induzir com sucesso aneurismas semelhantes que são mais reprodutíveis no tamanho¹⁵. Um modelo muito menos desafiador, o modelo de elastase tópica tornou-se amplamente adotado na pesquisa de aneurismas. A metodologia adicional e as vantagens do modelo de elastase tópica são discutidas no artigo de métodos de Xue e colegas¹⁶.

O modelo elastase/BAPN de AAA murino foi desenvolvido por Lu e colegas em 2017⁸. A introdução de água potável BAPN a 0,2% melhorou muitas das críticas ao modelo clássico de elastase tópica, agora produzindo aneurismas que se expandem continuamente até o ponto de ruptura do AAA. Em seu estudo de 2017, eles demonstraram que os camundongos no grupo tratado com elastase / BAPN tinham taxas de formação de AAA significativamente mais altas em comparação com o grupo elastase (93% vs 65%, P < 0,01), que também eram AAAs em estágio mais avançado. Durante um período de estudo de 100 dias, os AAAs no grupo elastase/BAPN continuaram a dilatar até >800% do diâmetro basal e formaram trombo intraluminal (53,8%), e 46,2% se romperam espontaneamente antes do final do experimento. Este modelo permitiu que os pesquisadores investigassem fatores que podem afetar a progressão e a estabilidade do aneurisma ao longo do tempo.

Berman et al. exploraram ainda mais o modelo elastase/BAPN, variando a concentração de elastase tópica, a duração do estudo, o momento da administração do BAPN e o impacto do sexo do animal⁹. O tratamento com 5 μL de elastase concentrada mais alta (5 mg/mL ou 10 mg/mL) produziu aneurismas maiores que 2,5 mg/mL em 56 dias. A prevalência da formação de trombos intraluminais também dependeu da concentração de elastase, que ocorreu em 28,6% dos camundongos tratados com 5 mg / mL e 62,5% dos camundongos tratados com 10 mg / mL. Eles também demonstraram que o modelo elastase/BAPN pode induzir aneurismas em camundongos fêmeas. Embora apenas alguns camundongos fêmeas tenham sido estudados (n = 5), eles descobriram que os aneurismas nas fêmeas eram mais propensos à ruptura (2 de 5 camundongos) e eram significativamente maiores do que os AAAs machos em 56 dias.

Neste artigo, pretendemos fornecer um método para abordar uma das maiores limitações da modelagem cirúrgica, que é a variação no procedimento cirúrgico. Sem um consenso claro sobre o grau de dissecção e a área da aorta tratada com elastase, os resultados desse modelo podem variar drasticamente entre animais, pesquisadores e instituições. Observamos inúmeras variações anatômicas entre camundongos, incluindo o número e o tamanho das artérias e veias lombares, a localização da AIM, a decolagem da veia gonadal esquerda, entre outras, o que pode ser limitante ao tentar tratar apenas uma porção ou segmento específico da aorta infrarrenal. Aqui, demonstramos que a dissecção circunferencial de todo o comprimento da aorta infrarrenal da artéria renal esquerda proximalmente à bifurcação aórtica distalmente ajuda a fornecer graus reprodutíveis de exposição aórtica, apesar das diferenças anatômicas, ao mesmo tempo em que aumenta o sucesso da indução do aneurisma e fornece limites claros para o operador. Além disso, o tamanho e a posição mais anterior da VCI tendem a cobrir a maior parte da aorta, o que pode afetar a quantidade de aorta tratada se não for isolada da VCI. Embora seja necessário remover a fáscia retroperitoneal para expor a aorta, é importante não dissecar totalmente o tecido conjuntivo da adventícia da aorta e expor qualquer uma das camadas médias, pois isso geralmente resulta em ruptura durante o período de incubação da elastase de 5 minutos. Isso pode servir como um controle interno adicional para o grau de dissecção com este modelo, mas pode ser uma curva de aprendizado frustrante ao adotar este modelo. Além disso, os operadores aprenderão áreas de maior risco (Figura 4) que podem ser facilmente feridas durante a cirurgia e levar a hemorragia incontrolável.

Embora seja importante que as etapas processuais deste modelo sejam consistentes, a duração do estudo e o momento da ultrassonografia intervalada podem variar dependendo do objetivo da pesquisa. A dilatação da aorta começa imediatamente com a aplicação de elastase, mas os estudos que usam esse modelo geralmente acompanham camundongos por 28 dias após a cirurgia⁷, como neste experimento de exemplo. A extensão da duração do estudo deve ser considerada ao estudar AAAs avançados, crescimento em longo prazo, formação de trombo intraluminal ou ruptura.

Medidas perioperatórias adicionais, como manter a temperatura corporal do animal e o estado de hidratação, podem ajudar a melhorar a sobrevivência animal desse procedimento invasivo. O uso de uma almofada de aquecimento durante a cirurgia e a colocação em uma gaiola de recuperação quente podem ajudar a evitar a hipotermia. A solução salina deve ser aquecida antes de ser usada para irrigar a cavidade abdominal. Um bolus de fluido subcutâneo logo após a cirurgia pode ser responsável por perdas insensíveis de fluido durante a operação e ajudar o animal a manter a hidratação adequada durante a fase de recuperação imediata. Com manuseio cuidadoso do tecido e uma abordagem metódica consistente, o modelo elastase/BAPN pode ser realizado por um operador experiente entre 30 min e 45 min por camundongo e produzir AAA de forma confiável com complicações perioperatórias muito baixas.

Nossos resultados demonstram que a combinação de NIAB associada à dissecção circunferencial da aorta infrarrenal antes da aplicação da elastase produz AAAs grandes e em contínua expansão, com maiores diâmetros e incidência de ruptura em períodos mais curtos. Neste experimento, os AAAs foram induzidos com sucesso em todos os camundongos machos (6 de 6) e fêmeas (6 de 6) tratados com elastase ativa. A exposição à elastase por 5 minutos resultou em um aumento imediato no diâmetro da aorta em cerca de 30-40%, o que é útil para confirmar a aplicação bem-sucedida e consistente de elastase entre os grupos de tratamento. Semelhante a Berman et al., mostramos que este modelo pode induzir AAAs em camundongos fêmeas, que também têm uma resposta de ruptura maior do que os machos. Metade dos camundongos fêmeas (3 de 6) se rompeu em 28 dias, em comparação com 0 de 6 dos machos, no entanto, os camundongos fêmeas pesam menos que os machos. Os camundongos machos demonstraram um aumento no diâmetro do AAA em 257% em comparação com -4% dos controles machos, enquanto as fêmeas sobreviventes mostraram um aumento de 417% no diâmetro, em comparação com -16% dos controles femininos. Os diâmetros da aorta não foram significativamente diferentes entre os camundongos machos e fêmeas sobreviventes tratados aos 28 dias devido ao maior número de rupturas no grupo feminino. Especulamos que os camundongos simulados exibem diâmetros aórticos menores ao final do estudo, pois a aorta tende a se dilatar ligeiramente durante a dissecção inicial e, em seguida, forma tecido cicatricial em 28 dias.

O modelo elastase/BAPN possui certas limitações. A dissecção circunferencial da aorta requer habilidades cirúrgicas finas, mas ajuda a melhorar a replicabilidade e o grau de indução do aneurisma. Semelhante ao modelo de elastase tópica, há também um efeito de lote na atividade da enzima elastase, que, como mencionado anteriormente, é, portanto, importante utilizar o mesmo frasco de elastase para todos os animais em um determinado experimento. Embora a incidência de trombo intraluminal e ruptura do AAA aumente com o tempo e a gravidade do aneurisma, eles não são garantidos nem totalmente previsíveis neste modelo.

Em resumo, o modelo elastase/BAPN produz AAAs infrarrenais grandes e verdadeiros em camundongos machos e fêmeas, que se expandem progressivamente ao longo do tempo, formam trombo intraluminal e são capazes de ruptura. Esses pontos fortes desse modelo murino ajudam a recapitular melhor alguns dos comportamentos e características dos aneurismas em humanos. Embora tecnicamente difícil, a dissecção cuidadosa e completa da aorta pode aumentar a resposta aneurismática. Atualmente, o método elastase/BAPN é um modelo avançado para o estudo de aneurismas da aorta abdominal infrarrenal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara de indução de 0,5 L	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0530XXS	câmara de indução de anestesia
injeção de cloreto de sódio a 0,9%, USP, 20 mL	Hospira	NDC 0409-4888-03	solução salina normal
seringa de 3 mL Ponta Luer-Lok com agulha BD PrecisionGlide 22 G x 3/4	BD	REF seringa 309569	agulha de 22 G
Fumarato de 3-aminopropionitrila	TCI	A0796	BAPN
3-Aminopropionitrila Fumarato sal	Sigma-Aldrich	A3134-25G	BAPN
Avant Delux esponjas de gaze, 2 "x 2" 4-Ply	Medline	NON26224	esponjas de gaze
Tosquiadeira careca	Whal Clipper Corporation	8110	máquinas de cortar cabelo
betadine esfoliante cirúrgico (iodopovidona, 7,5%)	Avrio	NCD 67618-154-16	betadine pinça cirúrgica esfregada
sem corte	ROBOZ	RS-5130	pinça romba
Buprenorfina ER-lab	ZooPharm	BERLAB0.5	buprenorfina
carprofeno	Norbrook	NDC 55529-131-11	carprofeno
CASTROVIEJO 5.75" reto com trava	ROBOZ	RS-6412	Castroviejo agulha chave
aplicadores de madeira com ponta de algodão, 6"	Aplicadores de madeira com ponta de algodão	Dynarex	No. 4302
DESMARRES 5.5' retractor	Retrator de pele	ROBOZ	RS-6672
paquímetro digital, 0-150 mm	World Precision Instruments	501601	paquímetro digital
DPBS (1x)	Gibco	14190-144	DPBS
Elastase de pâncreas suíno Tipo I	Sigma-Aldrich	E1250-10MG	elastase >4,0 unidades/mg de proteína
Etanol 200 prova	Decon Labs, Inc	2701	etanol diluído a 70%
lubrificante ocular	Optixcare	14716	lubrificante ocular
Germinador 500 esterilizador a seco	CellPoint Scientific, Inc	5-1450	esterilizador de esferas secas
esteira de terapia de calor	Adroit Medical Systems	V016	esteira de terapia
de calor bomba de terapia de calor	Adroit Medical Systems	HTP-1500	bomba de terapia de calor
isoflurano, USP	Akorn Animal Health	NCD 59399-106-01	isoflurano
Pipeta L-10	Rainin	LTS 0,5-10 uL	Máscara
anestesia de baixo perfil, pequena	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0801	anestesia nariz cone
micro tesoura de dissector	ROBOZ	RS-5619	microscópio de tesoura de micro dissector
Microscópio	Leica	S9i
Iluminador LED de alta intensidade Nii-LED luz de esforço	Nikon Instruments, Inc	83359 NII-LED	dissecção externa leve
nylon 5-0 monofilamento, sutura preta não absorvível	Oasis	MV-661-V	5-0 luvas cirúrgicas de poliisopreno de nylon de sutura
, GAMMEX Non-Latex PI Micro, tamanho 7.5	cirúrgicas de 20685975	sem látex	Ansell
Clipes de aço inoxidável Reflex 7 mm	CellPoint Scientific, Inc	203-1000	ferida balança de clipes
	Balança CR2200	Ohaus
	Compass Kent Scientific Corporation	10-8000-71	tubulação para vaporizador eletrônico
Vaporizador eletrônico SomnoFlo	Kent Scientific Corporation	SF2992	vaporizador eletrônico de baixo fluxo
SomnoPath Flow Diverter	Kent Scientific Corporation	SP1016	desviador de fluxo para vaporizador eletrônico
SS / 45 pinça afiada	ROBOZ	RS-4941	pinça afiada
cirúrgica	ROBOZ	RS-6010SC	cirúrgica
pinça para vaso	Dumont	VES 0,35	pinça para vaso