Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para análise do reparo ósseo mandibular. Descrevemos uma técnica reprodutível para fratura mandibular não estabilizada em modelo de camundongo, permitindo a análise do processo de reparo ósseo endocondral com mínimo dano tecidual e perda óssea.
Artigo de método
Técnica menos invasiva para fratura mandibular não estabilizada em modelos de camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fraturas não estabilizadas podem ser feitas em locais mandibulares em camundongos, possibilitando assim a análise do reparo ósseo usando um modo de ossificação endocondral. Para refletir com mais precisão esse processo in vivo, é necessário ter um protocolo padronizado para evitar perda óssea excessiva e danos aos tecidos moles, principalmente no local mandibular, um local anatômico caracterizado por acesso mínimo. Até onde sabemos, descrevemos pela primeira vez um protocolo menos invasivo de fratura mandibular não estabilizada em camundongos. Camundongos adultos são anestesiados com isoflurano e recebem uma dose pré-operatória de buprenorfina por injeção subcutânea. É realizada uma abordagem submandibular, com uma incisão na pele feita ao longo da borda inferior da mandíbula. O músculo masseter é elevado em um plano subperiosteal ao longo do ramo mandibular com um elevador periosteal. Uma fratura vertical e completa do ramo é realizada da borda basilar até a incisura coronoide (entre os processos condilar e coronóide), usando um dispositivo de cirurgia óssea piezoelétrica sob irrigação com soro fisiológico na borda basilar e tesoura para completar a fratura do ramo mandibular. A abordagem da pele é fechada por suturas de seda. Este procedimento detalhado para fraturas mandibulares não estabilizadas oferece um procedimento eficiente que permite perda óssea mínima e danos aos tecidos moles. Essa técnica garante resultados bem-sucedidos e consistentes para refletir com precisão o processo de reparo ósseo endocondral em modelos de camundongos.
Introdução
O reparo ósseo implica processos de ossificação membranosa e endocondral, dependendo da fratura ou da estabilização da osteotomia. O reparo ósseo após osteotomias ou fraturas ósseas estabilizadas depende da ossificação membranosa, enquanto as fraturas não estabilizadas ou osteotomias mal estabilizadas se consolidam de acordo com um modo de ossificação endocondral1. O reparo ósseo membranoso é caracterizado pela formação óssea por diferenciação direta das células mesenquimais em osteoblastos, enquanto o reparo ósseo endocondral envolve a formação de um molde cartilaginoso transitório, que se diferencia em osteoblastos para formar o calo ósseo2.
O reparo ósseo depende de múltiplas interações teciduais e celulares; também é influenciado por fatores específicos do local e pela força exercida sobre o calo3. O osso mandibular é um osso móvel que suporta forças mastigatórias, formado principalmente por osso cortical. O processo de reparo do osso mandibular é influenciado pelo local e pela direção da fratura. Sabe-se que lesões musculares e periósteas podem afetar a consolidação óssea, bem como perdas ósseas importantes no local da fratura 4,5,6.
A análise do reparo ósseo endocondral mandibular implica protocolos padronizados e reprodutíveis para comparações valiosas e não tendenciosas. Em relação à literatura, poucos autores relatam protocolos para fraturas mandibulares não estabilizadas em modelos de camundongos 3,7 e, em sua maioria, com direção anterior ao nível molar8. Ao desenvolver esta técnica, pretendemos evitar lesões musculares e periósteas e limitar a perda óssea no local da fratura para melhor analisar o processo de reparo ósseo endocondral sem fatores de confusão. Além disso, o objetivo de desenvolver uma nova técnica para fratura mandibular em camundongos foi minimizar a dor pós-operatória e a morte de animais freqüentes em tais cirurgias em pequenos animais. Pela primeira vez, descrevemos um protocolo menos invasivo para fratura mandibular não estabilizada no nível do ramo em camundongos. Este protocolo in vivo evita danos musculares e periósteos excessivos ou perda óssea no local da fratura e ajuda a reduzir o nível de dor pós-operatória e o risco de morte do animal.
Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Imagine Institute e foi validado por comitês de ética e pelo ministério francês (APAFIS 26995).
1. Animais
- Determine o número de animais por grupo. Recomendamos 12 animais por grupo. Determine o sexo e a idade dos camundongos. Este protocolo é adaptado para camundongos C57BL/6J de 6 semanas de idade (machos ou fêmeas).
- Dê aos animais, pelo menos 1 semana antes do procedimento, gel de suplemento nutricional para aclimatação.
2. Procedimento cirúrgico
- Prepare o material necessário. Autoclave os instrumentos: tesoura, chave de agulha, fórceps, inserto e peça de mão do dispositivo de cirurgia óssea piezoelétrica e elevador. Prepare luvas estéreis, suturas de seda (4/0), barbeador, gaze de algodão, solução de iodopovidona a 10%, mesa de aquecimento, isoflurano e máscara de focinho para inalação de isoflurano.
- Prepare a buprenorfina a 0,1 mg/kg, diluída em soro fisiológico injetável estéril. Administre buprenorfina por injeção subcutânea com agulha 25G 30 min antes da cirurgia.
- Prepare a placa de aquecimento (37 °C), coloque um suporte de espuma sobre ela e fixe a máscara do focinho com pequenas agulhas ou fita adesiva.
- Colocar o camundongo no tanque de isoflurano para indução, com difusão de isoflurano (4%). Teste a profundidade da anestesia realizando uma pinça do dedo do pé. Em caso de indução suficiente, será observada uma falta de reflexo podal.
- Coloque o camundongo anestesiado de costas na placa de aquecimento coberta por um campo estéril mantido a 37 °C durante todo o procedimento. Posicione a máscara no focinho para inalação contínua de isoflurano (manutenção a 2,5%). Fixe as extremidades do mouse com fita adesiva.
- Aplique lubrificante ocular bilateralmente para evitar o ressecamento ocular induzido pela anestesia geral. Raspe os pelos submandibulares, use luvas estéreis e desinfete a pele com vários toques de solução de iodopovidona a 10% e álcool.
- Realize a abordagem cutânea submandibular conforme descrito abaixo.
- Faça uma incisão na pele do ângulo mandibular até a junção 1/3 posterior - 2/3 anterior do ramo horizontal da mandíbula com microtesoura.
- Disseque os tecidos subcutâneos para expor o músculo masseter.
- Desinsira o músculo masseter com o uso de um elevador periosteal da borda inferior da mandíbula.
- Eleve o músculo masseter em um plano subperiosteal ao longo do ramo mandibular com o elevador.
- Crie uma pequena osteotomia (3 mm de comprimento) na borda inferior da mandíbula usando o dispositivo de cirurgia óssea piezoelétrica sob irrigação com soro fisiológico (máximo de 10 mL/min) na borda inferior da mandíbula, anteriormente ao ângulo mandibular, na parte posterior da concavidade (Figura 1, Figura 2).
- Localize a borda posterior da mandíbula e a incisura coronoide (com a microtesoura ou a pinça) e complete a fratura com o uso de pequenas tesouras retas inseridas ao longo do ramo mandibular para evitar abertura adicional do músculo masseter e lesão. Para permitir a orientação correta da fratura, coloque a tesoura perpendicularmente à borda inferior da mandíbula.
- Verifique se a fratura está totalmente completa: a mobilidade total entre os dois segmentos ósseos deve ser observada durante a mobilização suave dos 2 segmentos com fórceps.
- Feche a abordagem da pele com suturas de seda (4/0) com suturas separadas. Nenhuma sutura é necessária no periósteo.
NOTA: Alternativamente, a abordagem da pele pode ser suturada com outras suturas não absorvíveis (por exemplo, suturas de polipropileno). - Realize radiografias laterais cefálicas para confirmar a direção da fratura (Figura 3).
- Coloque o mouse novamente no tanque de isoflurano para uma breve reindução antes de realizar os raios-X. Em seguida, coloque o mouse em extensão, na lateral
- Em caso de fratura colocada muito anteriormente ao nível de um molar inferior ou quando a fratura descolou o ângulo mandibular (Figura 4), observe um aumento anormal no volume do calo ósseo. Nesses casos, exclua os animais do estudo para evitar qualquer viés na análise.
- Verifique os ratos até que eles recuperem a consciência antes de colocá-los de volta na gaiola.
3. Cuidados pós-operatórios
- Prepare uma gaiola de rato sem ração e enriquecimento duro para evitar quaisquer forças mastigatórias.
- Isole o camundongo operado em uma única gaiola pela1ª semana até que a pele esteja completamente curada. Com 1 semana de pós-operatório, o grupo operou camundongos fêmeas juntos na mesma gaiola.
- Administre buprenorfina (0,1 mg / kg) por injeções subcutâneas em 4 h, 24 h, 48 h e 72 h após o procedimento.
- Alimente os camundongos com gel de dieta macia durante todos os períodos pós-operatórios, desde o dia 0 até o final do período de consolidação (ou seja, 28 dias) para evitar dor e deslocamento secundário da fratura.
- Pesar diariamente os camundongos do dia 0 ao dia 4 após a fratura, pela manhã, antes da injeção de buprenorfina e depois 3x por semana até o sacrifício do animal (14 dias após a fratura).
- Avalie o bem-estar animal pós-operatório para otimizar os cuidados pós-operatórios com os animais. Utilizar a escala de pontuação da Tabela 1 para avaliar o estado pós-operatório do animal e adaptar o seguimento. Quando o escore é > 1, é administrada injeção de buprenorfina, e quando o escore é > 3 e/ou em caso de perda de peso > 20% do peso pré-operatório apesar do enriquecimento alimentar, a eutanásia deve ser discutida (Tabela 1).
Resultados
Quanto aos procedimentos cirúrgicos in vivo , para realizar de forma otimizada este procedimento de fratura mandibular não estabilizada em um modelo de camundongo, são necessários aprendizado e treinamento específicos.
Esta técnica de fratura mandibular não estabilizada permite o estudo do processo de reparo ósseo endocondral. Após a eutanásia, amostras mandibulares foram coletadas em paraformaldeído a 4% (24 h). Após descalcificação total com EDTA pH 8, os cortes foram incluídos em parafina. Cortes seriados sagitais foram realizados, desparafinados em solução de desparafinização e, em seguida, reidratados antes da coloração Sirus Red/Alcian Blue, usando protocolos padrão. As imagens histológicas confirmaram a formação de um calo mole com um molde cartilaginoso (Figura 5). A cicatrização óssea é concluída 4 semanas após a fratura, conforme mostrado por análises de microtomografia computadorizada. Sugerimos estudar o processo de reparo ósseo em diferentes pontos-chave, desde o início da formação do calo (por exemplo, a cada 7 dias (dia 7, 14, 21) ou mais, dependendo do objetivo do estudo) até o final da cicatrização óssea (ou seja, dia 28), com análises histomorfológicas e morfométricas de micro-TC.
Com base em uma análise retrospectiva deste procedimento realizada em 58 camundongos do tipo selvagem (fundo C57BL / 6J), a taxa de sucesso do protocolo é de 86,3% e uma taxa de exclusão de 13,7%. A exclusão foi devido à morte espontânea prematura no pós-operatório imediato (3%), à decisão de eutanásia para camundongos com escore crítico (1%; escore > 3 e/ou em caso de perda de peso > 20%), ou em caso de posição anormal da osteotomia, com divisão anormal do ângulo mandibular (5%), ou quando a fratura foi no nível molar (n=1/58). Infecção foi observada neste último caso, com a divisão anormal da fratura ao nível molar (n= 1/58; Tabela 2).
Figura 1: Imagem da abordagem cutânea submandibular do ramo ascendente inferior. A borda inferior da mandíbula é fraturada com inserção de piezótomo, permitindo perda óssea mínima (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coloração da mandíbula de camundongo. Vista lateral de uma mandíbula de camundongo do tipo selvagem de 6 semanas de idade (corada com coloração vermelha de alizarina / azul alcian): 1. Côndilo, 2. Processo coronóide, 3. Incisura coronóide, 4. Processo angular, 5. Borda posterior do ramo, 6. Borda basilar (ou inferior) da mandíbula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Raio-X do crânio do camundongo. Radiografias laterais do crânio de um camundongo selvagem de 6 semanas de idade (visão sagital) mostrando o aspecto da mandíbula de um camundongo não fraturado (esquerda) e o aspecto da mandíbula de um camundongo fraturado e a direção da fratura mandibular não estabilizada (setas), da borda inferior até a incisura coronoide, colocada anteriormente ao côndilo (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Raio-X do crânio do rato em condições abaixo do ideal. Radiografias laterais do crânio de um camundongo selvagem de 6 semanas de idade (visão sagital) mostrando fratura anormal do ângulo mandibular (setas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos. Resultados no dia 14 pós-fratura em um camundongo do tipo selvagem (C57BL / 6J). Vistas coronais 3D representativas de uma tomografia computadorizada μ reconstruída do local da fratura mandibular, mostrando o calo ósseo (setas brancas). Imagens representativas da cartilagem calosa (coloração Sirus Red/Alcian Blue) confirmando a presença de um processo de reparo ósseo endocondral. Abreviaturas: B = Osso, C = Cartilagem. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 0 | 1 | 2 | |
| Aspecto animal | Normal | Redução do banheiro | Cabelos despenteados, costas arqueadas |
| Comportamento | Normal | Hipomobilidade | Hipomobilidade, redução da ingestão de alimentos, perda de peso > 10% |
| Sinais clínicos | Normal | Inflamação da cicatriz | Cicatriz aberta, infecção |
Tabela 1. Escala de pontuação de bem-estar pós-operatório.
| n = 58 ratos | |
| Taxa de sucesso | 86.3 % |
| Taxa de exclusão : | 13.7 % |
| Morte espontânea prematura | 3% |
| Pontuação crítica < 3 e/ou perda de peso > 20% | 1% |
| Fratura anormal dividida no ângulo mandibular | 5% |
| Divisão anormal da fratura, no nível molar | 1.7 % |
Tabela 2. Taxas de sucesso e exclusão do protocolo.
Discussão
A técnica permite a realização de fraturas mandibulares não estabilizadas em um modelo de camundongo dentro de uma abordagem aberta mínima em um curto tempo de procedimento (cerca de 10 min ou menos). Este procedimento de curta duração limita o risco de morbidade e morte animal, especialmente em pequenos animais, como camundongos. Para obter resultados comparáveis na análise do processo de reparo ósseo endocondral, deve-se tomar cuidado especial para realizar as fraturas mandibulares na mesma direção, sem divisão anormal do ângulo mandibular, pois esse efeito indesejável pode aumentar anormalmente o volume do calo ósseo e retardar o período de consolidação. Este protocolo para fratura mandibular não afeta o crescimento dos incisivos inferiores no pós-operatório. Para melhorar a eficácia deste protocolo, aconselhamos o experimentador a primeiro se exercitar em animais sacrificados de idade semelhante e dissecar imediatamente após fraturar a mandíbula para visualizar diretamente a direção da fratura, se necessário.
Os progenitores mesenquimais que migram dos músculos adjacentes para o calo contribuem para o reparo ósseo6. Foi demonstrado que a lesão do periósteo e muscular afeta a consolidação óssea 5,6. Além disso, seções musculares extensas levam a um risco aumentado de sangramento e podem levar à infecção pós-operatória. A piezocirurgia tem sido amplamente desenvolvida no campo da cirurgia óssea craniofacial; Tem sido relatado que apresenta menores taxas de lesão de partes moles e dor pós-operatória quando comparado com osteotomias convencionais 7,9. Para minimizar a lesão do músculo masseter e do periósteo, usamos a piezocirurgia para iniciar a fratura na borda inferior da mandíbula e completamos a fratura com tesoura no nível superior do ramo para evitar a secção extensa do músculo masseter. Isso implica controlar a posição da borda posterior da mandíbula e do entalhe coronóide antes de fraturar a parte superior do ramo com a tesoura. Não encontramos dificuldade em completar a fratura com o uso de pequenas tesouras retas após iniciá-la com piezocirurgia na borda inferior da mandíbula. Experimentamos esse procedimento em camundongos adultos com diferentes origens genéticas (C57BL / 6J, CD1 (resultados não mostrados)), com diferentes densidades ósseas e tamanhos mandibulares (prognatismo, micrognatia). No entanto, aconselhamos verificar se o comprimento da tesoura é adequado para fraturar o ramo superior apenas uma vez para evitar rachaduras anormais de fratura.
O risco de sangramento é minimizado neste procedimento devido a essa abordagem mínima aberta. No caso de sangramento excessivo que pode ocorrer durante a elevação muscular, uma curta compressão do local cirúrgico com gaze interrompe o sangramento. Um risco potencial de infecção do local cirúrgico pode ocorrer em caso de fratura do dente molar quando a fratura mandibular é colocada muito anteriormente; esse efeito adverso pode ser detectado em radiografias laterais pós-operatórias. Neste caso, o animal deve ser excluído do estudo. A infecção pós-operatória do local da operação também pode ser decorrente de um hematoma; Isso pode ser evitado com a realização de suturas cutâneas separadas, permitindo a evacuação espontânea quando ocorrer sangramento anormal no pré-operatório. A anestesia geral com isoflurano versus injeção intraperitoneal evita taxas de mortalidade excessivas ligadas aos efeitos traumáticos adversos das injeções intraperitoneais. Em nossa experiência, não observamos nenhuma morte de animal diretamente ligada à anestesia geral com isoflurano.
Os camundongos podem apresentar redução pós-operatória da ingestão alimentar. Em caso de ingestão insuficiente de alimentos ou ganho de peso insuficiente, o pó de ração peneirada pode ser adicionado ao gel. Para melhorar a ingestão alimentar pós-operatória, recomendamos dar suplemento nutricional em gel com croquetes pelo menos 1 semana antes do procedimento para acomodação. Recomendamos a realização de radiografias adicionais durante o acompanhamento (todas as semanas, durante o acompanhamento) e no momento do sacrifício para avaliar o possível deslocamento da fratura. Em condições não patológicas, a consolidação óssea é completa 4 semanas após a fratura.
Vários autores descreveram diferentes protocolos para fraturas não estabilizadas da mandíbula em camundongos 3,10,11. Os instrumentos utilizados para realizar a osteotomia podem ser diferentes, nomeadamente, brocas, pinças cirúrgicas, etc. No entanto, o uso de brocas pode levar a uma maior perda óssea e lesões nos tecidos moles. Até onde sabemos, esse procedimento de fraturas mandibulares não estabilizadas é o primeiro a associar piezocirurgia e tesoura para completar a osteotomia. Esta técnica tem a vantagem de preservar os tecidos moles, permitindo uma osteotomia precisa com perda óssea mínima.
Como para todas as técnicas, este método tem algumas limitações. Preferimos realizar a fratura com o uso de tesoura após iniciá-la com um inserto de cirurgia piezoelétrica para evitar qualquer secção estendida do músculo masseter e lesão do periósteo que possa exacerbar um potencial atraso de consolidação e/ou formação de pseudoartrose. No entanto, essa técnica implica controlar a posição da incisura coronoide sem visualização total do ramo mandibular para realizar a fratura na mesma direção. Espera-se, portanto, uma curva de aprendizado, dependendo da experiência cirúrgica. Além disso, a direção da fratura mandibular nas radiografias pode ser difícil de visualizar, dependendo do dispositivo de raios-X. Não usamos micro-TC in vivo para confirmar a direção da fratura, pois poderia comprometer a recuperação do camundongo devido ao aumento da duração da anestesia geral.
Estudar o processo de reparo ósseo endocondral implica na realização de fraturas não estabilizadas, permitindo assim uma melhor compreensão do processo de reparo ósseo. Esta etapa é necessária se quisermos considerar ensaios pré-clínicos em modelos de camundongos com defeitos de reparo ósseo com o objetivo de desenvolver novas aplicações clínicas para o tratamento de reparo ósseo defeituoso e pseudoartrose em pacientes no contexto de doenças genéticas ou no caso de sequelas pós-traumáticas ou pós-tumorais.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
O estudo é apoiado em parte pelo Departamento de Filantropia da Mutuelles AXA por meio da Head and Heart Chair e da ANR BonyBrain. Agradecemos a todos os membros da plataforma SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Paris, França, por sua contribuição para a realização do procedimento.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina : Buprecare 0.3 mg/kg | Elevador de Cuidados | ||
| com Animais OBWEGESER largura 6mm Comprimento 17,5cm | Collin Medical | HA 5905 | |
| Placa de Almofada MORIA 11 cm N° 5 | MORIA | 9906 | |
| Mesa de aquecimento Bioseblab 55 cm x 33 cm | Porta-agulhas Bioseblab | 707 | |
| : Porta-agulhas Micro Halsey - Metal | LABODERM | 21.100 | |
| Neo Transparente | Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha | 109843 | |
| Tubo de Gel Ocry 10 g (lubrificante para os olhos) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Piezotome 2 ASS FINAL | ACTEON | X57402 | |
| Inserção de piezotomo Piezocision PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| Tesoura micro | MORIA | MC52 | |
| Suturas de seda PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| Tesoura reta | MORIA | 4877A | |
| Vetflurano (isoflurano) 250 ml | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
Referências
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- Yu, Y. Y., Lieu, S., Hu, D., Miclau, T., Colnot, C. Site specific effects of zoledronic acid during tibial and mandibular fracture repair. PLoS One. 7 (2), e31771(2012).
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