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Uso da administração de medicamentos guiados por micropipeta como método alternativo à gavagem oral em modelos de roedores

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DOI:

10.3791/66836

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26 de julho de 2024

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1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos a administração de medicamentos guiada por micropipeta (MDA) como um método alternativo à gavagem oral que incentiva o animal de pesquisa a ingerir tratamentos prontamente com o mínimo de estresse e desconforto.

Resumo

A gavagem oral (GO) com o uso de uma cânula acoplada a uma seringa é um dos métodos mais comuns usados para administrar a dosagem precisa de compostos no estômago de animais de pesquisa. Infelizmente, esse método traz dificuldades tanto para o operador quanto para o animal de pesquisa. Estudos mostraram que a OG pode levar a complicações, incluindo esofagite, perfuração do esôfago e administração inadvertida de medicamentos traqueais. Além disso, o GO está associado ao aumento dos níveis plasmáticos e fecais de corticosterona (devido ao estresse), pressão arterial alterada e aumento da frequência cardíaca, o que pode influenciar negativamente ou influenciar os resultados do estudo. Um método alternativo desenvolvido anteriormente, denominado administração de medicamentos guiada por micropipeta (MDA), incentiva o animal a consumir tratamentos prontamente de maneira minimamente invasiva. Aqui, apresentamos exemplos do uso da técnica MDA com tratamentos reconstituídos em diferentes veículos e demonstramos a entrega eficaz dos tratamentos variados a várias cepas de camundongos diferentes. Demonstramos ainda que o MDA é uma técnica que diminui o tempo e a invasividade da administração do medicamento e não afeta a composição do microbioma intestinal, conforme avaliado pela análise quantitativa das principais espécies microbianas intestinais. No geral, o MDA pode oferecer uma alternativa menos estressante e eficaz ao OG.

Introdução

A administração de medicamentos a modelos de roedores é comumente obtida por meio de gavagem oral (GO), que consiste em administrar uma preparação líquida diretamente no estômago usando uma cânula conectada a uma seringa contendo a solução. Essa técnica resulta em uma dosagem consistente e precisa do tratamento para o animal, mas também traz várias desvantagens. OG foi examinado por não modelar adequadamente as exposições dietéticas humanas 1,2. Além disso, o GO aumenta o risco de lesões não intencionais no sistema digestivo superior (perfuração do esôfago e estômago), aspiração do tratamento administrado e lesões do trato respiratório3. O GO também está associado a desconforto4, aumento da pressão arterial e da frequência cardíaca5, bem como estresse 6,7 e, às vezes, morte8 devido à diminuição da tolerância à gavagem pelo animal. Essas alterações fisiológicas podem interferir ou confundir os resultados experimentais; Assim, novos procedimentos têm sido explorados para evitar esses efeitos colaterais. Estudos têm utilizado procedimentos alternativos à GO, como o uso de gelatina como veículo de fármaco9, tiras de dissolução oral (ODS)10, agulhas de gavagem revestidas comsacarose 11, tubos de alimentação flexíveis, biscoitos de trigo12, mel13 e pellets de manteiga de amendoim14. Infelizmente, existem limitações com essas modificações na técnica OG, incluindo incompatibilidade com drogas insolúveis em água, maior tempo de preparação para o tratamento15, palatabilidade e estabilidade da droga15 e familiarização do animal com o alimento. Além disso, há potencial para uma dosagem menos precisa quando os animais se alimentam de forma improvisada.

Scarborough et al.7 desenvolveram anteriormente um método alternativo de tratamento oral em camundongos, que eles denominaram administração de drogas guiada por micropipeta (MDA). Este método de administração é baseado em uma solução de leite condensado adoçado como veículo para substâncias farmacológicas, motivando os animais do estudo a consumir o veículo preparado e/ou soluções medicamentosas prontamente por meio da dispensação da solução com uma pipeta de canal único e ponta de pipeta. Para introduzir esta técnica, os roedores passam por uma sessão de treinamento (mínimo de 2 dias) para encurtar os tempos de manuseio e permitir que o animal do estudo se familiarize com a ingestão da ponta da pipeta4. Estudos iniciais de validação de Scarborough et al.7 e Schalbetter et al.16 sugerem que o procedimento de MDA é fácil de implementar, custo-efetivo, minimamente invasivo e menos estressante para os animais do que os métodos convencionais de gavagem oral. Scarborough et al. introduziram o uso da técnica MDA em um modelo de camundongo de ativação imune materna (MIA) de distúrbios do neurodesenvolvimento7. Este estudo demonstrou que os perfis farmacocinéticos de camundongos tratados com o medicamento antipsicótico risperidona usando MDA foram comparáveis ao uso de OG. Além disso, o MDA não induziu um aumento nos níveis de corticosterona (um hormônio do estresse) nos camundongos, e o tratamento crônico com risperidona usando a técnica de MDA levou a uma diminuição dependente da dose nos déficits de interação social induzidos por MIA e hipersensibilidade às anfetaminas7. Estudos adicionais exploraram a eficácia do MDA versus OG em modelos de camundongo17 e rato18 . O MDA também foi comparado à injeção intraperitoneal e demonstrou ser igualmente eficaz na administração de N-óxido de clozapina a camundongos16. Devido ao sucesso relatado do MDA na redução do estresse animal e da eficácia terapêutica, agora pretendemos explorar ainda mais a técnica de MDA como um método eficaz de administração de medicamentos usando modelos murinos adicionais. Aqui, descrevemos a implementação do método MDA para tratar diferentes cepas de camundongos, incluindo as cepas FVB / NJ e C57BL / 6J imunocompetentes e a cepa imunocomprometida NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) com diferentes tratamentos orais, incluindo bactérias vivas, compostos experimentais entregues em soluções insolúveis em água (óleo de milho) e controles de veículos. Avaliamos a atividade e a presença dos diferentes tratamentos no soro e nas fezes, e avaliamos as alterações na microbiota intestinal central em relação ao método MDA.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados seguindo as diretrizes institucionais e sob os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC) M021M197 e M023M195. As linhagens de camundongos usadas (camundongos machos, 7 semanas de idade) são descritas na Tabela de Materiais. O uso de camundongos machos foi devido ao seu uso nos estudos em andamento sobre câncer de próstata. O método MDA já demonstrou ser eficaz em camundongos fêmeas 7,17. Os camundongos foram randomizados para suas respectivas gaiolas/grupos de tratamento. Os ratos foram tratados em gaiolas e sem ordem específica. O experimentador que administrou os tratamentos foi cego para o grupo de tratamento. O número atribuído a um rato referia-se à sua identificação e não à ordem em que foram tratados. Os dados foram coletados ao longo da linha do tempo do estudo e analisados ao final para evitar qualquer viés. Os ensaios experimentais foram cegos para o grupo de tratamento até que todos os dados fossem coletados.

NOTA: Este protocolo foi modificado de Scarborough et al.7.

1. Preparação dos tratamentos

  1. Prepare uma solução de leite condensado adoçado (ingredientes: leite e açúcar) e água de grau de biologia molecular usando uma proporção de 3:10 de leite para água. Meça o leite condensado usando um tubo cônico de 15 mL devido à viscosidade do leite.
  2. Usando um tubo cônico de 50 mL, misture água de grau de biologia molecular com o leite condensado adoçado, misturando lentamente 5 mL de água de cada vez com o leite.
    NOTA: Esta etapa é realizada em condições estéreis usando um gabinete de biossegurança.
  3. Preparar alíquotas da solução láctea (conservadas em alíquotas de 500 μl) e conservá-las a 4 °C até à sua combinação com o tratamento de interesse.
  4. Ressuspenda os tratamentos em seus respectivos veículos na concentração correta com base no peso corporal do animal antes de combiná-los com a solução de leite condensado/água.

2. Sessão de treinamento MDA

NOTA: Esta seção descreve os modelos de mouse; no entanto, a técnica de MDA pode ser ampliada conforme necessário com volumes maiores/ponteiras de pipeta para modelos de roedores maiores.

  1. OPCIONAL: Contenha suavemente o animal de estudo segurando a nuca com uma mão.
  2. Ofereça ao animal do estudo apenas 100 μL de solução condensada de leite/água (sem adição do tratamento experimental) usando uma pipeta de canal único e uma ponta de pipeta de 200 μL que é guiada até a boca.
  3. Distribua a solução de leite/água lentamente para evitar perder a boca do animal. Certifique-se de que o animal consuma prontamente a solução de leite entre 5-15 s.
    NOTA: Este treino ocorre durante um mínimo de 2 dias consecutivos (uma sessão de treino por dia), sem alterações ao volume administrado. Uma contenção suave por nuca foi necessária para as sessões de treinamento do MDA. Scarborough et al.7 recomendam a contenção total do animal no primeiro dia de treinamento do MDA e, em seguida, a contenção pela cauda no segundo dia. O método de contenção pode diferir para modelos de roedores maiores. Em contraste, Vanhecke et al.17 apenas seguraram os camundongos levemente pela cauda durante o treinamento.

3. Tratamentos em camundongos usando o método MDA

  1. Combine o tratamento do estudo com a solução de leite condensado/água (ver exemplos com experiências de validação [secção 4 e secção 5] abaixo).
  2. OPCIONAL: Contenha suavemente o animal de estudo segurando a nuca com uma mão.
    NOTA: Scarborough et al.7 relatam que os camundongos não precisam mais de contenção além do período de treinamento e beberão prontamente da ponta da pipeta. Em contraste, Vanhecke et al.17 relatam que, para alguns tratamentos (por exemplo, tamoxifeno) que podem ter aversão leve ao sabor, o MDA é melhor realizado restringindo suavemente os camundongos por meio de nuca durante todos os tratamentos. Este estudo também determinou que posicionar o animal de costas com uma nuca suave melhora o tempo e a eficácia do consumo do tratamento.
  3. Administrar 100 μL de tratamento usando uma pipeta monocanal e uma ponta de pipeta de 200 μL guiada até a boca do animal, conforme realizado durante as sessões de treinamento.
  4. Trate um único animal de cada vez.
  5. Coloque cada animal de volta em sua respectiva gaiola após o tratamento.
    NOTA: Os tratamentos pelo método MDA podem ser administrados diariamente ou de forma repetida 7,17.

4. Experiência de validação #1 - entrega oral de bactérias intestinais a ratinhos usando MDA

NOTA: Esta seção descreve o uso do método MDA para fornecer bactérias vivas por via oral para estudos de colonização intestinal em camundongos. Neste experimento piloto representativo, a bactéria gram-positiva Clostridium scindens é entregue a camundongos C57BL / 6J. Os camundongos foram tratados com antibióticos (cefoxitina) por dois dias consecutivos na água potável antes da inoculação bacteriana com MDA.

  1. Cultura bacteriana
    1. Cultura de C. scindens cepa ATCC 35704 em caldo clostridial reforçado (RCB) usando um estoque de glicerol congelado para inocular 500 μL de bactérias em um tubo RCB de 7 mL. Crescer anaerobicamente durante a noite a 37 °C.
    2. Use 500 μL da cultura de bactérias durante a noite para inocular um novo tubo RCB e incubar anaerobicamente por 24 h. Remova este tubo da câmara anaeróbica e use-o para preparar o tratamento bacteriano para MDA. Use este mesmo tubo para calcular as unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL).
  2. Cálculo de UFC / mL de C. scindens
    1. Crie uma diluição de 1:3 da cultura de C. scindens usando 3,5 mL da cultura inoculada em 7 mL de meio RCB. Use uma amostra desta diluição para fazer um estoque de glicerol de 20% 1 mL (1: 1) que é armazenado a -80 ° C.
    2. Placa de 100 μL da diluição 1:3 em placas de ágar clostridial reforçado (RCA). Use a primeira diluição para fazer diluições seriadas subsequentes e coloque em placas por um total de mais três vezes.
    3. Após a incubação das placas RCA, contar as colônias e calcular a UFC. Utilizar a seguinte equação para calcular a concentração de células bacterianas nas amostras diluídas e originais:
      UFC na amostra diluída (células/mL) = (número de colônias contadas na placa RCA)/(quantidade de amostra diluída adicionada à placa RCA em mL)
      UFC na amostra original (células/mL) = (UFC na amostra diluída)/(diluição da placa RCA)
  3. Preparando o tratamento de C. scindens para MDA
    1. Combine uma solução de 50 μL (1,265 x 106 UFC/mL neste exemplo) de C. scindens + 50 μL da solução condensada de leite/água adoçada.
      NOTA: Se for necessária uma UFC específica, pode ser utilizado um método alternativo de quantificação de células bacterianas, como a criação de uma curva padrão com medições de densidade óptica (OD) a 600 nm.
  4. Tratamento oral de camundongos com C. scindens usando MDA
    1. Nos dias 1-3, familiarize os camundongos com a solução láctea conforme descrito na seção 2 (sessão de treinamento de MDA).
    2. No dia 4, administrar 100 μL da solução de C. scindens + leite ou PBS (controle) + solução de leite via MDA a camundongos C57BL / 6J. Trate os ratos uma vez durante o estudo.
  5. Coleta de amostras fecais
    1. Segure o mouse com uma nuca suave e espere que ele descarregue uma pelota fecal. Colete pellets fecais diretamente do reto em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL. Armazenar as amostras a -80 °C até à utilização.
  6. PCR quantitativo de C. scindens (qPCR)
    1. Realizar extração de DNA fecal usando um protocolo publicado anteriormente 19,20.
    2. Determine a concentração de DNA usando um fluorômetro de DNA para detecção de alta sensibilidade. Normalizar as amostras de ADN para 10 ng/μL e conservar a -20 °C até à utilização.
    3. Use qPCR para investigar a abundância de: (i) bactérias C. scindens usando primers conservados contra o gene desA da cepa C. scindens ATCC 35704, (ii) bactérias totais usando primers projetados contra a região hipervariável V6 do gene bacteriano 16S rRNA conforme descrito anteriormente20,21.
      NOTA: As condições de qPCR e os primers usados estão listados na Tabela 1. Uma curva padrão usando o DNA ATCC 35704 da cepa de C. scindens foi usada para estimar as cópias da bactéria desA+.

5. Experimento de validação #2 - entrega experimental de drogas a camundongos usando MDA

NOTA: Esta seção descreve o uso do método MDA para fornecer um composto experimental a camundongos. Neste experimento piloto representativo, o metabólito da soja equol (S-equol) é entregue a camundongos NSG e FVB/NJ.

  1. Preparação do tratamento com S-equol
    NOTA: Tanto o S-equol quanto o dimetilsulfóxido (DMSO) são aliquotados e armazenados a -20 ° C até o uso.
    1. Reconstituir S-equol em DMSO combinado com óleo de milho (90%). Misture o S-equol aliquotado em óleo de milho (220 μL) com 480 μL da solução de leite condensado / água. Combine e misture esta solução no biotério para evitar a separação do óleo do leite.
      NOTA: Se for observada separação da solução, misture a solução antes do tratamento. A dose de S-equol administrada é de 25 mg/kg/dia. Os camundongos usados neste estudo eram todos semelhantes em peso, então receberam a mesma dose. A dose do tratamento pode precisar ser ajustada e transformada em várias preparações com base no peso dos animais do estudo.
    2. Combine o veículo DMSO com óleo de milho (90%). Misture DMSO aliquotado em óleo de milho (220 μL) com 480 μL da solução de leite condensado / água. Combine e misture esta solução no biotério para evitar a separação do óleo do leite.
      NOTA: Se for observada separação da solução, misture a solução antes do tratamento.
  2. Tratamento oral de camundongos com S-equol usando MDA
    1. Nos dias 1 e 2, familiarize os camundongos com a solução láctea, conforme descrito na seção 2 (sessão de treinamento de MDA).
      NOTA: Para o experimento de validação #1, foi seguido o tempo de treinamento descrito em Scarborough et al., que sugeriu um tempo de aclimatação de 3 dias. Neste experimento, um menor tempo de treinamento (2 dias) foi testado e constatou-se que não alterou a administração dos tratamentos de interesse.
    2. Nos dias 3-43, trate os camundongos com (i) controle PBS, (ii) veículo DMSO ou (iii) S-equol, todos combinados com a solução de leite condensado / água adoçada. Faça uma mistura principal da solução para fornecer uma solução homogênea dos tratamentos a todos os animais do estudo. Administrar um volume total de 100 μL a cada rato uma vez por dia, 5 dias por semana, durante um total de 43 dias.
  3. Coleta de sangue
    1. Colete sangue após a eutanásia (overdose de dióxido de carbono) por punção cardíaca. Transfira o sangue para um tubo separador de soro microtainer, misture e armazene em temperatura ambiente (RT) até o processamento posterior.
    2. Centrifugue a amostra de sangue para completar a separação a 254 x g por 5 min. Recolha o soro (camada superior de separação) e conserve a -20 °C até à utilização.
  4. Cromatografia líquida S-equol com ensaio de espectrometria de massa em tandem (LC/MS/MS)
    1. Consulte o arquivo Tabela de Materiais para os produtos químicos e reagentes usados para este experimento.
    2. Padrões de calibração e controle de qualidade: Preparar soluções-mãe de S-equol e padrão interno (equol racêmico-d4) em DMSO em concentrações de 1 mg/mL e armazenar a -20 °C.
    3. Diluir as soluções-padrão de reserva com acetonitrilo:água (50:50) para preparar uma solução de trabalho mista com diferentes concentrações. Preparar o padrão interno em acetato de etilo como solução de extracção a uma concentração de 100 ng/ml. Armazene o estoque e as soluções de trabalho a 4 °C e use diariamente, diluído ou diretamente.
    4. Extração de amostras
      1. Preparar a amostra utilizando precipitação de proteínas por solução de extracção (acetato de etilo mais padrão interno, ver ponto 5.4.3), seguida de centrifugação e evaporação do sobrenadante em azoto seco (50 °C).
      2. Reconstituir a amostra em 100 μL de acetonitrila a 50% e transferir para frascos de amostrador automático para análise LC/MS/MS.
    5. Separação de amostras
      1. Obtenha a separação com uma coluna C18, 2.1x50 mm, 1.7 μm. Use ácido fórmico a 0.1% como fase móvel A e ácido fórmico a 0.1% na fase móvel B de acetonitrila.
      2. Use um gradiente e mantenha a fase móvel B a 40% com uma taxa de fluxo de 0,3 mL / min por 0,5 min. Em seguida, aumente a taxa de fluxo para 100% em 1 min, segure por 2 min e retorne a 40% B por 1 min.
      3. Monitore o efluente da coluna usando um detector de espectrometria de massa usando ionização por eletrospray, que está operando em modo negativo. Programe o espectrômetro para monitorar as seguintes transições de monitoramento de reação múltipla (MRM): 241 → 119.1 para S-equol e 245 → 123 para o padrão interno, equol-d4.
      4. Calcule a curva de calibração para S-equol usando o pico da razão de área da análise para o padrão interno usando uma equação quadrática com uma função de ponderação 1/x2 usando as faixas de calibração de 5-500 ng/mL.

6. Medindo o efeito do tratamento com MDA na microbiota intestinal central

NOTA: Esta seção descreve o uso de qPCR para medir os níveis de microbiota intestinal central após o tratamento com MDA.

  1. Realize a coleta de amostras fecais e a extração de DNA conforme descrito nas etapas 4.5.1 e 4.6.1.
  2. Determine a concentração de DNA usando um fluorômetro de DNA para detecção de alta sensibilidade. Normalizar as amostras de ADN para 10 ng/μL e conservar a -20 °C até à utilização.
  3. Use qPCR para investigar a abundância de membros da microbiota intestinal: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. e (v) bactérias totais usando primers projetados contra a região hipervariável V6 do gene bacteriano 16S rRNA, conforme descrito anteriormente 20,21,22.
    NOTA: As condições de qPCR e os primers usados estão listados na Tabela 2.

Resultados

O MDA pode ser usado na administração oral de cepas bacterianas em modelos de camundongos. Camundongos C57BL / 6J foram tratados com antibióticos (cefoxitina na água potável) por 2 dias para limpar as comunidades microbianas comensais antes de iniciar a sessão de treinamento de MDA. A solução de leite condensado/água foi administrada uma vez ao dia consecutivamente por 3 dias antes da administração do tratamento. Os camundongos foram brevemente contidos por uma nuca suave durante a administração do tratamento com MDA. No dia 4, os camundongos foram tratados uma vez com PBS (controle negativo, n = 4) ou uma cultura anaeróbica de C. scindens (bactéria desA +, n = 4) que foi previamente ressuspensa na solução de leite condensado / água. Todos os camundongos geralmente tomaram os tratamentos em segundos e beberam a dose inteira (100 μL). Para validar a entrega e a presença das bactérias anaeróbias, comparamos amostras fecais coletadas após o tratamento com antibióticos com amostras fecais coletadas 24 h após o tratamento com PBS ou C. scindens (Figura 1). O DNA fecal foi isolado, quantificado e normalizado para 10 ng/μL para realizar qPCR usando primers específicos do gene C . scindens ATCC 35704 desA (Tabela 1). Observamos que os camundongos tratados com antibióticos tinham pouca ou nenhuma bactéria desA +. Como esperado, observamos uma quantidade substancialmente maior de bactérias desA+ nos camundongos tratados com C. scindens, que foi significativamente diferente daqueles no grupo controle PBS (p = 0,0286, Figura 1).

Entrega de um composto experimental (S-equol) usando o método MDA. Camundongos NSG (n = 15) e FVB/NJ (n = 18) foram treinados com a solução de leite condensado/água dois dias antes da administração do tratamento. Camundongos NSG foram submetidos a tratamento com antibióticos (cefoxitina na água potável) para eliminar bactérias intestinais produtoras de equol e, portanto, a produção endógena de equol. Camundongos FVB/NJ foram alimentados com dieta isenta de soja para eliminar a produção endógena de equol. Todos os camundongos foram brevemente contidos por uma raspadinha suave para administrar os tratamentos. O grupo controle recebeu a solução de leite condensado/água em combinação com óleo de milho, o grupo DMSO (controle veicular para S-equol) recebeu a solução de leite condensado/água e DMSO em óleo de milho, e o grupo equol recebeu solução de leite condensado/água e equol em óleo de milho. Os camundongos foram tratados cinco dias por semana com a técnica de MDA por um total de 43 dias. Os camundongos geralmente tomavam os tratamentos em segundos e bebiam a dose inteira (100 μL). No geral, todos os camundongos consumiram pelo menos metade da dose em um determinado dia (dose parcial em um determinado dia, mas dose completa no dia anterior ou no dia seguinte). Nenhum dos camundongos recusou o tratamento inteiramente ao longo do estudo. Observamos que, após o scruffing, o posicionamento dos camundongos de costas melhorou o tempo de consumo do tratamento e garantiu que o animal tomasse a dose inteira.

Os níveis circulantes de equol demonstram a administração eficaz do medicamento MDA. Amostras de sangue foram retiradas dos camundongos NSG após a eutanásia no final do estudo para validar que a entrega de MDA de equol levou a níveis circulantes de equol nos animais do estudo. Não recuperamos sangue suficiente de um dos camundongos tratados com equol para realizar o ensaio LC/MS/MS. Os níveis séricos de equol foram medidos por LC/MS/MS no Analytical Pharmacology Shared Resource da Johns Hopkins University School of Medicine. Não observamos equol circulante nos grupos controle e DMSO (veículo equol), enquanto os camundongos tratados com equol apresentaram equol circulante detectável (Figura 2). É importante ressaltar que esperamos alguma variação nos níveis circulantes de equol nos camundongos tratados com equol devido a diferentes datas e horários de sacrifício de animais neste experimento.

As comunidades microbianas intestinais permanecem inalteradas após o tratamento com MDA. O efeito da solução láctea de MDA (com e sem equol) na microbiota intestinal foi avaliado usando os camundongos FVB/NJ. Quantificamos a composição microbiana de amostras coletadas no início do estudo (sem tratamentos/sem MDA) e amostras coletadas 7 dias após o início do tratamento (9 dias após o início do MDA, incluindo dias de treinamento). Não observamos alterações significativas na carga bacteriana total ou na composição microbiana geral da microbiota intestinal central (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.), conforme avaliado pela análise de qPCR específica da espécie (Figura 3), conforme descrito anteriormente21,22. Uma gaiola mostrou uma diferença significativa em Lactobacillus entre a linha de base e após o tratamento com MDA; no entanto, esse achado foi observado no controle do veículo DMSO e não foi consistente em todas as gaiolas.

figure-results-1
Figura 1: O MDA fornece bactérias anaeróbicas ao intestino do camundongo que podem ser quantificadas via qPCR fecal. Camundongos C57BL/6J foram tratados com antibióticos por dois dias consecutivos na água potável. Os camundongos foram então tratados com a bactéria anaeróbica C. scindens usando o método MDA. A carga bacteriana fecal de C. scindens (desA+) foi medida por qPCR para o gene desA tanto após o tratamento com antibióticos quanto 24 h após o tratamento com MDA (PBS ou C. scindens). (A) A quantificação do gene desA específica de C. scindens é mostrada entre camundongos tratados com PBS e C. scindens após tratamento com antibióticos e 24 h após o tratamento com MDA. (B) Os mesmos dados mostrados para 24 h pós-MDA em (A) são mostrados como um gráfico de colunas. A significância estatística foi determinada por meio de um teste não paramétrico de Mann-Whitney. (*) p = 0,0286, barras de erro = SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Análise dos níveis circulantes de equol em camundongos NSG tratados com equol por meio da técnica de MDA. Os níveis séricos de equol foram quantificados via LC/MS/MS em camundongos tratados com controle (n = 5), DMSO (veículo, n = 5) e equol (n = 4). Não foi recuperado sangue suficiente de um dos camundongos tratados com equol para realizar LC/MS/MS. Esses tratamentos foram administrados usando o método MDA. O equol sérico só foi detectável no grupo tratado com equol. Limite de quantificação < 5 ng/ml. A significância estatística foi determinada por meio de uma ANOVA não paramétrica de uma via com comparações múltiplas (correção de Dunn). (**) p = 0,0053, barras de erro = SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: As bactérias intestinais centrais e os níveis de carga bacteriana total permanecem inalterados em camundongos FVB/NJ após o tratamento com MDA. Não foram observadas alterações significativas nos valores de qPCR Cq para as comunidades microbianas alvo antes e após a administração do tratamento usando o método MDA. Lactobacillus mostrou uma diferença significativa (*, p = 0,0321) apenas na gaiola 3 entre a linha de base e o tratamento com MDA. Esse achado não foi consistente entre as gaiolas. Os números das gaiolas são marcados como C1-C4. A significância estatística foi determinada por meio de uma ANOVA de uma via com comparações múltiplas (correção de Tukey). Barras de erro = SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome do primerSequências de primersCondições de PCR
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93 ° C 3 min, 34 ciclos (95 ° C 30 s, 54 ° C 30 s)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

Tabela 1: Primers e condições de qPCR para bactérias desA+ (C. scindens).

Nome do primerSequências de primersCondições de PCR
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'		95 °C, 3 min
36 ciclos
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'		50 °C, 5 min
95 °C, 10 min
40 ciclos
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3'		95 °C, 3 min
36 ciclos
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
S. salivarius_F
S. salivarius_R		5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95 °C, 10 min
44 ciclos
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 min
95 °C, 10 min
40 ciclos
95 °C, 15 s
62 °C, 1 min

Tabela 2: Primers e condições de qPCR usados para medir o efeito do MDA na microbiota intestinal central.

Discussão

O GO pode ser uma fonte significativa de estresse em animais de pesquisa que pode criar uma variável de confusão, conforme avaliado anteriormente em vários estudos 7,9,11,12,13,14,15,23. Devido à invasividade da GO, técnicas alternativas têm sido empregadas para minimizar os desafios associados à OG 9,10,12,13,14,15. A administração de medicamentos guiada por micropipeta (MDA) é uma nova técnica que permite a administração de medicamentos de maneira menos invasiva usando uma pipeta de canal único e uma mistura do medicamento de interesse com uma solução de leite condensado adoçado7. Uma etapa crítica para esta técnica é a sessão de treinamento (mínimo de 2 dias) que permite que o animal se familiarize mais com a ponta da pipeta e o sabor do leite condensado adoçado e, em geral, reduz os tempos de manuseio e o sofrimento. Esta sessão de treinamento também permite que os camundongos consumam prontamente os medicamentos incorporados na solução de leite condensado adoçado muito mais rápido do que outras técnicas e com uma dosagem precisa.

Nossos estudos acompanharam de perto os preparativos e a entrega da solução de leite condensado/água adoçada apresentados em Scarborough et al.7. Durante a duração do estudo, os camundongos não foram privados de água ou comida antes da dosagem. Eles foram mantidos em suas respectivas gaiolas de alojamento e o tempo dos tratamentos foi inferior a 1 min. Uma diferença fundamental em nossos estudos foi que, possivelmente devido ao potencial de deficiência visual nas cepas de camundongos albinos que usamos e ao potencial de leve aversão ao paladar com o tratamento medicamentoso, todos os camundongos exigiram uma breve contenção por meio de movimentos suaves como parte do protocolo de treinamento e tratamento. Essa modificação nos tratamentos com MDA é recomendada por Vanhecke et al.16. A nuca suave, juntamente com o posicionamento dos ratos de costas, encorajou os ratos a consumir ansiosamente a solução de leite. Concluímos que a necessidade de scruffing suave como parte das etapas de treinamento e tratamento é opcional e dependerá do estudo. A administração dos tratamentos (corrigida pelo peso corporal do animal, conforme aplicável) foi administrada em um volume padronizado, e os camundongos não apresentaram mudanças no comportamento. Outras pequenas modificações no estudo inicial7 incluíram uma diminuição no número de sessões de treinamento e nos volumes administrados em cada sessão. Algumas das limitações que encontramos neste estudo incluem a resistência de alguns camundongos em beber a dose inteira (100 μL) da solução láctea no primeiro dia de treinamento e em momentos durante o estudo. Isso foi superado posicionando os ratos de costas enquanto eram contidos. Este estudo não avaliou a interação da droga com a solução de leite condensado adoçada, diferenças no consumo entre os sexos de camundongos (embora o MDA tenha se mostrado eficaz também em camundongos fêmeas 7,17) ou elevação de marcadores de estresse, como níveis de corticosterona 7,11,14, associados à GO.

Neste estudo, nos concentramos na capacidade da técnica de MDA de fornecer uma dose precisa de um tratamento experimental e, em seguida, avaliamos os níveis fecais e/ou circulantes dos tratamentos de interesse nos animais do estudo. Da mesma forma, avaliamos se o tratamento com MDA altera a microbiota intestinal e observamos alterações mínimas ou nenhuma alteração na microbiota fecal central ou na carga bacteriana fecal total dos animais do estudo. Da mesma forma, não observamos lesões nos animais devido ao tratamento com MDA. Em conclusão, o MDA pode servir como um método alternativo de administração de tratamento de curto e longo prazo em modelos de roedores. No geral, o MDA tem um impacto positivo no bem-estar animal, reduzindo o risco de lesões associadas à OG. O MDA supera algumas das limitações de outras técnicas e propomos que ele possa ser amplamente utilizado em pesquisas translacionais em muitos modelos diferentes de roedores24.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer o apoio à pesquisa do Prêmio W81XWH-20-1-0274 do Programa de Pesquisa do Câncer de Próstata do Departamento de Defesa e do Prêmio 16CHAL13 do Desafio da Fundação do Câncer de Próstata. Gostaríamos de agradecer e agradecer à Dra. Michelle Rudek, ao Dr. Noushin Rastkari, à Dra. Nicole Anders e a Linping Xu do Recurso Compartilhado de Farmacologia Analítica da Johns Hopkins pela assistência com o equol LC/MS/MS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
200 µ Pontas de pipeta LMettler Toledo17005860
AB SCIEX Detector de espectrometria de massa triplo QTRAP 5500SciexN/A
Akkermansia muciniphila cepa muc DNA genômicoAmerican Type Culture CollectionBAA-835D-5
Acetato de amônioSigma– Camundongos Aldrich5.43834
C57BL/6JJackson LaboratoriesCepa# 000664
C. scindens cepa 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
Óleo de milhoMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
etanolFisher ScientificAC611050040
Ácido fórmicoSigma– Camundongos Aldrich5.33002
FVB/NJJackson LaboratoriesCepa# 001800
GlicerolSigma– AldrichG5516
HexanoFisher Scientific02-002-996
LC-MS grau de águaFisher Scientific14-650-357
MetanolFisher Scientific02-003-340
Microtainer tubo separador de soroBecton Dickinson02-675-185
Grau de biologia molecularágua Corning46-000-CI
Camundongos NSGJackson LaboratoriesCepa# 005557
PBSCorning21-031-CV
Kit Qubit DNA HSInvitrogenQ32851
Racêmico  equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Ágar Clostridial ReforçadoSistemas AnaeróbiosAS-6061
Caldo Clostridial ReforçadoSistemas AnaeróbiosAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
Padrão de referência S-equol para LC-MSCayman Chemical10010173
Single pipeta de canalRainin17008652
Streptococcus salivarius DNA genômicoAmerican Type Culture CollectionBAA-1024D-5
Leite condensado adoçadoCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
β-glucuronidase de Helix pomatiaSigma– AldrichG7017

Referências

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
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  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

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