Artigo de método

O Protocolo da Unidade de AVC de Camundongo com Pontuação Neurológica Padronizada para Estudos Translacionais de AVC de Camundongo

DOI:

10.3791/66847

⸱

7 de fevereiro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology Medical School of Athens, National and Kapodistrian University of Athens, 2Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), University of Munich Medical Center, 3Department of Neurointensive Care, Schoen Clinic Bad Aibling

Neste artigo

Resumo

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Este artigo apresenta um protocolo para executar o conceito de Unidade de AVC de camundongo (mSU) altamente translacional e comprovado de forma independente em camundongos de AVC grande. Ele também fornece um protocolo padronizado para a execução da escala experimental focal de AVC em camundongos, que avalia os déficits focais de AVC detectados mesmo a longo prazo.

Resumo

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O modelo de filamento de oclusão da artéria média (fMCAo) é talvez o modelo de AVC de camundongo mais translacional, permitindo isquemia controlada com reperfusão/recanalização intravascular. No entanto, ele não está alinhado com os avanços clínicos atuais para o tratamento do AVC (por exemplo, Unidades de AVC), geralmente emprega pontuação neurológica subjetiva ou vaga entre os laboratórios e exibe alta mortalidade na fase aguda. Aqui, abordamos essas limitações com protocolos guiados por vídeo validados. Apresentamos o protocolo Stroke Unit (mSU) de camundongo com vídeos instrutivos e um algoritmo de decisão (Risk Stratification Score), preenchendo a lacuna entre a modelagem clínica e a modelagem de AVC de camundongo. Para aumentar a precisão e a sensibilidade da pontuação neurológica do AVC, apresentamos pela primeira vez um formato padronizado em vídeo da Escala Experimental de AVC (fESS) focal e comprovamos seu valor até 6 meses após o AVC. Além disso, são apresentados protocolos para o teste de escada em camundongos, bem como o conhecido teste de cilindro, para avaliação quantitativa e imparcial da função motora dos membros. Os resultados destacam a eficácia translacional do mSU. O Focal ESS (fESS) se destaca em relação a outras escalas conhecidas na detecção de déficits focais de AVC, capturando a recuperação e mantendo a sensibilidade por até 6 meses após o AVC. Os testes de degrau de escada e cilindro quantificam e monitoram objetivamente os déficits motores dos membros anteriores e posteriores, a longo prazo. Em resumo, a integração de mSU, fESS e testes de função motora fornece uma estrutura robusta para investigações de AVC clinicamente relevantes. Nossos protocolos melhoram o valor translacional na pesquisa de AVC de camundongo.

Introdução

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O AVC isquêmico de grande porte é uma das principais causas de morbidade e incapacidade em todo o mundo1. Ainda assim, a pesquisa de derrame em camundongos enfrenta um bloqueio translacional em quase todos os tratamentos pré-testados clinicamente até agora2. As múltiplas razões para esse problema e os esforços para superá-lo foram revisados em detalhes na publicação anterior2. Esses desafios surgem da integração limitada dos avanços clínicos em modelos animais relevantes2 e das fraquezas dos sistemas de pontuação comportamental e neurológica na detecção de déficits pós-AVC com precisão e sensibilidade2.

Descobertas recentes3 apóiam que o modelo de filamento de oclusão da artéria média (fMCAo) em camundongos tem vantagens translacionais significativas sobre outros modelos com lesão e trauma craniano aberto 2,4. Além disso, este é o único que modela a reperfusão e a trombectomia mecânica de cenários clínicos de AVC 5,6,7. No entanto, o modelo enfrenta alta mortalidade subaguda entre 3-7 dias após o AVC, o que proíbe estudos de longo prazo de grandes AVCs e foi considerado até recentemente o artefato inerente e intransponível do modelo. Além disso, a detecção de déficits neurológicos pós-AVC é relativamente difícil e tendenciosa em camundongos devido ao seu pequeno tamanho, especialmente entre não clínicos ou pesquisadores inexperientes 8,9. Para resolver isso, diferentes grupos desenvolveram várias escalas para detectar déficits. As escalas mais utilizadas e conhecidas incluem a escala de Bederson de 3 pontos (BS)10, a escala de Bederson modificada de 5 pontos (mBS)11, o escore de Longa de 5 pontos (LS) (que é semelhante ao mBS)6, a Escala de AVC Neurológico modificada (mNSS)12,13, a escala de Garcia de 18 pontos (GS)9 e a mais detalhada de DeSimoni14 ou mais conhecida como "Neuroscore" (NS)9, Escala 15. Infelizmente, algumas dessas escalas são muito grosseiras e restritas apenas aos poucos dias de fase aguda após o AVC (BS, mBS e LS)8,9 ou sua interpretação é obscurecida por déficits gerais (NS).

Com esse pano de fundo, desenvolvemos e validamos anteriormente o protocolo de suporte da Unidade de AVC de camundongo (mSU), juntamente com a escala experimental de AVC (ESS) para camundongos13. A justificativa para o mSU foi adaptar o conhecimento da rotina clínica (ou seja, unidades de AVC humanas) para a pesquisa pré-clínica de AVC, enquanto o ESS consolidou criticamente as escalas de AVC existentes, mas "insensíveis" ou redundantes, em uma escala prática, refinada, sensível e eficiente em termos de tempo. O mSU consiste no monitoramento frequente e adaptado dos parâmetros clínicos básicos do camundongo com aplicação adaptada de suporte animal para aumentar a sobrevida13.

De fato, dados de nosso laboratório e de outros verificam o valor de ambos os métodos. O mSU traduz medidas básicas de suporte clínicoe avança7 de humanos para camundongos, reduz significativamente a mortalidade do fMCAo em camundongos de 60-70% para 10-15%13 permitindo estudos de AVCs maiores, e pode ser efetivamente aplicado em laboratórios independentes desde então 16,17,18,19. Além disso, a ESS pode distinguir entre déficits e sintomas pós-AVC focais (componente focal da ESS, fESS) e gerais (componente geral da ESS, gESS), modela a pontuação clínica humana (diferenciação entre sinais e sintomas focais e gerais em humanos), está linearmente relacionada ao tamanho da lesão do AVC e é sensível a déficits a longo prazo13,20. Ainda assim, apesar do valor comprovado e da eficácia do mSU e do ESS, a falta de instruções claras, visualizadas e padronizadas até mesmo para pesquisadores inexperientes deixa várias questões em aberto sobre a aplicação do mSU e subjetividade significativa na pontuação de déficits focais no fESS.

Como tal, nosso presente artigo tem como objetivo fornecer instruções claras e assistidas por vídeo para os protocolos mSU e fESS. Acreditamos firmemente que ele apoiará os pesquisadores de AVC a aumentar a eficiência translacional de seus estudos de AVC, reduzir significativamente a perda de animais durante os primeiros 3 a 10 dias após o AVC, reduzir os custos de experimentação e, eventualmente, avaliar de forma reprodutível os déficits neurológicos por meses após o AVC13. Além disso, a combinação adicional do teste de degrau em escada e teste de cilindro pode quantificar facilmente a paresia do membro focal (membros anteriores e posteriores) devido ao fMCAo.

Para mostrar a eficiência de mSU e fESS, fornecemos dados de médio (14 dias) e longo prazo (6 meses) em camundongos após fMCAo. Camundongos C57Bl/6J machos de doze semanas de idade (n= 31) foram usados e alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 h e acesso a alimentos peletizados e água ad libitum. Os camundongos foram divididos em duas coortes seguidas por 14 dias (n = 10, coorte 1) e 6 meses (n = 15, coorte 2), respectivamente. Esses camundongos foram submetidos a uma isquemia cerebral de 60 minutos usando o modelo bem descrito de fMCAo 13,20,21 sob anestesia com isoflurano. Animais operados por simulação (n = 6, operados como as duas coortes acima, mas nenhuma isquemia foi induzida) acompanhados por 6 meses serviram como controles. A buprenorfina foi usada como analgésico pré e pós-operatório de 3 dias. Os testes de degrau e cilindro da escada também foram realizados para a coorte de 6 meses como parte da pontuação neurológica.

Todos os animais foram verificados diariamente quanto a desfechos humanos durante os primeiros 14 dias após o incêndio, definidos como: 1) hipotermia grave (<33 °C) e/ou imobilidade (por exemplo, pontuação 4 no Teste 6 de fESS ou teste de "atividade espontânea" de gESS) que não foi melhorada pelo tratamento com "Unidade de AVC de camundongo" (ou seja, aquecimento passivo e alimentação ativa, ver 1.4, 1,6, 1,8) dentro de uma hora, 2) sinais de dor ou comportamento de ansiedade (por exemplo, pontuação >2 no teste de "ansiedade/comportamento automático" do gESS), mesmo após analgesia pós-operatória de acordo com o protocolo.

Neste protocolo, o suporte pós-AVC dos camundongos na forma de mSU começa imediatamente após a recuperação do camundongo da operação fMCAo. Isso tem 3 fases: fase A (0-48 h pós-reperfusão), fase B (>48 h e até o "final do suporte ativo necessário", geralmente no dia 10-14, dependendo da fase B do animal individual) e fase C (dia 14 em diante). Possui cinco intervenções significativas (visitas/Escore de Estratificação de Risco, alimentação, fluidos, temperatura e desinfecções locais; ver 1.1. a 1.8. abaixo) adaptadas a cada animal, de acordo com cada fase (A, B ou C) e seu estado clínico real diário avaliado pelo Escore de Estratificação de Risco (RSS), ver Figura Suplementar 1 e Tabela 1 com três exemplos típicos. Os materiais e ferramentas necessários para mSU são mostrados na Figura 1a e descritos na Tabela de Materiais. Também fornecemos um modelo para monitoramento animal durante o mSU (consulte o Arquivo Suplementar 1).

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Protocolo

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Os experimentos relatados neste artigo foram conduzidos seguindo as diretrizes nacionais e europeias para o uso de animais experimentais e foram aprovados pelos comitês governamentais gregos (Atenas, Licença nº "843895_06-09-2022").

1. A "unidade de traço do mouse" (mSU)

  1. Avaliar diariamente o estado clínico do animal ("visitas") e calcular sua pontuação RSS
    1. Imprimir o Arquivo Suplementar 1, preferencialmente antes da cirurgia do animal, para registro de dados e monitoramento.
    2. Avalie cada animal clinicamente em pontos de tempo padrão (visitas): de manhã cedo (por volta das 08:00), meio-dia (entre 14:00 e 16:00) e tarde da noite (por volta das 22:00 - 23:00).
      NOTA: Adaptar estas visitas padrão de acordo com a fase de acompanhamento do animal: verificar o estado do animal 2x/dia (manhã-noite) para a Fase A, 3x/dia para a Fase B e uma vez por dia para a Fase C. Adaptar ainda mais a frequência das visitas de acordo com a pontuação RSS (ver 1.1.6). Trabalhe preferencialmente em equipe de >2 pessoas para redução da carga de trabalho. As visitas matinais e noturnas são cruciais para o sucesso, o monitoramento e a redução da mortalidade, pois a fase noturna (ativa) dos camundongos aumenta as demandas metabólicas e energéticas 13,22,23 e está ligada ao aumento da mortalidade noturna pós-AVC.
    3. Pese o mouse usando uma balança padrão sensível durante a visita matinal.
    4. Meça a temperatura com um termômetro sem contato colocado sobre o centro ventral do corpo durante a visita matinal. Segure e imobilize o mouse com as costas. Faça a leitura nos primeiros segundos após a imobilização (ver Figura 1f).
      NOTA: Não use um termômetro retal devido a uma possível ruptura intestinal após medições repetidas com peritonite concomitante.
    5. Avalie e registre a condição clínica geral do camundongo (mobilidade, feridas, capa uretral, reatividade, pelo, estado de hidratação, etc.) na visita matinal para todas as fases, diariamente até o dia 14.
    6. Calcule a pontuação RSS na visita matinal somando os pontos de acordo com o peso, temperatura e pontuação fESS do animal, conforme descrito na Figura Suplementar 1. Para o cálculo automatizado do RSS em uma tabela de planilha, use e adapte a fórmula encontrada na Tabela 1. Eutanasiar o animal com um método aprovado pela instituição, se houver desfechos humanos (veja acima).
    7. Adaptar a frequência das visitas e a intensidade do apoio, diariamente, de acordo com o escore RSS e a Fase pós-AVC do animal.
      NOTA: A fase B é a mais crítica para a mortalidade. Aumentar a frequência de visitas e a intensidade do apoio ao RSS ≥3 (para definição e instruções, ver Tabela 1). Se o animal continuar a apresentar um RSS >3 na Fase C, visite-o e apoie-o como na Fase B. Use o RSS e os descritivos gerais (como em recuperação, estável, baixo/médio doente e gravemente doente) para descrever sua condição clínica entre a equipe de apoio. Após o dia 14, reduza as visitas aos animais apenas para aquelas exigidas pelo protocolo experimental (por exemplo, para avaliações comportamentais/neurológicas).
  2. Preparação do alimento em gel para suporte nutricional
    1. Pulverize pellets de alimentos comuns usando um liquidificador (Figura 1a).
    2. Adicione açúcar comercial a 5-10% para aumentar o conteúdo calórico dos alimentos.
    3. Adicione água para criar uma textura líquida semelhante a um gel (Figura 1b).
    4. Use este alimento em gel para suporte nutricional passivo e ativo.
      NOTA: Opcionalmente, use alimentos em gel comerciais prontos para uso. Os alimentos preparados podem ficar na geladeira por 2-3 dias.
  3. Suporte nutricional passivo dos camundongos
    1. Encha uma placa de Petri com alimento em gel e coloque-a no chão da gaiola (suporte nutricional passivo pelo fornecimento de alimento em gel para facilitar o acesso ao camundongo). Deixe 2-3 pellets de comida ao lado da placa de Petri.
    2. Refresque a placa de Petri com comida em gel diariamente. Durante os primeiros dias, os camundongos podem encher ou cobrir a placa de Petri com cama de gaiola. Alguns começarão a comer (Figura 1c).
  4. Suporte nutricional ativo (alimentação ativa)
    NOTA: A alimentação ativa ocorre durante a Fase B. A frequência de alimentação padrão é 3x/dia e é adaptada a mais vezes de acordo com a pontuação RSS (por exemplo, até 4-5 vezes/dia). Ocasionalmente, para camundongos que constantemente têm uma pontuação RSS de 0-1 (ou seja, pequeno derrame) e comem ativamente sozinhos, diminua a frequência para 1-2 / dia.
    1. Pré-encha seringas de 1mL com gel food.
    2. Segure e segure o mouse suavemente, mas com firmeza, pelo do pescoço, conforme mostrado na Figura 1d (ponta da seta vermelha).
    3. Estabilize a bochecha do mouse com o dedo médio, conforme mostrado pelas setas vermelhas na Figura 1d: enquanto segura o mouse com firmeza, deslize o dedo lateralmente em direção ao nariz do mouse contra sua bochecha. Posição de retenção.
    4. Coloque a ponta da seringa na boca do camundongo entre os dentes e direcione a ponta para o lado interno da bochecha (seta vermelha, Figura 1e).
    5. Dê aproximadamente 40-50 μL de alimento em gel de cada vez (um bocado).
    6. Retorne suavemente o mouse para a grade da gaiola. Reserve tempo para mastigar.
    7. Repita a alimentação após 1-2 min, até que cada camundongo tenha comido 1-1,5 mL do alimento em gel.
      NOTA: Alimente 5-10 ratos por corrida (1-2 gaiolas); os outros comem e engolem a comida de gel enquanto cada rato recebe um bocado. O processo não confere estresse aos camundongos. Também foi observado que alguns animais eventualmente se posicionam para agarrar e se alimentar.
  5. Suplementação salina normal
    1. Pesar o rato durante a visita da manhã (ver pontos 1.1.2 e 1.1.3).
    2. Calcule sua perda/ganho de peso em comparação com a medição anterior subtraindo os valores.
    3. Complemente seu déficit de peso (em gramas) com mL de solução salina normal (por via subcutânea).
      NOTA: Evite sobrecarga de fluidos e edema a todo custo. Não exceda 1-2 mL por dose e 3-4 mL de fluidos por dia. Comece após 36 h pós-fMCAo.
  6. Suplementação de glicose
    1. Verifique a pontuação RSS calculada do mouse e seu movimento geral.
    2. Injete 0,5 - 1 mL de glicose a 5% por via subcutânea se o RSS >3 e o camundongo apresentar sinais concomitantes de hipotermia (<34 ° C) ou imobilização / bradicinesia. Injetar preferencialmente apenas durante a visita noturna.
      NOTA: Evite a hiperglicemia após o AVC a todo custo. A hiperglicemia pós-AVC é tóxica7. Como tal, suplementar a glicose somente após a alimentação ativa e em casos de condição clínica grave ou para prevenir hipoglicemia durante a atividade noturna. A alimentação ativa (ver 1.4) deve ser a principal medida de suporte, pois fornece suporte energético mais suave e duradouro e traduz as diretrizes clínicas 7. Não suplemente a glicose antes do dia 3.
  7. Gerenciamento de temperatura (passivo)
    1. Meça a temperatura corporal da superfície do animal no pré-operatório no início e no pós-operatório em cada visita (Figura 1a). Meça conforme indicado na figura 1f e descrito no ponto 1.1.4. Anote os valores.
      NOTA: A hipotermia em camundongos é definida como temperatura corporal <35 °C 24,25. Dados anteriores13 indicam que qualquer temperatura abaixo de 34 °C é um sinal de alerta para suporte após AVC (veja abaixo).
    2. Quando for observada hipotermia entre 33 e 34 °C, aquecer o rato passivamente numa gaiola sobre uma placa de aquecimento (ou qualquer outro dispositivo de aquecimento passivo) até atingir uma temperatura corporal >34 °C. Alimente ativamente o camundongo para fornecer energia para a produção ativa de calor pelo animal (fornecimento de energia mais duradouro).
      NOTA: Mantenha o animal em aquecimento passivo por 1 a algumas horas. Evite a hipertermia passiva a todo custo.
    3. Quando for observada hipotermia <33 °C, escale o suporte com administração adicional de glicose por via subcutânea (fornecimento de energia rápido, mas de curta duração; ver 1.6 acima).
  8. Limpeza da genitália e/ou ferida no pescoço ("desinfecções") locais
    NOTA: Ocasionalmente, uma deiscência da ferida ou tampão uretral pode ser observado. A deiscência da ferida é rara. O tampão uretral é um tampão rígido na ponta dos genitais do camundongo (Figura 1g) e é observado mais comum, especialmente em animais com maior gravidade de AVC. Quando o plug bloqueia a uretra, pode ocorrer uma síndrome obstrutiva urinária que pode levar à morbidade e morte26. Portanto, deve ser bem limpo.
    1. Mergulhe o tampão uretral, se presente, com solução salina normal para facilitar sua remoção.
    2. Remova o tampão uretral suavemente por meio de um pequeno cotonete ou uma pinça simples em cada verificação/visita do animal. Desinfete a uretra usando um medidor ou cotonete, embebido em uma solução anti-séptica.
    3. Se houver deiscência de ferida, desinfete-a localmente com qualquer solução antisséptica cirúrgica comum (por exemplo, Octanisept) e suture rotineiramente a ferida usando preferencialmente uma sutura de seda 5/0.

2. O componente focal da Escala Experimental de AVC (fESS)

  1. Preparar o campo de teste
    1. Limpe uma bancada com álcool 70% para remover estímulos externos (ópticos ou odores) e prepare os materiais de teste, conforme mostrado na Figura 2a.
    2. Imprima a folha de pontuação ESS fornecida como um arquivo suplementar 2 e siga os testes um por um.
  2. Paresia do membro anterior (Teste 1)
    1. Levante e segure o mouse suavemente a partir da base da cauda.
    2. Verifique e avalie visualmente a extensão simétrica para a frente e a mobilidade simétrica dos membros anteriores à medida que o mouse se move (Figura 2c).
    3. Pontuação dependendo dos achados visuais da seguinte forma: 0 para extensão e movimento normal e simétrico dos membros torácicos; 1 para "assimetria leve" definida como flexão leve e/ou movimento reduzido do membro contralesional ou rigidez do membro; 2 para "flexão acentuada" do membro contralesional; 3 para aderência do membro contralesional ao tronco; escore 4 para nenhum movimento do corpo ou membro.
      NOTA: O teste detecta paresia do membro torácico contralesional. Também faz parte das escalas BS, LS, mNSS e NS. A pontuação 1 pode ser difícil de definir devido às manobras de fuga do animal.
  3. Paresia dos membros posteriores (Teste 2)
    1. Continue segurando o mouse pela base da cauda, conforme descrito no Teste 1.
    2. Verifique visualmente a extensão simétrica e o movimento dos membros posteriores e dos dedos dos pés (Figura 2c).
    3. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para posição/extensão e movimento normais e simétricos dos membros posteriores e dedos dos pés; 1 para assimetria clara, quando significativamente diminuída o movimento e a posição/extensão assimétrica do membro posterior contralateral (direito) (Figura 2d).
      NOTA: O teste detecta paresia do membro posterior contralesional. Também faz parte da escala mNSS. Este teste pode ser complicado de pontuar com precisão.
  4. Simetria do tronco (Teste 3)
    1. Continue segurando o mouse pela base da cauda (seguindo 2.3.) e avalie os movimentos do tronco.
    2. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para normal, sem flexão do tronco ou flexão/movimento leve simétrico do tronco para ambos os lados (como manobra de "fuga"); 1 para flexão acentuada (>30°) da cabeça/tronco predominantemente contralesional (para a direita), nos primeiros 10s após a retenção.
      NOTA: O teste detecta assimetria por lesões motoras unilaterais. Também faz parte da pontuação mNSS.
  5. Comportamento circular (Teste 4)
    1. Coloque o mouse suavemente em uma superfície plana e deixe-o se mover livremente por pelo menos 1 min. Observe seu padrão de movimento.
    2. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para movimento exploratório, vívido e linear sem comportamento circular; 1 para a tendência de virar para um lado, mas não em círculos fechados; 2 para movimento inconstante em círculos fechados para um lado; 3 para movimento constante em círculos fechados para um lado; 4 para girar, balançar ou nenhum movimento.
      NOTA: O teste detecta déficits de navegação sensório-motora e espacial. Também faz parte do NS.
  6. Simetria corporal (Teste 5)
    1. Continue a partir do Teste 4 e deixe o mouse se mover livremente na superfície plana. Observe seu eixo nariz-cauda.
    2. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para postura normal com tronco elevado do banco e cauda reta; 1 para "ligeira assimetria" se o corpo ligeiramente inclinado para um lado e cauda distalmente dobrada; 2 para "assimetria moderada" se o corpo se curvar ou inclinar-se para o lado contralesional com cauda dobrada proximal e/ou membros esticados para fora do corpo; 3 para "assimetria proeminente" se marcada flexão do corpo, um lado fica inconstantemente no banco e a cauda está claramente dobrada proximalmente (mais de 2 pontos); 4 para "assimetria extrema" se o corpo estiver dobrado, um lado está constantemente deitado no banco e a cauda está altamente dobrada.
      NOTA: Ele detecta déficits sensório-motores unilaterais tronculares e de cauda. Também faz parte da escala NS.
  7. Avaliação da marcha (Teste 6)
    1. Continue a partir do Teste 5 e deixe o mouse se mover livremente na superfície plana. Observe agora sua marcha e verifique se há déficits motores da marcha, como paresia, rigidez dos membros, marcha espástica, desmembramento.
    2. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para marcha normal se exploratória, simétrica e rápida com membros flexíveis que se movem "escondidos" sob o corpo; 1 para marcha rígida, inflexível e mais lenta de um mouse que se move livremente sem mancar; 2 para claudicação clara com movimentos assimétricos (esquerda-direita); 3 para tremer, derivar ou cair após um empurrão suave; 4 para nenhuma caminhada espontânea (não caminha mais do que 3 passos quando estimulado por um empurrão suave).
      NOTA: Ele detecta déficits de marcha combinados. Também faz parte do NS.
  8. Círculo obrigatório (Teste 7)
    1. Segure o rato pela base da cauda para elevá-lo da superfície e deixe-o andar apenas sobre os membros anteriores. Observe seu movimento.
    2. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para movimento linear normal; 1 para tendência de virar para um lado; 2 para virar para um lado em círculos fechados; 3 se girar para um lado com movimentos desajeitados ou falhar lentamente em completar um círculo; 4 se não houver avanço e a parte da frente do tronco estiver no banco.
      NOTA: O teste complementa o teste de comportamento circular (teste 4, ver 2.5). Provavelmente detecta déficits sensório-motores e espaciais. Também faz parte do sistema de pontuação NS.
  9. Postura contra forças laterais (Teste 8)
    1. Coloque o mouse na palma da mão, com o eixo da cauda do nariz (longitudinal) paralelo ao eixo da palma sagital.
    2. Gire o mouse para frente para trás a uma velocidade constante para induzir forças perpendiculares ao seu eixo longitudinal.
      NOTA: Isso força o mouse a manter sua posição vertical e equilíbrio contra as forças laterais durante o balanço. Seu corpo normalmente não entra em contato com a palma da mão ou os dedos.
    3. Observe o visual e sinta qualquer contato com a palma da mão dos lados esquerdo-direito do mouse enquanto ele se equilibra contra o balanço. Verifique se há queda assimétrica, toque na palma da mão ou indicação de fraqueza lateral.
    4. Pontue dependendo dos achados da seguinte forma: 0 se o mouse ficar em uma posição vertical normal com as costas paralelas à palma da mão e puder se equilibrar contra o balanço sem tocar fortemente na palma da mão; 1 se o mouse achatar seu corpo durante o balanço para ganhar estabilidade; 2 se uma parte do rato estiver deitada ou tocar brevemente a palma da mão durante o balanço; 3 se o mouse estiver deitado de lado, mal conseguindo recuperar a posição vertical; 4 se o mouse estiver deitado de bruços, não será capaz de recuperar a posição vertical.
      NOTA: O teste detecta déficits posturais contra a aceleração lateral, mas sua pontuação pode ser subjetiva. Também faz parte do mNSS, NS.
  10. Colocação direcionada do membro anterior (Teste 9)
    1. Segure o mouse pelas costas ou pela base da cauda. Direcione-o perpendicularmente em direção ao feixe, que funciona como um "alvo a ser alcançado". Observe o "alcance" simétrico e o apego.
    2. Uma vez que ele agarre o feixe com firmeza, puxe-o suavemente e observe a "liberação" simétrica dos membros anteriores.
    3. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para "alcance", preensão e "liberação" simétricos; 1 para qualquer assimetria em "alcançar" e/ou "soltar", indicativo de fraqueza contralesional do membro anterior.
  11. Déficit sensório-motor dos membros anteriores (Teste 10)
    1. Segure o mouse firmemente pelas costas e fique de frente para ele ventralmente (veja o vídeo ou a Figura 1e).
    2. Estimule as patas dianteiras sucessivamente com uma ponta fina (por exemplo, palito de madeira) de um ângulo cego. Observe a reação da pata dianteira.
    3. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para movimento de preensão normal e imediato em ambos os lados; 1 para preensão contralesional ausente ou claramente tardia.
      NOTA: Tanto o 2.10 quanto o 2.11 testam déficits sensório-motores finos do membro anterior. Eles também fazem parte do mNSS.
  12. Caminhada na trave (Teste 11)
    1. Coloque uma viga de madeira de 1 m de comprimento (Tabela de Materiais) para conectar duas superfícies elevadas (por exemplo, bancos, mesas) a uma altura de 1-1.5 m acima do solo. Estabilize as bordas da viga para evitar vibrações ou instabilidade.
    2. Coloque o mouse no meio do feixe com o eixo nariz-cauda paralelo ao feixe (Figura 2e). Permita o equilíbrio ou a caminhada livre na trave. Observe seu equilíbrio ou paresia do membro e cai.
      NOTA: O mouse deve ganhar equilíbrio no feixe antes de marcá-lo. Segure uma luva grossa abaixo do animal (a uma distância de aproximadamente 15-20 cm) para protegê-lo se cair.
    3. Pontue dependendo dos achados da seguinte forma: 0 se o mouse se equilibrar e caminhar com postura firme em direção a um lado do feixe; 1° se agarrar ao lado da viga e não andar sobre ela; 2 se um dos ramos cair da viga; 3 se dois galhos caírem da viga; 4 se o mouse tentar se equilibrar na trave, mas cair (após 40s); 5 se cair entre 20-40s; pontuação 6 se cair sem tentativa de se equilibrar ou pendurar na trave (<20s).
      NOTA: O teste detecta déficits motores combinados de membros anteriores, posteriores e tronco. Também faz parte da escala mNSS.
  13. Sensação de bigode (Teste 12)
    1. Coloque o mouse em uma bancada aberta (como nos testes 4 e 5). Reserve algum tempo para acomodação.
    2. Estimule seus bigodes esquerdo e direito sucessivamente, com um cotonete fino e de ponta longa, de um "ângulo cego". Observe uma resposta rápida de giro da cabeça em direção à estimulação.
    3. Pontuação dependendo dos achados da seguinte forma: 0 para rotação de cabeça normal e rápida após a estimulação, bilateralmente; 1 para resposta contralesional mais lenta após a estimulação; 2 para resposta contralesional ausente (sem turno); 3 para resposta contralesional ausente e ipsilesional mais lenta; 4 para resposta bilateral ausente.
      NOTA: Evite a detecção visual do algodão, pois isso causaria falsamente uma virada de cabeça ipsilateral. O teste é tecnicamente correto apenas quando o camundongo é "surpreendido" pela estimulação do bigode. O teste também faz parte da SN e detecta déficits sensório-motores dos bigodes (córtex em barril).
  14. Escalada (Teste 13)
    1. Use uma superfície inclinada revestida de borracha, com ângulo de 45° (Figura 2a) e coloque o mouse no centro. Observe o esforço do rato para escalar.
    2. Pontue dependendo dos achados da seguinte forma: 0 (normal) se o mouse subir rapidamente e sem esforço até o topo da superfície; 1 se sobe com esforço, com fraqueza nos membros; 2 se se agarrar à encosta sem escorregar ou subir; 3 se deslizar pela encosta apesar do esforço para evitar quedas; 4 se deslizar sem esforço para evitar quedas.
      NOTA: O teste também faz parte do NS e detecta a força motora geral.
  15. Calcule a pontuação do fESS somando todas as pontuações dos testes 1 a 13
    NOTA: a pontuação fESS de 0 indica um mouse normal, a pontuação máxima é 42. Grandes infartos com lesões estriatais e corticais geralmente induzem escores >7-9. Examine e pontue vários camundongos normais antes de começar a avaliar os acariciados, para acomodar as variações do comportamento normal e reduzir a pontuação fESS falso positiva. Use o protocolo de vídeo fornecido constantemente para padronização da pontuação durante todo o experimento.

3. Componente geral do ESS (gESS)

NOTA: Avalie o gESS para detectar sinais de "doença geral do camundongo", por exemplo,., inflamação ou infecção, geralmente presentes durante as primeiras 1-2 semanas pós-fMCAo. Use a folha de pontuação no arquivo suplementar 2. Avalie o gESS preferencialmente após completar o fESS.

  1. Coloque o mouse em uma superfície plana (bancada) e deixe-o se mover livremente como em 2.5. Avalie sequencialmente as pontuações a seguir.
  2. Observe sua pele. Pontuação de acordo com a folha de pontuação gESS (pontuações 0-2, ver arquivo suplementar 2).
  3. Verifique a resposta de sobressalto do mouse: surpreenda o mouse com uma palma repentina de um ângulo cego, quando estiver relaxado. Verifique e marque a reação das orelhas do camundongo de acordo com a folha de pontuação gESS (pontuações 0-2, consulte o arquivo suplementar 2).
  4. Avalie visualmente os olhos do rato relaxado: verifique se há olhos abertos/fechados ou presença de muco. Pontuação de acordo com a folha de pontuação gESS (pontuações 0-4, consulte o arquivo suplementar 2).
  5. Observe a atividade espontânea geral e o estado de alerta do camundongo. Pontuação de acordo com a folha de pontuação gESS (pontuações 0-4, consulte o arquivo suplementar 2).
  6. Observe o comportamento espontâneo geral do camundongo para qualquer presença de ansiedade, hiperexcitabilidade, agressão ou giro ao longo de seu eixo durante qualquer manuseio. Pontuação de acordo com a folha de pontuação gESS (pontuações 0-4, consulte o arquivo suplementar 2).
  7. Calcule a pontuação de gESS somando as pontuações de todas as etapas acima (pontuação observacional, etapas 3.2. a 3.6).
    NOTA: O escore gESS não detecta os déficits focais induzidos por lesões de AVC nem é afetado por mSU, como mostrado anteriormente 13. Todos os testes são adaptados da escala NS 9,15.

4. Quantificação dos déficits do membro anterior com o Teste do Cilindro

NOTA: O teste do cilindro é descrito anteriormente em detalhes 9,15,27 e não será descrito em detalhes aqui. O teste do cilindro é um teste comportamental independente que quantifica de forma imparcial os déficits dos membros anteriores (ver 4.2).

  1. Execute o teste seguindo as instruções fornecidas aqui15. Capture vídeos e analise-os como em 15. Meça os contatos dos primeiros membros direito e esquerdo com as paredes. A Figura 3a,b mostra imagens da configuração.
  2. Calcule a lateralização do uso do membro devido à paresia contralesional (direita) como uma porcentagem percentual. Use a fórmula: % de preferência para passos à esquerda = [(esquerda - direita) primeiros contatos / (direita + esquerda) contatos] x 100.
    NOTA: Execute um teste de cilindro de linha de base para cada mouse antes de induzir um derrame. Execute testes em pontos de tempo de acordo com cada plano experimental.

5. Quantificação dos déficits dos membros anteriores e posteriores com o Teste do Degrau em Escada

NOTA: Construa o aparelho para camundongos em acrílico (mostrado na Figura 3c): um corredor de 1 m de comprimento com paredes de 20 cm de altura, degraus de plástico (3 mm de diâmetro) colocados em intervalos regulares de 15 mm (Figura 3c1) e uma caixa de "refúgio" na extremidade distal. Coloque a cama dos animais na caixa de refúgio para familiaridade e alguns pellets de comida ou manteiga de amendoim como recompensa. A largura do corredor deve ser de 10 cm e deve ser elevada a aproximadamente 30 cm do solo.

  1. Treine os camundongos no aparelho 1-3 dias antes da linha de base do experimento. Execute o treinamento como nas etapas 5.1.1 a 5.1.4.
    NOTA: O treinamento é necessário para acomodar os animais em uma velocidade constante, caminhada normal pelo corredor de degraus, sem paradas, curvas ou comportamento exploratório. Realizar treinos durante 2 dias consecutivos (2 sessões). Cada sessão de treinamento consiste em 3 corridas (corrida = uma única caminhada por todo o corredor em direção à caixa de refúgio). A coleta de dados de linha de base é necessária para o acompanhamento.
    1. Limpe os degraus e paredes antes de cada corrida com álcool 70%, para evitar odores e distrações/paradas "exploratórias" do mouse.
    2. Posicione o mouse no início do corredor de degraus de escada, de frente para a caixa de refúgio, para iniciar uma corrida. Deixe o rato andar livremente em direção à caixa de refúgio no final do corredor. Não force o animal a andar.
      NOTA: As corridas durante o treinamento são normalmente altamente variáveis em termos de duração e padrão de caminhada. O objetivo do treinamento é uma caminhada estável em direção à caixa de refúgio, geralmente dentro de <10 s, sem paradas/curvas, o que é alcançado geralmente no final do segundo dia de treinamento. Manuseie o animal sempre com cuidado para evitar a indução de estresse que distrairá o treinamento adequado. Remova os animais do corredor e refaça a corrida se eles permanecerem no corredor e explore localmente por >1 min, para evitar a habituação.
    3. Execute a1ª corrida de treinamento. Deixe o animal descansar na caixa de refúgio por 5 min após a1ª corrida.
      NOTA: Este tempo de descanso prolongado permite que o mouse se familiarize com a caixa de refúgio e a perceba como um alvo "descansativo/recompensador" a ser alcançado. Alcançar uma "percepção gratificante" da caixa de refúgio é crucial para corridas bem-sucedidas.
    4. Remova o mouse da caixa de refúgio e execute a segunda e terceira execuções de treinamento como em 5.1.2. Deixe um tempo de descanso mais curto na caixa de refúgio no final dessas corridas (30-60 s), para evitar a habituação.
      NOTA: O treinamento é concluído no dia 2. No dia 2, quase todos os animais aprendem a andar pelo corredor em um ritmo constante. Considere excluir os animais de outras experimentações se eles não estiverem aprendendo.
  2. Execute o experimento em camundongos treinados. Teste os mouses por 2 execuções de cada vez durante todos os pontos de tempo do experimento e da linha de base.
    1. Execute execuções conforme descrito nas etapas 5.1.1 e 5.1.2. Deixe um máximo de 5 minutos de tempo de descanso entre as 2 corridas na caixa de refúgio.
    2. Use um smartphone (ou câmera equivalente) e um "bastão de selfie" para capturar vídeos (dados) dos animais em um leve ângulo ventral e "cego" de alguma distância (como mostrado na Figura 3c2). Certifique-se de capturar os membros enquanto o animal caminha no corredor. Não distraia visualmente o mouse durante a corrida e siga seus membros durante a corrida (Figura 3c2).
    3. Registre as duas execuções, mas use e analise os dados da segunda execução.
    4. Meça o número de etapas de falha (quedas) entre os degraus de cada membro (esquerdo/direito, anterior/posterior) (Figura 3c3), revisando o vídeo usando qualquer software reprodutor de mídia com opções de câmera lenta. Calcule a diferença absoluta ou % entre as etapas de falha do membro direito e esquerdo, separadamente para os membros anteriores e posteriores.
      NOTA: A segunda execução fornece resultados mais confiáveis. Um mouse saudável geralmente tem 0-1 etapas de falha arbitrárias por membro (direito ou esquerdo) durante sua segunda execução, o que normalmente dá um intervalo de diferença de 0 ±1. Um camundongo acariciado fará etapas de falha com seu membro parético direito (contralesional) (membro anterior ou posterior), resultando em uma lateralização "para a direita" positiva. Um animal gravemente acariciado pode ser mais lento ou não completar a corrida durante os primeiros 7 a 10 dias após o derrame, no entanto, ele alcançará corridas adequadas depois e mostrará déficits graves.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O mSU, conforme descrito acima, começa após a operação fMCAo. Nossos resultados representativos nas duas coortes independentes de camundongos de fMCAo stroke e sham (Figura 4a) confirmam o valor previamente comprovado de mSU, particularmente durante o período crítico entre os dias 3 e 1013. Em nossas coortes, a mortalidade ocorreu para 3/15 animais da Coorte 1 (AVC, 6 meses de acompanhamento), 2/10 da Coorte 2 (AVC, 14 dias de acompanhamento) e 0/6 dos animais operado...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo é um guia abrangente para o protocolo de suporte mSU, projetado para reduzir a mortalidade artificial entre os dias 3-10 em camundongos submetidos a grandes derrames territoriais pelo modelo fMCAo13. Além disso, o presente protocolo inclui um guia de vídeo padronizado para o componente focal da escala ESS (fESS) para reduzir a subjetividade estendida e o viés da pontuação focal neurológica em camundongos após o AVC. Paralelamente, introduzimos...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nenhuma divulgação para relatar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Nikolaos Plakopitis e Ioannis Tatsidis pelo valioso apoio cirúrgico durante partes do estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tools for mSU
5% Dextrose solution VIOSER S.Ana (não aplicável)Qualquer genérico
Termómetro digital sem contactoAVRONYTC20095Qualquer genérico
Balança digitalKERN & Sohn GmbhFCB6K1Qualquer genérico
Pellets de alimentosMucedola srlouQualquer genérico, use a comida normal da sua instalação animal
Placa de aquecimentoPhotaxnaAquecedor de pratos Photax 2
Antisséptico líquidoSchü lke & Mayr GmbHnaOctenisept®
LiquidificadornaPara pulverização de pellets. Qualquer genérico
Solução salina normalDEMO S.A.naInjeção de Cloreto de Sódio 0,9%
Pinsetter e cotonetesnaQualquer genérico
AçúcarnaQualquer genérico
Seringas (1ml) com agulhanaQualquer genérico. Para administração de alimentos (sem agulha) e para administração de fluidos subcutâneos (com agulha)
Tools for ESS
45&°; superfície angular construa naFeito de acrílico ou outro material, com superfície de borracha, para testes de escalada
cotonete Qualquer genéricoemcotonetes de ouvido comerciais, faça sua ponta de algodão longa e
afiada com bordade madeira Qualquer genériconapor exemplo, palitos de dente
Feixe longo Dimensões: 1 x 1 x1cm, aproximadamente 100cm de comprimento, de madeira. Coloque entre duas bordas da mesa para teste de caminhada de viga
Luva grossa Qualquergenérico paraevitar traumas em animais ao cair de uma viga
de alimentos normal de calibre 27 fina ,

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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