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Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

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DOI:

10.3791/66866

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14 de junho de 2024

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1Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, 2Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

Neste artigo

Resumo

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Resumo

Na última década, as abordagens de célula única tornaram-se o padrão-ouro para estudar a dinâmica da expressão gênica, a heterogeneidade celular e os estados celulares nas amostras. Antes dos avanços de uma única célula, a viabilidade de capturar a paisagem celular dinâmica e as transições celulares rápidas durante o desenvolvimento inicial era limitada. Neste artigo, um pipeline robusto foi projetado para realizar análises de células únicas e núcleos em embriões de camundongos do dia embrionário E6.5 a E8, correspondendo ao início e conclusão da gastrulação. A gastrulação é um processo fundamental durante o desenvolvimento que estabelece as três camadas germinativas: mesoderma, ectoderme e endoderme, que são essenciais para a organogênese. Extensa literatura está disponível sobre ômicas unicelulares aplicadas a embriões perigastrulantes do tipo selvagem. No entanto, a análise de células únicas de embriões mutantes ainda é escassa e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS. Isso se deve em parte às restrições técnicas associadas à necessidade de genotipagem, gestações cronometradas, contagem de embriões com genótipos desejados por gravidez e número de células por embrião nesses estágios. Aqui, é apresentada uma metodologia projetada para superar essas limitações. Este método estabelece diretrizes de reprodução e gravidez programada para obter uma maior chance de gestações sincronizadas com os genótipos desejados. As etapas de otimização no processo de isolamento do embrião, juntamente com um protocolo de genotipagem no mesmo dia (3 h), permitem que a célula única baseada em microgotículas seja realizada no mesmo dia, garantindo a alta viabilidade das células e resultados robustos. Este método inclui ainda diretrizes para isolamentos ideais de núcleos de embriões. Assim, essas abordagens aumentam a viabilidade de abordagens unicelulares de embriões mutantes no estágio de gastrulação. Prevemos que este método facilitará a análise de como as mutações moldam a paisagem celular da gástrula.

Introdução

A gastrulação é um processo fundamental necessário para o desenvolvimento normal. Esse processo rápido e dinâmico ocorre quando as células pluripotentes fazem a transição para precursores específicos da linhagem que definem como os órgãos se formam. Durante anos, a gastrulação foi definida por muito tempo como a formação de três populações amplamente homogêneas: mesoderma, ectoderma e endoderme. No entanto, tecnologias de alta resolução e um número emergente de modelos de células-tronco embrionárias 1,2 revelam heterogeneidade sem precedentes entre as camadas germinativas iniciais 3,4. Isso sugere que ainda há muito a ser descoberto sobre os mecanismos que regulam as distintas populações de células da gástrula. O desenvolvimento embrionário de camundongos tem sido um dos melhores modelos para estudar as decisões iniciais do destino celular durante a gastrulação 3,5. A gastrulação em camundongos é rápida, pois todo o processo de gastrulação ocorre em 48 h, do dia embrionário E6.5 a E85.

Avanços recentes em tecnologias de célula única permitiram o mapeamento detalhado do desenvolvimento embrionário de camundongos do tipo selvagem, fornecendo uma visão abrangente das paisagens celulares e moleculares dos embriões durante a gastrulação 3,4,6,7,8. No entanto, a análise de embriões mutantes nesses estágios é menos comum e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS 9,10. A escassa literatura reflete os desafios técnicos associados à manipulação e preparação unicelular de embriões gastrulantes que requerem genotipagem. Capturar o processo dinâmico de gastrulação pode representar desafios devido à sua natureza rápida, especialmente para a compreensão de embriões mutantes. O tempo e a sincronização das gestações são essenciais, pois mesmo pequenas diferenças entre as gestações programadas podem ser mal interpretadas como um fenótipo de desenvolvimento resultante do gene mutante. Isso se torna particularmente importante quando o gene mutante influencia o processo de gastrulação13,14. Neste estudo, são estabelecidas diretrizes para a obtenção de gestações sincronizadas por meio da visualização de tampões vaginais (ou seja, a massa de líquido seminal coagulado formada na vagina da fêmea após o acasalamento). Além disso, uma estratégia é projetada para obter dados robustos de células únicas de embriões gastrulantes mutantes de E6.5 a E8. Esta estratégia é concebida para superar as restrições associadas ao baixo número de embriões com o genótipo desejado por gravidez e à diminuição da viabilidade causada pelo congelamento e descongelamento de embriões ou células.

Este artigo descreve uma metodologia otimizada desde o estabelecimento de gestações programadas por meio de tampões vaginais até o sequenciamento final de células/núcleos únicos. Este método explica como aumentar o número de gestações sincronizadas para obter um número maior de embriões com o genótipo desejado, isolamentos de células/núcleos para melhorar a viabilidade das células e um protocolo de genotipagem no mesmo dia. Este manuscrito também descreve o processo de isolamento embrionário em diferentes momentos de gastrulação. A metodologia ajuda a aumentar o número de células/núcleos embrionários viáveis finais para sequenciamento, garantindo dados de sequenciamento de alta qualidade. Portanto, este método abrirá as portas para estudos de células únicas de embriões gastrulantes que requerem genotipagem.

Protocolo

Este protocolo e todos os experimentos com animais descritos foram formalmente aprovados e de acordo com as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Temple University, que segue as diretrizes internacionais da Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório. Todos os camundongos descritos estavam na cepa de fundo C57 / BL6N. Não foram observadas preocupações com a saúde animal nesses estudos.

1. Colônia de reprodução e gestações programadas

  1. Cronometre as gestações pela visualização de um tampão vaginal. O meio-dia do dia do plugue é considerado E0.5.
  2. Ratos domésticos em gaiolas com material de cama contendo cama de madeira lascada e material de nidificação de papel.
    1. Cada gaiola contém ração de rato, água doce e um item de enriquecimento (por exemplo, túnel e material de nidificação). Rastreie e colete informações da colônia diariamente durante a reprodução cronometrada.
    2. Registre todas as informações, como a idade do camundongo, o número de gestações que uma fêmea teve, o número de plugues colocados por um camundongo macho e o estágio do estro (Figura 2) para camundongos fêmeas.
      NOTA: As fêmeas que já deram à luz 1-2 vezes terão ninhadas maiores em gestações futuras.
  3. Antes de iniciar a gravidez cronometrada, aloje o rato macho sozinho em uma gaiola 1 semana antes da reprodução. Durante a semana de iniciação da reprodução, introduza pelo menos 1 fêmea por macho na gaiola.
    NOTA: Dependendo do protocolo animal aprovado, adicionar 2-3 fêmeas em uma gaiola de reprodução pode ser permitido e é preferível para aumentar a geração de plugues.
  4. Configure pelo menos 4 trios reprodutores (2 camundongos fêmeas para 1 macho) para aumentar as chances de gestações sincronizadas nas gaiolas (também conhecido como vários plugues no mesmo dia). Isso aumentará o número de embriões isolados no mesmo estágio de desenvolvimento.
  5. Organize o acasalamento ideal à tarde ou à noite antes das 17h, e as fêmeas são colocadas na gaiola do macho ou vice-versa. Se a reprodução não ocorrer em 4-5 dias, considere trocar de parceiro de acasalamento a cada dois dias.
    NOTA: Se não for possível verificar se há um tampão vaginal na manhã seguinte, separe o casal reprodutor na noite anterior (ou seja, fim de semana/feriados).
  6. Verifique se há tampões vaginais todos os dias no início da manhã; antes das 9h é preferível.
    1. Para verificar se há tampões vaginais, levante suavemente as ratas pela base da cauda e observe a abertura vaginal. Procure uma massa gelatinosa branca ou creme. Muitas vezes, o tampão vaginal pode ser óbvio, mas se não estiver claro, pegue uma pinça e sonde suavemente a abertura vaginal. Considere apenas os plugues mais aparentes para isolamento. Consulte a Figura 2C.
      NOTA: É fundamental verificar se há tampões vaginais o mais cedo possível pela manhã para evitar perder uma possível gravidez. Os tampões podem cair ou dissolver-se após 12 h.
      NOTA: Mesmo que um plugue seja observado, isso não garante que a rata esteja grávida. Se um tampão parcial ou nenhum tampão for observado, mas houver vermelhidão perto da abertura vaginal dos camundongos fêmeas, não considere essas fêmeas para isolamento, pois há uma chance menos provável de o tampão grudar. A probabilidade de gravidez após o acasalamento varia entre as linhagens de camundongos e depende da fase do ciclo estral durante o acasalamento (Figura 2).
  7. Assim que um tampão vaginal for observado, registre o dia. O meio-dia do mesmo dia em que o tampão vaginal é observado é considerado E0,5. Separe os camundongos fêmeas da gaiola de reprodução e isole os embriões dependendo do estágio de gastrulação desejado.
    NOTA: Este método não fornece um tempo preciso para o acasalamento. Convencionalmente, presume-se que o acasalamento ocorra por volta da meia-noite da noite anterior. Consequentemente, os embriões são considerados com meio dia de idade (E0,5) ao meio-dia do dia em que o tampão vaginal é observado.

2. Isolamento de embriões de camundongos durante a gastrulação

  1. Antes de iniciar o isolamento do embrião, prepare todos os reagentes e equipamentos necessários.
    1. Limpe bem a área com etanol 70%. Certifique-se de que todas as ferramentas de dissecação (pinças e tesouras) sejam lavadas e esterilizadas. Obtenha 5 mL estéreis de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/10% de soro fetal bovino (FBS) e 20 mL de DPBS-/- e coloque no gelo.
    2. Realize todos os isolamentos usando um estereomicroscópio com platina de luz transmitida e câmera para auxiliar na fenotipagem macroscópica do desenvolvimento.
  2. Eutanasiar a mãe de camundongos grávidas e iniciar o isolamento imediatamente.
    1. Coloque a barragem prenhe em uma câmara de CO2 com a taxa de fluxo de CO2 ajustada para deslocar 20% do volume da gaiola por minuto. Monitore o camundongo de perto e confirme a morte observando a ausência de movimentos respiratórios.
    2. Mantenha o fluxo de CO2 por mais 2 minutos após a ausência de movimentos respiratórios. Confirme a eutanásia realizando uma luxação cervical.
    3. Posicione os mouses em uma posição normal em uma superfície firme e plana. Em seguida, com o polegar e o indicador de uma mão contra a nuca na base do crânio, empurre para frente e para baixo enquanto puxa para trás com a outra mão segurando a base da cauda.
    4. Verifique a eficácia da luxação sentindo a separação das vértebras cervicais. Quando a medula espinhal é cortada, um espaço de 2-4 mm será palpável entre os côndilos occipitais e a primeira vértebra cervical.
      NOTA: Não sacrifique várias mães grávidas de uma só vez, pois a viabilidade celular será afetada. O isofluorano pode ser usado como agente anestésico alternativo se aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) ou órgão equivalente.
  3. Coloque a mãe grávida de costas e esterilize a área próxima à abertura vaginal com etanol.
    1. Com tesoura de dissecção, levantar a dobra cutânea próxima à abertura vaginal e fazer um pequeno corte em forma de V, revelando lentamente o útero da mãe grávida (Figura 3 [seta amarela]).
    2. Disseque o corno uterino da mãe grávida segurando uma extremidade dele com uma pinça e cortando-o, certificando-se de remover o colo do útero. Coloque o corno uterino em uma placa de Petri de 10 cm contendo DPBS-/- em gelo (Figura 3).
      NOTA: Dependendo do estágio de isolamento do embrião, o útero se assemelhará a locais de implantação menores ou maiores (ou seja, 'pérolas' em um cordão).
  4. Com tesouras de dissecação, corte cada local de implantação ('pérolas') contendo os inchaços deciduais no interior e coloque em DPBS-/- fresco em uma placa de Petri de 6 cm sobre gelo (Figura 3).
    NOTA: Uma mãe grávida média terá cerca de 6-8 embriões implantados.
  5. Pegue um local de implantação e coloque-o em uma nova placa de Petri de 6 cm em cima do estágio de estereomicroscópio e adicione 500 μL de DPBS-/- em cima dele. Ajuste o foco do microscópio e a fonte de luz (Figura 3).
    NOTA: Dependendo do tamanho do local de implantação, a quantidade de DPBS pode variar; o objetivo é ter DPBS suficiente para que o local de implantação fique submerso.
  6. Usando uma pinça de dissecção de ponta fina, remova o músculo uterino do local de implantação. Segure o local de implantação com um conjunto de pinças em uma mão e insira lentamente outro par de pinças com a outra mão na extremidade do local de implantação cortado do corno uterino, revelando lentamente o inchaço da decídua (Figura 3).
    NOTA: Não puxe ou puxe com muita força a superfície uterina, pois isso pode levar à ruptura do inchaço decidual ou mesmo à lise do embrião.
  7. Depois que o inchaço decidual for isolado, prossiga para revelar o embrião.
    1. Segure a extremidade anti-mesometrial do inchaço decidual com um par de pinças e, com o outro par, faça lentamente um corte horizontal de cerca de 1/4 do tamanho do inchaço decidual da extremidade mesometrial (ou seja, geralmente a extremidade mais pontiaguda do inchaço decidual).
    2. Agora, com as duas pinças, empurre lentamente a partir da extremidade anti-mesometrial do inchaço decidual e o embrião sairá da extremidade mesometrial recém-cortada (Figura 3).
      NOTA: Não rasgue o inchaço decidual, pois isso quebrará o embrião. Se necessário, faça cortes menores ao longo da extremidade mesometrial do inchaço decidual.
  8. Assim que o embrião for revelado, remova todos os tecidos extraembrionários presos.
    1. O saco endodérmico parietal e o cone ectoplacentário podem sair espontaneamente do embrião durante o processo de revelação, mas se não, use um par de fórceps e remova-os junto com qualquer sangue materno associado. Em seguida, usando duas pinças, segure o embrião com um par e retire lentamente o saco vitelino visceral do embrião usando o outro conjunto.
    2. Usando uma pipeta P20, coloque o saco vitelino com no máximo 10 μL de DPBS-/- do prato em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) de 8 tiras no gelo, pois ele será usado para genotipagem no mesmo dia.
      NOTA: É fundamental que a amostra do saco vitelino não esteja contaminada com tecido da mãe grávida. A contaminação pode levar à atribuição incorreta do genótipo do embrião.
  9. Tire fotos de campo brilhante de embriões recém-isolados para garantir que o estadiamento dos irmãos de ninhada seja semelhante. Com uma pipeta P200, pipetar lentamente o embrião com 50 μL de DMEM/10% FBS e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL no gelo. Deixe os embriões permanecerem no gelo até que os genótipos sejam confirmados.
    NOTA: Os embriões foram mantidos em gelo por 3-4 h sem degradação óbvia, mas não excedem esse tempo, pois ocorrerá uma diminuição na viabilidade celular. Rotule os embriões e tubos de genotipagem de acordo. A obtenção de imagens de campo claro é incentivada para identificar e anotar diferenças fenotípicas grosseiras entre os embriões.
  10. Repita essas etapas para todos os inchaços deciduais restantes. Limpe todas as ferramentas de dissecação e use novos plásticos para cada isolamento para garantir que não haja contaminação de isolamentos anteriores.
    NOTA: Certifique-se de que os procedimentos de dissecção sejam limitados a 1 h a partir do momento da coleta do local de implantação da mãe grávida.
  11. Prossiga para isolar os embriões da próxima mãe grávida (se várias gestações sincronizadas foram identificadas) antes de passar para a etapa de genotipagem no mesmo dia.

3. Genotipagem no mesmo dia (Figura 4)

  1. Digerir cada saco vitelino visceral num tubo de PCR de 8 tiras. Usando uma pipeta P20, adicione 19,3 μL de tampão de lise de DNA modelo de PCR e 0,7 μL de 0,2 μg/mL de proteinase K a cada amostra de saco vitelino.
  2. Vortex a amostra por 10 s e gire para baixo para posicionar as amostras no fundo do tubo usando uma mini centrífuga com um adaptador de tira a 1.000 x g por 10 s. Coloque o tubo de PCR de 8 tiras em um bloco de calor de 85 °C por 45 min e vórtice por 5 s a cada 5 min.
    NOTA: É importante vortex amostras durante a digestão para maximizar a lise celular em 45 min.
  3. Após 45 min, gire a tira do tubo para baixo usando uma mini centrífuga com um adaptador de tira a 1.000 x g por 10 s e prossiga com a PCR para identificação genética desejada. Para referência, é fornecido um protocolo de amostra para um sistema Cre-lox. A seguir está um exemplo de condições de PCR para genotipagem de Cre. Projete primers para amplificar as regiões de 5 'e 3' do local Cre alvo.
  4. Para realizar a reação de PCR para genotipagem de Cre, prepare uma mistura mestre de PCR por tubo de PCR de 8 tiras para cada saco vitelino contendo 10 μL de mistura de Taq DNA polimerase, 0,5 μL de 0,5 μM de primer Cre direto, 0,5 μL de 0,5 μM de primer Cre reverso, 5 μL de água certificada por PCR e 4 μL de DNA genômico do saco vitelino.
    NOTA: Se estiver usando um protocolo otimizado para genotipagem de cauda de camundongo, adicione o dobro da quantidade de DNA normalmente utilizada para resultados mais limpos.
  5. Uma vez que a mistura principal de PCR tenha sido feita, execute o programa de amplificação do ciclo térmico de PCR. Para a genotipagem de Cre, o ciclo é o seguinte: (1) 95 °C durante 3 min, (2) 95 °C durante 30 s, (3) 55 °C durante 30 s, (4) 72 °C durante 30 s, passo repetido 2-4 durante 34 ciclos, (5) 72 °C durante 10 min, (6) 4 °C hold. Execute os produtos de PCR em um gel de agarose a 1% para tirar conclusões de genotipagem.
    NOTA: Se mais de um PCR for necessário para identificação genética, execute as reações de PCR simultaneamente para otimizar o tempo. Para acelerar o processo, prepare o gel de agarose com um dia de antecedência no dia do experimento e armazene-o a 4 ° C durante a noite. Não considerar amostras sem genótipos claros. Leve em consideração o genótipo e o estágio de desenvolvimento para as amostras, pois os irmãos de ninhada podem estar em diferentes estágios de gastrulação e potencialmente distorcer os resultados. Ao realizar a genotipagem dos alelos LoxP, as bandas de PCR esperadas no gel podem variar dependendo do Cre-driver utilizado. Por exemplo, se o driver Cre for expresso no saco vitelino visceral, a banda Loxp aparecerá deslocada nos embriões Cre-positivos (Cre+), em comparação com os Cre-negativos (Cre-). No entanto, se o Cre não for expresso no saco vitelino visceral, o tamanho da banda Loxp será o mesmo tamanho nos embriões Cre+ e Cre- (ou seja, os alelos Loxp não serão floxed na linhagem do saco vitelino). Um embrião portador de um alelo Cre+ e dois alelos Loxp é considerado um embrião KO condicional. No entanto, para confirmar a deleção do gene floxed, recomenda-se realizar uma confirmação do nocaute do gene nas células que expressam o driver Cre, seja repetindo o protocolo de genotipagem ou por análise de qPCR dos níveis de mRNA do gene floxed (Figura 4D, E).
  6. Conservar as restantes amostras de saco vitelino digerido no congelador a -20 °C para armazenamento a longo prazo.

4. Dissociação celular de embriões e viabilidade celular

  1. Uma vez confirmados os genótipos, pegue uma pipeta P200 e pipete 50 μL de DMEM/10% FBS. Agrupe embriões com o mesmo genótipo em um novo tubo de 1,5 mL e coloque o tubo no gelo.
    NOTA: Não prossiga com o experimento se não houver pelo menos 5 embriões por grupo (E7-E7.5) ou 3 (E7.75-E8), pois a contagem de células e a viabilidade diminuirão tremendamente.
  2. Depois que os embriões forem agrupados com base nos genótipos, permita que eles se depositem no fundo do tubo. Lave os embriões agrupados adicionando 50 μL de DPBS-/- e espere que os embriões assentem antes de remover o máximo possível de DPBS-/- sem remover os embriões do tubo. Repita esta etapa duas vezes.
    NOTA: Segurar o tubo de 1,5 mL contra uma fonte de luz ou em direção a uma janela facilitará a visualização dos embriões que se acomodam no fundo do tubo.
  3. Adicionar 100 μL de tripsina aos embriões agrupados e incubar a 37 °C em um bloco de calor por 5 min. Agite suavemente os tubos de 1,5 mL a cada 30 s para ajudar as células a se dissociarem.
    NOTA: Não use vórtice ou pipeta durante o processo de tripsinização, pois danifica as células. Se mais de 5 embriões (E7-E7.5) ou 3 embriões (E7.75-E8) forem agrupados, faça a digestão da tripsina em outro tubo com uma quantidade equivalente de tripsina (~ 20 μL por 1 embrião). Use ~ 20 μL de tripsina por embrião (E6.5-E7.5), 35 μL por embrião (E7.75) e 40 μL para embrião (E8).
  4. Após 5 min, neutralizar a tripsina com 300 μL de DMEM/10% de FBS. Centrifugue os embriões agrupados a 100 x g por 4 min em temperatura ambiente (RT). Após a centrifugação, um pequeno pellet aparecerá para todas as amostras. Ressuspenda os pellets em 40 μL de DMEM/10% FBS e coloque-os no gelo.
    NOTA: O tamanho do pellet varia de acordo com o número de embriões agrupados. É possível que o pellet não esteja visível, mas prossiga para a próxima etapa. A quantidade de DMEM/10% FBS necessária para neutralizar a tripsina dependerá da quantidade de tripsina adicionada. Adicione 3 vezes a quantidade de DMEM/10% à quantidade de tripsina.
  5. Determinar a concentração das células ressuspensas (40 μL) utilizando um contador de células automático. Misture 5 μL de células com 5 μL de azul de tripano em um novo tubo de 1,5 mL. Pipetar bem a mistura e pipetar sobre uma lâmina para determinar o número de células e a viabilidade celular. A concentração ideal de células é de 700-1200 células/μL e a viabilidade celular é de 90% ou mais.
    NOTA: Se a concentração for inferior a 200 células/μL e a viabilidade for inferior a 50%, não continue o experimento. Se a concentração celular for muito alta, dilua a suspensão celular e reconte as células novamente. Se forem observados aglomerados de células, use um filtro de células para garantir uma suspensão unicelular.
  6. Prossiga para o particionamento de célula única usando um chip microfluídico e siga o protocolo dos fabricantes de chips microfluídicos11.

5. Embriões de camundongo de isolamento de núcleos (opção para pontos de tempo embrionários maiores de E8 em diante)

  1. Prepare a lise fresca e os tampões de lavagem descritos na Tabela 1 e coloque-os no gelo.
    NOTA: O isolamento dos núcleos pode ser realizado em amostras frescas ou congeladas. Se as amostras estiverem congeladas, deixe-as descongelar por 2-5 min no gelo.
  2. Antes de iniciar o experimento, confirme todos os genótipos e agrupe apenas embriões com genótipos claros.
  3. Usando uma pipeta P200, adicione 50 μL de tampão de lise de núcleos aos embriões agrupados em um tubo de 1,5 mL, visando um mínimo de 3 embriões por grupo mutante. Deixe as amostras no gelo com tampão de lise por 5 min e vórtice a cada 30 s.
  4. Após 5 min de incubação, centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta P200, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 50 μL de tampão de lavagem. Uma vez ressuspenso, centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender a 40 μL de DPBS-/-. Conte as células usando um contador de células automatizado. Misture 5 μL de núcleos com 5 μL de azul de tripano em um novo tubo de 1,5 mL. Pipete bem a mistura e coloque-a em uma lâmina para determinar o número e a viabilidade das células.
    NOTA: A membrana nuclear é permeável ao azul de tripano; portanto, a coloração de núcleos isolados é positiva para azul de tripano. Em um contador de células automatizado, a porcentagem de células mortas é usada para estimar a porcentagem de núcleos isolados (Figura 5A).
  6. Se a porcentagem de núcleos intactos for superior a 90% (o que significa que pelo menos 90% dos núcleos estão corados com azul de tripano e exibem uma forma arredondada e aspecto túrgido; consulte a Figura 5B, C), prossiga para utilizar um chip microfluídico e siga o protocolo dos fabricantes de chips microfluídicos11.

6. Partição de célula única (incluindo amplificação de cDNA e construção de bibliotecas)

  1. Prossiga imediatamente com o protocolo de sequenciamento de RNA de célula única seguindo o protocolo11 do fabricante do chip microfluídico para obter os melhores resultados. Defina a recuperação da célula-alvo para 6000 células ou mais.

7. Sequenciamento

  1. Depois que as bibliotecas forem construídas, meça a distribuição do tamanho do fragmento e as concentrações das amostras usando um analisador de eletroforese automatizado.
    NOTA: As distribuições ideais do tamanho do fragmento estão entre 300-1000 pb.
  2. As amostras estão prontas para serem carregadas no sequenciador. Agrupe bibliotecas de diferentes exemplos juntos. A concentração final de carga das bibliotecas agrupadas é de 750 pM num volume total de 24 μL. Carregar as bibliotecas agrupadas no cartucho de reagentes, seguindo o protocolo do fabricante da sequenciação12.
  3. Sequencie as bibliotecas carregadas na célula de fluxo pré-montada e no cartucho de acordo com a profundidade de sequenciamento desejada com indexação dupla de extremidade de par. As leituras de sequenciamento seguidas ao protocolo descrito pelos fabricantes de chips microfluídicos são as seguintes11: Leitura 1: 28 ciclos, Índice i7: 10 ciclos, Índice i5: 10 ciclos e Leitura 2: 90 ciclos. Após a conclusão do sequenciamento, os dados passam por análise de bioinformática.
  4. Use métodos de bioinformática para realizar controles de qualidade. Isso inclui avaliar o número de células sequenciadas, leituras por célula e número de genes mapeados por célula.
    NOTA: Para obter os melhores resultados, o número de células sequenciadas é de pelo menos 80% das células-alvo. Recomenda-se que o número de leituras por célula seja de pelo menos 30.000 e o número de genes detectados superior a 3000 (para amostras de camundongos).

Resultados

A metodologia projetada neste artigo destina-se especificamente a melhorar a preparação de amostras de embriões para ômicas de células únicas de E6.5 a E8. Esse pipeline robusto consiste em cinco etapas principais: gestações cronometradas sincronizadas, isolamentos de embriões, genotipagem no mesmo dia, dissociação celular e avaliação da viabilidade celular (Figura 1A). Embora os dados apresentados se concentrem em pontos de tempo de E7 a E7.5, eles podem ser aplicados a embriões até E8 (Figura 1B) com pequenas variações no procedimento (referidas notas ao longo do protocolo). As gestações sincronizadas foram alcançadas colocando duas fêmeas em uma gaiola com um camundongo macho. Os tampões vaginais foram verificados todas as manhãs antes das 10h e, se um tampão fosse observado, era considerado E0,5 até o meio-dia daquele dia (Figura 2A). Neste estudo, as condições ideais para plugues exigiam que um camundongo fêmea no estágio de estro ou proestro fosse emparelhado com um macho com histórico de colocação bem-sucedida de vários plugues durante a reprodução anterior (Figura 2B). Apenas tampões óbvios foram considerados para isolamentos de embriões (Figura 2C).

O tempo de desenvolvimento foi estimado seguindo o cronograma da Figura 2A. Para E7.5, a dissecção do embrião foi iniciada às 12h do7º dia seguinte ao dia da detecção de um tampão. A Figura 3 exemplifica um isolamento bem-sucedido de embriões em E7.5. Após a eutanásia da mãe prenhe, o corno uterino foi dissecado, o inchaço decidual foi cortado individualmente, revelando o embrião, e o saco vitelino foi isolado para genotipagem (Figura 3).

A genotipagem no mesmo dia foi realizada dentro de 3 h após o isolamento do embrião, seguindo as etapas da Figura 4A. Os embriões foram mantidos em gelo durante o processo de genotipagem para preservar sua integridade. Não congele os embriões, pois isso diminuirá o número de células viáveis por embrião. A Figura 4B, C mostra o saco vitelino visceral, o saco endodérmico parietal e o cone ectoplacentário com sangue materno associado. O saco vitelino visceral foi utilizado para genotipagem (Figura 4C). Após a digestão do saco vitelino, a mistura de PCR foi preparada e a reação de PCR foi executada. O produto de PCR resultante foi então separado em um gel de agarose. A Figura 4D mostra os tamanhos de fragmentos esperados para os alelos LoxP e do tipo selvagem (597 pb e 498 pb, respectivamente) e o alelo Cre (650 pb). Na Figura 4E, é apresentado um exemplo de genotipagem do saco vitelino de 6 embriões obtidos de casais reprodutores portadores dos alelos Cre e LoxP (flox). Os géis retratam os produtos de PCR dos alelos Cre e LoxP nos 6 embriões analisados. Os embriões número 2 e número 5 carregam 2 alelos flox e 1 alelo cre; portanto, eles são considerados embriões KO condicionais (Figura 4E, pontos vermelhos). Os embriões 1 e 3 têm 2 alelos flox, mas são negativos para Cre; Portanto, eles são considerados controles FLOX. O embrião 4 tem 2 alelos flox e uma banda fraca para o alelo Cre, resultando em um genótipo "pouco claro". Este embrião não foi processado posteriormente (alternativamente, o experimentalista pode considerar repetir a genotipagem ou conduzir uma validação secundária do KO condicional usando células que expressam Cre). É importante notar que o driver Cre usado neste experimento não é expresso no saco vitelino visceral15; portanto, os alelos LoxP não parecem deslocados no gel de embriões Cre-positivos em comparação com os Cre-negativos.

A contagem de células e a boa viabilidade são necessárias para um experimento bem-sucedido com uma única célula. Suspensões com baixa viabilidade celular, uma alta porcentagem de células mortas, aglomeração ou detritos significativos são inadequadas para processamento posterior. As condições ideais são para 700-1200 células vivas por microlitro e >90% de viabilidade. A Figura 5A apresenta um painel ilustrando a viabilidade celular boa e abaixo do ideal. Os mesmos critérios também podem ser aplicados para o isolamento de núcleos, conforme mostrado na Figura 5B. No entanto, é crucial notar que a avaliação do azul de tripano difere das células e núcleos: as células viáveis não incorporam o azul de tripano, enquanto os núcleos viáveis sim. Se a suspensão de células/núcleos for ideal (viabilidade de >90%), prossiga com a partição de célula única usando um chip microfluídico seguindo os procedimentos do fabricante11. As opções de solução de problemas são fornecidas para suspensões em que a viabilidade de células/núcleos está entre 60% e 89%, conforme ilustrado na Figura 5C. Se a viabilidade, independentemente do número total de células, cair abaixo de 60%, considere interromper o experimento.

Todo o duto, desde o abate da barragem grávida até a construção da biblioteca, leva um total de 8 horas no mesmo dia (ou seja, as etapas 2 a 6 do protocolo devem ser executadas no mesmo dia). Seguindo os procedimentos descritos pelos procedimentos dos fabricantes de células únicas11, foram preparadas construções de bibliotecas para sequenciamento de RNA de célula única usando células obtidas de embriões E7, com viabilidade celular variando de condições subótimas a ótimas, visando uma recuperação alvo estimada de 2000 células (Figura 6). A Figura 6A mostra uma distribuição representativa do tamanho do fragmento das bibliotecas scRNAseq para condições subótimas e ótimas, indicando que a viabilidade celular não afeta significativamente todo o processo de particionamento de célula única. A distribuição do tamanho do fragmento variou entre 400-500 pb. Isso indica que condições abaixo do ideal não afetam o processo de preparação da biblioteca. A Figura 6B mostra os resultados de experimentos bem-sucedidos e abaixo do ideal de RNAseq de célula única. Após o sequenciamento, foram realizadas verificações de controle de qualidade nas amostras e observaram que, nos casos em que a viabilidade celular estava abaixo do ideal, apenas 10% das células foram sequenciadas com sucesso. Em contraste, as amostras ótimas exibiram uma porcentagem maior, com 91% do total de células sendo sequenciadas. Isso é comprovado ainda mais por gráficos de código de barras, indicando que as condições abaixo do ideal têm maior ruído de fundo em comparação com as condições ideais. A análise de agrupamento foi realizada para ambos os experimentos e revelou 9 agrupamentos nas condições ótimas e 4 no subótimo. A anotação dos clusters usando marcadores conhecidos3 revelou tipos de células esperados nos embriões E7, incluindo epiblasto e estria primitiva (Figura 6B). As anotações de agrupamento no experimento subótimo não foram possíveis devido à falta de enriquecimento em marcadores conhecidos para cada agrupamento. Isso destaca a importância de células de alta qualidade necessárias para a representação adequada dos dados durante esses estágios de desenvolvimento.

figure-results-1
Figura 1: Otimização de embriões inteiros de camundongos gastrulados para sequenciamento de RNA de célula única. (A) Esquema de fluxo de trabalho para obtenção de células e/ou núcleos de alta qualidade a partir de embriões gastrulantes. (B) Imagens representativas de campo brilhante e esquema adaptado3 de embriões de camundongos durante a gastrulação de E7 a E8. Barra de escala: 125 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Estratégia para gestações sincronizadas eficientes para isolamentos de embriões durante a gastrulação. (A) Diagrama esquemático indicando o pipeline para gestações programadas e um cronograma descrevendo os tempos desde a detecção do tampão até o isolamento do embrião para análise de fases específicas de gastrulação. (B) Imagens representativas das fases do ciclo estral para camundongos fêmeas. As fases mais receptivas à reprodução são indicadas. (C) Diagrama esquemático ilustrando como verificar se há tampões vaginais e exemplos de aberturas vaginais sem tampão, tampão parcial ou um bom tampão a ser considerado para isolamentos de embriões. As aberturas vaginais são ampliadas abaixo de cada imagem. O tampão (sêmen coagulado na abertura da vagina) é destacado com uma seta vermelha apontando para ele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Dissecção e genotipagem de embriões E7.5 para sequenciamento de RNA de célula única. Diagramas esquemáticos e imagens do processo de isolamento de embriões E7.5 e dissecação do saco vitelino visceral. A seta amarela indica o útero da mãe grávida e o círculo tracejado amarelo descreve a localização do embrião. As linhas tracejadas representam as áreas que foram cortadas durante a dissecação. "M" denota o fim do mesometrial, enquanto "AM" denota o fim anti-mesometrial. As barras de escala nas imagens do estereoscópio são de 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Genotipagem no mesmo dia de sacos vitelinos. (A) Esquema de fluxo de trabalho para genotipagem no mesmo dia de sacos vitelinos. (B) Imagem representativa do saco endodérmico parietal e do cone ectoplacentário com sangue materno associado. (C) Saco vitelino visceral em embriões E7.5 destacados pela linha tracejada. Barra de escala: 200 μm. (D) Géis representativos do tipo selvagem (+/+), heterozigoto (Flox/+) e homozigoto flox (Flox/Flox) e genotipagem Cre (Mesp1cre15) com tamanhos de fragmentos de DNA observados. (E) São fornecidos resultados de genotipagem no mesmo dia para alelos Cre e flox de sacos vitelinos de 6 embriões (1-6). Os dois embriões com genotipagem flox/flox e Cre negativo (-) são controles flox (pontos azuis), enquanto aqueles com genotipagem flox/flox e Cre positivo (+) são KOs condicionais (pontos vermelhos). O embrião 4 não é ideal devido à fraca banda Cre (flox / flox e Cre-unclear) e, consequentemente, é excluído do processamento posterior. Embriões com o mesmo genótipo são agrupados e processados para sequenciamento de RNA de célula única. Observe que a presença do alelo Cre no saco vitelino não afeta o tamanho das faixas de flox, pois o Cre usado (Mesp1cre) não é expresso no saco vitelino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Avaliação da qualidade celular e viabilidade dos núcleos. (A) Imagens representativas das condições de viabilidade celular ótimas e subótimas de embriões E7.5. (B) Imagens representativas das condições de viabilidade de núcleos ótimos e subótimos de embriões E8 (C) Esquema de solução de problemas indicando soluções potenciais para ajudar a aumentar a viabilidade das células antes de iniciar a partição de uma única célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongo E7. (A) Traço representativo da distribuição do tamanho do fragmento para bibliotecas de sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongo E7 para condições subótimas e ótimas de viabilidade celular, com o pico principal próximo a 400-500 pb. Observe que os traços são semelhantes entre essas condições, indicando que a viabilidade da célula não afeta os controles de qualidade da biblioteca. (B) Análise dos resultados do sequenciamento de RNA de célula única para embriões de camundongos E7 sob condições subótimas e ótimas, mostrando a recuperação do alvo observado, classificação do código de barras e agrupamento de tipos de células por meio de distribuição uniforme de aproximação e projeção múltipla (UMAP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tampão de lise
Nome do reagenteConcentração de AçõesConcentração FinalVolume Total 1 mL
Tris-HCL (Ph7)1 milhão10 mM10 μL
NaCl5 M10 mM2 μL
MgCl20,1 m3 mM3 μL
Interpolação-2020%0.10%5 μL
Não diedt P4010%0.10%10 μL
Digitonina5%0.01%2 μL
TDT1 milhão1 mM1 μL
Inibidor de RNase40 U/μL1 U/μL25 μL
Água livre de nuclease----924 μL
Tampão de lavagem
Nome do reagenteConcentração de AçõesConcentração FinalVolume Total 1 mL
BSA na PBS10%1%100 μL
PBS----900 μL

Tabela 1: Tampão de lise de isolamento de núcleos e composição do tampão de lavagem.

Discussão

Um pipeline robusto é apresentado neste artigo para a obtenção de suspensões unicelulares e de núcleos de alta qualidade a partir de embriões de camundongos gastrulados, especificamente projetados para facilitar estudos sobre mecanismos de especificação de destino celular no desenvolvimento inicial. Este método aborda uma lacuna crucial no campo da gastrulação, otimizando a análise de embriões que requerem genótipos, como genes sexuais ou somáticos. Ao utilizar modelos de camundongos com mutação genética e empregar sequenciamento de célula única de alta resolução em embriões inteiros de camundongos, esse pipeline pode melhorar ainda mais a compreensão dos perfis de expressão gênica da gástrula inicial do camundongo. Este método demonstra a viabilidade de usar um modelo de camundongo de mutação genética por um sistema de Cre recombinase para obter células e núcleos de alta qualidade em pontos iniciais de desenvolvimento para ômicas de célula única. Esse método evoluiu por meio de várias tentativas, durante as quais as amostras não atenderam aos padrões de qualidade exigidos para a preparação e sequenciamento da biblioteca. A metodologia explicada gera células/núcleos suficientes a partir de embriões menores que E8 por meio da otimização de três etapas críticas: (1) gestações sincronizadas para aumentar o número de embriões, (2) genotipagem no mesmo dia para evitar congelamento/descongelamento e (3) avaliação da viabilidade celular/núcleos para evitar o sequenciamento de células moribundas. Este protocolo fornece resultados bem-sucedidos com RNASeq de célula única, mas as suspensões de células ou núcleos obtidas neste protocolo podem ser processadas em outras plataformas de sequenciamento, onde a viabilidade celular é o fator limitante, como smart-seq, drop-seq e cel-seq16.

No embrião E7, o número de células pode variar dependendo da cepa e do genótipo mutante. Normalmente, um embrião E7 pode variar de centenas a alguns milhares de células, e obter embriões com o genótipo desejado é um desafio, com apenas 1 ou 2 embriões por mãe grávida atendendo aos critérios. Este protocolo permite a captura de cerca de 300 células viáveis por embrião E7 para análise de célula única. As tentativas de aumentar o tamanho do pool de embriões congelando embriões de mães prenhes em dias diferentes não tiveram sucesso, pois a viabilidade celular foi severamente comprometida após o descongelamento, mesmo com a adição de agentes criopreservadores. Para enfrentar esse desafio, a estratégia de melhoramento e sincronização de fêmeas prenhes foi otimizada. Para aumentar as chances de múltiplos isolamentos, recomenda-se o uso de camundongos fêmeas que deram à luz 1-2 vezes antes da reprodução para isolamento, pois são mais propensos a ter ninhadas maiores. Monitorar o ciclo estral da fêmea é crucial; O acasalamento é mais provável de ocorrer durante os estágios de proestro e estro. Se surgirem dificuldades de reprodução, trocar os parceiros de reprodução após quatro dias também ajudará se nenhum plugue for produzido.

É importante notar que esse método tem uma limitação: ele se baseia em plugues observados e, mesmo que um plugue seja observado, não garante a gravidez, mas apenas indica atividade sexual. Portanto, aumentar o número de plugues observados em um dia aumentará a probabilidade de ter mais de uma mãe prenhe em um dia e genótipos mais positivos. Este protocolo demonstrou a viabilidade do uso de estágios embrionários variando de E7 a E7.75 como prova de conceito durante a gastrulação. No entanto, esse pipeline pode ser aplicado de embriões E6.5 a E8. Para embriões E6.5, recomenda-se aumentar o número de gestações sincronizadas para obter pelo menos 7 embriões com o genótipo desejado para agrupar. Em vez disso, para os embriões E8, aumente a quantidade de tripsina usada para dissociar cada embrião para ~ 40 μL em vez de 20 μL. O objetivo é obter uma suspensão de células/núcleos em uma faixa de concentração de 700-1200 células por μl antes de prosseguir com a partição.

Ter uma boa viabilidade celular é essencial para o sucesso do sequenciamento de uma única célula. No design do chip microfluídico fornecido pelos fabricantes, as células individuais são particionadas em esferas de gel em emulsão (GEMs) dentro de um chip contendo contas de gel com código de barras conhecidas11. No entanto, uma limitação notável desse processo é que células únicas de alta e baixa qualidade podem ser particionadas. Mesmo com um número adequado de células vivas (ou seja, 1000 células/μL), se a viabilidade da suspensão for baixa (ou seja, 1000 células vivas e 1000 células mortas, resultando em 50% de viabilidade), o experimento de sequenciamento provavelmente falhará. Para obter os melhores resultados, recomenda-se buscar uma viabilidade em torno de 90%. Se a viabilidade celular cair entre cerca de 60% e 89%, medidas específicas podem ser tomadas para aumentar a viabilidade do experimento. No entanto, se a viabilidade celular for inferior a 60%, é fortemente desaconselhado continuar com o experimento. A razão para isso é que as células moribundas serão 'capturadas' no gel de particionamento, e a preparação subsequente da biblioteca e os controles de qualidade passarão sem problemas perceptíveis. No entanto, o experimento de sequenciamento real pode falhar completamente, já que a maioria das leituras de sequenciamento mapeará genes mitocondriais, ribossômicos ou de apoptose, indicando sinais de baixa viabilidade celular desde o início. Os dados apresentados neste artigo ilustram um pipeline para sequenciamento de célula única de embriões de camundongos gastrulados com células de alta qualidade. Esta metodologia pode ser aplicada para a compreensão de muitos modelos diferentes de camundongos com mutações genéticas durante o desenvolvimento.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Núcleo de Genômica do Fox Chase Cancer Center e aos membros do laboratório Dr. Johnathan Whetstine Zach Gray, Madison Honer e Benjamin Ferman pelo suporte técnico para os experimentos de sequenciamento. Reconhecemos os membros do laboratório do Dr. Estaras e Alex Morris, um estudante de pós-graduação rotativo que contribuiu para a análise inicial dos estudos de célula única. Este trabalho é financiado pelas bolsas do NIH R01HD106969 e R56HL163146 para Conchi Estaras. Além disso, Elizabeth Abraham foi apoiada pela bolsa de treinamento T32 5T32HL091804-12.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri de 10 cmGenesee Scientific25-202
1000 µ Ponta de Barreira de Alcance LGenesee Scientific23-430
20 µ Ponta de Barreira de Alcance LGenesee Scientific24-404
300 µ Ponta de Barreira de Alcance LGenesee Scientific24-415
37 µ m Filtro reversível, pequenacélula-tronco27215
placa de Petri de 6 cmGenesee Scientific25-260
Tubos de PCR de 8 tirasGenesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Banho SecoGenesee31-437
Microcentrífuga Refrigerada Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK HermleGenesee33-759R
Albumina de Soro Bovino (BSA)Controlador de Cromo Sigma-AldrichA2153
10XPN-1000127
Kits de Reagentes de Célula Única 3' Chromium Next GEM v3.110XPN-1000269
Contador de Células Automatizado Countess 3Invitrogen
Countess Cell Couning Chamber SlidesInvitrogenC10283
D1000 ReagentesAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR saco vitelinoViagen201-Y
Dithiothreitol ( DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF FórcepsFine Science Tools11252-00
EtanolKoptecV1401
EVOS M7000 Sistema de ImagemInvitrogenAMF7000
Tesoura Fina - SharpFine Science Tools14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
Gråefe FórcepsFine Science Tools11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp TermocicladorApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagentes (100 Ciclos) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
Microscópio Estéreo Nikon SMZ 1000Nikon
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
Água Livre de NucleaseGenClone25-511
Tubo Óptico 8x Tira (401428)Agilent401428
Tampa do Tubo Óptico 8x Tira (401425)Agilent401425
Poseidon 31-511, Microcentrífuga HS24, com rotor de 24 x 1,5/2,0 mL, 1 Centrífuga/UnidadeGenesee31-511
Proteinase KKits de Ensaio de Quantificação Sigma-AldrichP6556
Qubit dsDNAInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
Inibidor de RNaseFisher Scientific12-141-368
Padrão Padrão FórcepsFine Science Tools11000-12
Estação de Fita Dicas de CarregamentoAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)Qualidade Biológica351-007-101
Trypan Mancha Azul 0.4%Theromo Fisher ScientificT10282
Tryple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Misturador de vórtice IKA MS3 com adaptador de placa de amostra de 96 poçosIKA3617000
AMQAX2000

Referências

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  3. Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
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  5. Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617(2020).
  6. Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
  7. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
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