Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.
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Artigo de método
Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na última década, as abordagens de célula única tornaram-se o padrão-ouro para estudar a dinâmica da expressão gênica, a heterogeneidade celular e os estados celulares nas amostras. Antes dos avanços de uma única célula, a viabilidade de capturar a paisagem celular dinâmica e as transições celulares rápidas durante o desenvolvimento inicial era limitada. Neste artigo, um pipeline robusto foi projetado para realizar análises de células únicas e núcleos em embriões de camundongos do dia embrionário E6.5 a E8, correspondendo ao início e conclusão da gastrulação. A gastrulação é um processo fundamental durante o desenvolvimento que estabelece as três camadas germinativas: mesoderma, ectoderme e endoderme, que são essenciais para a organogênese. Extensa literatura está disponível sobre ômicas unicelulares aplicadas a embriões perigastrulantes do tipo selvagem. No entanto, a análise de células únicas de embriões mutantes ainda é escassa e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS. Isso se deve em parte às restrições técnicas associadas à necessidade de genotipagem, gestações cronometradas, contagem de embriões com genótipos desejados por gravidez e número de células por embrião nesses estágios. Aqui, é apresentada uma metodologia projetada para superar essas limitações. Este método estabelece diretrizes de reprodução e gravidez programada para obter uma maior chance de gestações sincronizadas com os genótipos desejados. As etapas de otimização no processo de isolamento do embrião, juntamente com um protocolo de genotipagem no mesmo dia (3 h), permitem que a célula única baseada em microgotículas seja realizada no mesmo dia, garantindo a alta viabilidade das células e resultados robustos. Este método inclui ainda diretrizes para isolamentos ideais de núcleos de embriões. Assim, essas abordagens aumentam a viabilidade de abordagens unicelulares de embriões mutantes no estágio de gastrulação. Prevemos que este método facilitará a análise de como as mutações moldam a paisagem celular da gástrula.
Introdução
A gastrulação é um processo fundamental necessário para o desenvolvimento normal. Esse processo rápido e dinâmico ocorre quando as células pluripotentes fazem a transição para precursores específicos da linhagem que definem como os órgãos se formam. Durante anos, a gastrulação foi definida por muito tempo como a formação de três populações amplamente homogêneas: mesoderma, ectoderma e endoderme. No entanto, tecnologias de alta resolução e um número emergente de modelos de células-tronco embrionárias 1,2 revelam heterogeneidade sem precedentes entre as camadas germinativas iniciais 3,4. Isso sugere que ainda há muito a ser descoberto sobre os mecanismos que regulam as distintas populações de células da gástrula. O desenvolvimento embrionário de camundongos tem sido um dos melhores modelos para estudar as decisões iniciais do destino celular durante a gastrulação 3,5. A gastrulação em camundongos é rápida, pois todo o processo de gastrulação ocorre em 48 h, do dia embrionário E6.5 a E85.
Avanços recentes em tecnologias de célula única permitiram o mapeamento detalhado do desenvolvimento embrionário de camundongos do tipo selvagem, fornecendo uma visão abrangente das paisagens celulares e moleculares dos embriões durante a gastrulação 3,4,6,7,8. No entanto, a análise de embriões mutantes nesses estágios é menos comum e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS 9,10. A escassa literatura reflete os desafios técnicos associados à manipulação e preparação unicelular de embriões gastrulantes que requerem genotipagem. Capturar o processo dinâmico de gastrulação pode representar desafios devido à sua natureza rápida, especialmente para a compreensão de embriões mutantes. O tempo e a sincronização das gestações são essenciais, pois mesmo pequenas diferenças entre as gestações programadas podem ser mal interpretadas como um fenótipo de desenvolvimento resultante do gene mutante. Isso se torna particularmente importante quando o gene mutante influencia o processo de gastrulação13,14. Neste estudo, são estabelecidas diretrizes para a obtenção de gestações sincronizadas por meio da visualização de tampões vaginais (ou seja, a massa de líquido seminal coagulado formada na vagina da fêmea após o acasalamento). Além disso, uma estratégia é projetada para obter dados robustos de células únicas de embriões gastrulantes mutantes de E6.5 a E8. Esta estratégia é concebida para superar as restrições associadas ao baixo número de embriões com o genótipo desejado por gravidez e à diminuição da viabilidade causada pelo congelamento e descongelamento de embriões ou células.
Este artigo descreve uma metodologia otimizada desde o estabelecimento de gestações programadas por meio de tampões vaginais até o sequenciamento final de células/núcleos únicos. Este método explica como aumentar o número de gestações sincronizadas para obter um número maior de embriões com o genótipo desejado, isolamentos de células/núcleos para melhorar a viabilidade das células e um protocolo de genotipagem no mesmo dia. Este manuscrito também descreve o processo de isolamento embrionário em diferentes momentos de gastrulação. A metodologia ajuda a aumentar o número de células/núcleos embrionários viáveis finais para sequenciamento, garantindo dados de sequenciamento de alta qualidade. Portanto, este método abrirá as portas para estudos de células únicas de embriões gastrulantes que requerem genotipagem.
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Protocolo
Este protocolo e todos os experimentos com animais descritos foram formalmente aprovados e de acordo com as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Temple University, que segue as diretrizes internacionais da Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório. Todos os camundongos descritos estavam na cepa de fundo C57 / BL6N. Não foram observadas preocupações com a saúde animal nesses estudos.
1. Colônia de reprodução e gestações programadas
- Cronometre as gestações pela visualização de um tampão vaginal. O meio-dia do dia do plugue é considerado E0.5.
- Ratos domésticos em gaiolas com material de cama contendo cama de madeira lascada e material de nidificação de papel.
- Cada gaiola contém ração de rato, água doce e um item de enriquecimento (por exemplo, túnel e material de nidificação). Rastreie e colete informações da colônia diariamente durante a reprodução cronometrada.
- Registre todas as informações, como a idade do camundongo, o número de gestações que uma fêmea teve, o número de plugues colocados por um camundongo macho e o estágio do estro (Figura 2) para camundongos fêmeas.
NOTA: As fêmeas que já deram à luz 1-2 vezes terão ninhadas maiores em gestações futuras.
- Antes de iniciar a gravidez cronometrada, aloje o rato macho sozinho em uma gaiola 1 semana antes da reprodução. Durante a semana de iniciação da reprodução, introduza pelo menos 1 fêmea por macho na gaiola.
NOTA: Dependendo do protocolo animal aprovado, adicionar 2-3 fêmeas em uma gaiola de reprodução pode ser permitido e é preferível para aumentar a geração de plugues. - Configure pelo menos 4 trios reprodutores (2 camundongos fêmeas para 1 macho) para aumentar as chances de gestações sincronizadas nas gaiolas (também conhecido como vários plugues no mesmo dia). Isso aumentará o número de embriões isolados no mesmo estágio de desenvolvimento.
- Organize o acasalamento ideal à tarde ou à noite antes das 17h, e as fêmeas são colocadas na gaiola do macho ou vice-versa. Se a reprodução não ocorrer em 4-5 dias, considere trocar de parceiro de acasalamento a cada dois dias.
NOTA: Se não for possível verificar se há um tampão vaginal na manhã seguinte, separe o casal reprodutor na noite anterior (ou seja, fim de semana/feriados). - Verifique se há tampões vaginais todos os dias no início da manhã; antes das 9h é preferível.
- Para verificar se há tampões vaginais, levante suavemente as ratas pela base da cauda e observe a abertura vaginal. Procure uma massa gelatinosa branca ou creme. Muitas vezes, o tampão vaginal pode ser óbvio, mas se não estiver claro, pegue uma pinça e sonde suavemente a abertura vaginal. Considere apenas os plugues mais aparentes para isolamento. Consulte a Figura 2C.
NOTA: É fundamental verificar se há tampões vaginais o mais cedo possível pela manhã para evitar perder uma possível gravidez. Os tampões podem cair ou dissolver-se após 12 h.
NOTA: Mesmo que um plugue seja observado, isso não garante que a rata esteja grávida. Se um tampão parcial ou nenhum tampão for observado, mas houver vermelhidão perto da abertura vaginal dos camundongos fêmeas, não considere essas fêmeas para isolamento, pois há uma chance menos provável de o tampão grudar. A probabilidade de gravidez após o acasalamento varia entre as linhagens de camundongos e depende da fase do ciclo estral durante o acasalamento (Figura 2).
- Para verificar se há tampões vaginais, levante suavemente as ratas pela base da cauda e observe a abertura vaginal. Procure uma massa gelatinosa branca ou creme. Muitas vezes, o tampão vaginal pode ser óbvio, mas se não estiver claro, pegue uma pinça e sonde suavemente a abertura vaginal. Considere apenas os plugues mais aparentes para isolamento. Consulte a Figura 2C.
- Assim que um tampão vaginal for observado, registre o dia. O meio-dia do mesmo dia em que o tampão vaginal é observado é considerado E0,5. Separe os camundongos fêmeas da gaiola de reprodução e isole os embriões dependendo do estágio de gastrulação desejado.
NOTA: Este método não fornece um tempo preciso para o acasalamento. Convencionalmente, presume-se que o acasalamento ocorra por volta da meia-noite da noite anterior. Consequentemente, os embriões são considerados com meio dia de idade (E0,5) ao meio-dia do dia em que o tampão vaginal é observado.
2. Isolamento de embriões de camundongos durante a gastrulação
- Antes de iniciar o isolamento do embrião, prepare todos os reagentes e equipamentos necessários.
- Limpe bem a área com etanol 70%. Certifique-se de que todas as ferramentas de dissecação (pinças e tesouras) sejam lavadas e esterilizadas. Obtenha 5 mL estéreis de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/10% de soro fetal bovino (FBS) e 20 mL de DPBS-/- e coloque no gelo.
- Realize todos os isolamentos usando um estereomicroscópio com platina de luz transmitida e câmera para auxiliar na fenotipagem macroscópica do desenvolvimento.
- Eutanasiar a mãe de camundongos grávidas e iniciar o isolamento imediatamente.
- Coloque a barragem prenhe em uma câmara de CO2 com a taxa de fluxo de CO2 ajustada para deslocar 20% do volume da gaiola por minuto. Monitore o camundongo de perto e confirme a morte observando a ausência de movimentos respiratórios.
- Mantenha o fluxo de CO2 por mais 2 minutos após a ausência de movimentos respiratórios. Confirme a eutanásia realizando uma luxação cervical.
- Posicione os mouses em uma posição normal em uma superfície firme e plana. Em seguida, com o polegar e o indicador de uma mão contra a nuca na base do crânio, empurre para frente e para baixo enquanto puxa para trás com a outra mão segurando a base da cauda.
- Verifique a eficácia da luxação sentindo a separação das vértebras cervicais. Quando a medula espinhal é cortada, um espaço de 2-4 mm será palpável entre os côndilos occipitais e a primeira vértebra cervical.
NOTA: Não sacrifique várias mães grávidas de uma só vez, pois a viabilidade celular será afetada. O isofluorano pode ser usado como agente anestésico alternativo se aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) ou órgão equivalente.
- Coloque a mãe grávida de costas e esterilize a área próxima à abertura vaginal com etanol.
- Com tesoura de dissecção, levantar a dobra cutânea próxima à abertura vaginal e fazer um pequeno corte em forma de V, revelando lentamente o útero da mãe grávida (Figura 3 [seta amarela]).
- Disseque o corno uterino da mãe grávida segurando uma extremidade dele com uma pinça e cortando-o, certificando-se de remover o colo do útero. Coloque o corno uterino em uma placa de Petri de 10 cm contendo DPBS-/- em gelo (Figura 3).
NOTA: Dependendo do estágio de isolamento do embrião, o útero se assemelhará a locais de implantação menores ou maiores (ou seja, 'pérolas' em um cordão).
- Com tesouras de dissecação, corte cada local de implantação ('pérolas') contendo os inchaços deciduais no interior e coloque em DPBS-/- fresco em uma placa de Petri de 6 cm sobre gelo (Figura 3).
NOTA: Uma mãe grávida média terá cerca de 6-8 embriões implantados. - Pegue um local de implantação e coloque-o em uma nova placa de Petri de 6 cm em cima do estágio de estereomicroscópio e adicione 500 μL de DPBS-/- em cima dele. Ajuste o foco do microscópio e a fonte de luz (Figura 3).
NOTA: Dependendo do tamanho do local de implantação, a quantidade de DPBS pode variar; o objetivo é ter DPBS suficiente para que o local de implantação fique submerso. - Usando uma pinça de dissecção de ponta fina, remova o músculo uterino do local de implantação. Segure o local de implantação com um conjunto de pinças em uma mão e insira lentamente outro par de pinças com a outra mão na extremidade do local de implantação cortado do corno uterino, revelando lentamente o inchaço da decídua (Figura 3).
NOTA: Não puxe ou puxe com muita força a superfície uterina, pois isso pode levar à ruptura do inchaço decidual ou mesmo à lise do embrião. - Depois que o inchaço decidual for isolado, prossiga para revelar o embrião.
- Segure a extremidade anti-mesometrial do inchaço decidual com um par de pinças e, com o outro par, faça lentamente um corte horizontal de cerca de 1/4 do tamanho do inchaço decidual da extremidade mesometrial (ou seja, geralmente a extremidade mais pontiaguda do inchaço decidual).
- Agora, com as duas pinças, empurre lentamente a partir da extremidade anti-mesometrial do inchaço decidual e o embrião sairá da extremidade mesometrial recém-cortada (Figura 3).
NOTA: Não rasgue o inchaço decidual, pois isso quebrará o embrião. Se necessário, faça cortes menores ao longo da extremidade mesometrial do inchaço decidual.
- Assim que o embrião for revelado, remova todos os tecidos extraembrionários presos.
- O saco endodérmico parietal e o cone ectoplacentário podem sair espontaneamente do embrião durante o processo de revelação, mas se não, use um par de fórceps e remova-os junto com qualquer sangue materno associado. Em seguida, usando duas pinças, segure o embrião com um par e retire lentamente o saco vitelino visceral do embrião usando o outro conjunto.
- Usando uma pipeta P20, coloque o saco vitelino com no máximo 10 μL de DPBS-/- do prato em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) de 8 tiras no gelo, pois ele será usado para genotipagem no mesmo dia.
NOTA: É fundamental que a amostra do saco vitelino não esteja contaminada com tecido da mãe grávida. A contaminação pode levar à atribuição incorreta do genótipo do embrião.
- Tire fotos de campo brilhante de embriões recém-isolados para garantir que o estadiamento dos irmãos de ninhada seja semelhante. Com uma pipeta P200, pipetar lentamente o embrião com 50 μL de DMEM/10% FBS e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL no gelo. Deixe os embriões permanecerem no gelo até que os genótipos sejam confirmados.
NOTA: Os embriões foram mantidos em gelo por 3-4 h sem degradação óbvia, mas não excedem esse tempo, pois ocorrerá uma diminuição na viabilidade celular. Rotule os embriões e tubos de genotipagem de acordo. A obtenção de imagens de campo claro é incentivada para identificar e anotar diferenças fenotípicas grosseiras entre os embriões. - Repita essas etapas para todos os inchaços deciduais restantes. Limpe todas as ferramentas de dissecação e use novos plásticos para cada isolamento para garantir que não haja contaminação de isolamentos anteriores.
NOTA: Certifique-se de que os procedimentos de dissecção sejam limitados a 1 h a partir do momento da coleta do local de implantação da mãe grávida. - Prossiga para isolar os embriões da próxima mãe grávida (se várias gestações sincronizadas foram identificadas) antes de passar para a etapa de genotipagem no mesmo dia.
3. Genotipagem no mesmo dia (Figura 4)
- Digerir cada saco vitelino visceral num tubo de PCR de 8 tiras. Usando uma pipeta P20, adicione 19,3 μL de tampão de lise de DNA modelo de PCR e 0,7 μL de 0,2 μg/mL de proteinase K a cada amostra de saco vitelino.
- Vortex a amostra por 10 s e gire para baixo para posicionar as amostras no fundo do tubo usando uma mini centrífuga com um adaptador de tira a 1.000 x g por 10 s. Coloque o tubo de PCR de 8 tiras em um bloco de calor de 85 °C por 45 min e vórtice por 5 s a cada 5 min.
NOTA: É importante vortex amostras durante a digestão para maximizar a lise celular em 45 min. - Após 45 min, gire a tira do tubo para baixo usando uma mini centrífuga com um adaptador de tira a 1.000 x g por 10 s e prossiga com a PCR para identificação genética desejada. Para referência, é fornecido um protocolo de amostra para um sistema Cre-lox. A seguir está um exemplo de condições de PCR para genotipagem de Cre. Projete primers para amplificar as regiões de 5 'e 3' do local Cre alvo.
- Para realizar a reação de PCR para genotipagem de Cre, prepare uma mistura mestre de PCR por tubo de PCR de 8 tiras para cada saco vitelino contendo 10 μL de mistura de Taq DNA polimerase, 0,5 μL de 0,5 μM de primer Cre direto, 0,5 μL de 0,5 μM de primer Cre reverso, 5 μL de água certificada por PCR e 4 μL de DNA genômico do saco vitelino.
NOTA: Se estiver usando um protocolo otimizado para genotipagem de cauda de camundongo, adicione o dobro da quantidade de DNA normalmente utilizada para resultados mais limpos. - Uma vez que a mistura principal de PCR tenha sido feita, execute o programa de amplificação do ciclo térmico de PCR. Para a genotipagem de Cre, o ciclo é o seguinte: (1) 95 °C durante 3 min, (2) 95 °C durante 30 s, (3) 55 °C durante 30 s, (4) 72 °C durante 30 s, passo repetido 2-4 durante 34 ciclos, (5) 72 °C durante 10 min, (6) 4 °C hold. Execute os produtos de PCR em um gel de agarose a 1% para tirar conclusões de genotipagem.
NOTA: Se mais de um PCR for necessário para identificação genética, execute as reações de PCR simultaneamente para otimizar o tempo. Para acelerar o processo, prepare o gel de agarose com um dia de antecedência no dia do experimento e armazene-o a 4 ° C durante a noite. Não considerar amostras sem genótipos claros. Leve em consideração o genótipo e o estágio de desenvolvimento para as amostras, pois os irmãos de ninhada podem estar em diferentes estágios de gastrulação e potencialmente distorcer os resultados. Ao realizar a genotipagem dos alelos LoxP, as bandas de PCR esperadas no gel podem variar dependendo do Cre-driver utilizado. Por exemplo, se o driver Cre for expresso no saco vitelino visceral, a banda Loxp aparecerá deslocada nos embriões Cre-positivos (Cre+), em comparação com os Cre-negativos (Cre-). No entanto, se o Cre não for expresso no saco vitelino visceral, o tamanho da banda Loxp será o mesmo tamanho nos embriões Cre+ e Cre- (ou seja, os alelos Loxp não serão floxed na linhagem do saco vitelino). Um embrião portador de um alelo Cre+ e dois alelos Loxp é considerado um embrião KO condicional. No entanto, para confirmar a deleção do gene floxed, recomenda-se realizar uma confirmação do nocaute do gene nas células que expressam o driver Cre, seja repetindo o protocolo de genotipagem ou por análise de qPCR dos níveis de mRNA do gene floxed (Figura 4D, E). - Conservar as restantes amostras de saco vitelino digerido no congelador a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
4. Dissociação celular de embriões e viabilidade celular
- Uma vez confirmados os genótipos, pegue uma pipeta P200 e pipete 50 μL de DMEM/10% FBS. Agrupe embriões com o mesmo genótipo em um novo tubo de 1,5 mL e coloque o tubo no gelo.
NOTA: Não prossiga com o experimento se não houver pelo menos 5 embriões por grupo (E7-E7.5) ou 3 (E7.75-E8), pois a contagem de células e a viabilidade diminuirão tremendamente. - Depois que os embriões forem agrupados com base nos genótipos, permita que eles se depositem no fundo do tubo. Lave os embriões agrupados adicionando 50 μL de DPBS-/- e espere que os embriões assentem antes de remover o máximo possível de DPBS-/- sem remover os embriões do tubo. Repita esta etapa duas vezes.
NOTA: Segurar o tubo de 1,5 mL contra uma fonte de luz ou em direção a uma janela facilitará a visualização dos embriões que se acomodam no fundo do tubo. - Adicionar 100 μL de tripsina aos embriões agrupados e incubar a 37 °C em um bloco de calor por 5 min. Agite suavemente os tubos de 1,5 mL a cada 30 s para ajudar as células a se dissociarem.
NOTA: Não use vórtice ou pipeta durante o processo de tripsinização, pois danifica as células. Se mais de 5 embriões (E7-E7.5) ou 3 embriões (E7.75-E8) forem agrupados, faça a digestão da tripsina em outro tubo com uma quantidade equivalente de tripsina (~ 20 μL por 1 embrião). Use ~ 20 μL de tripsina por embrião (E6.5-E7.5), 35 μL por embrião (E7.75) e 40 μL para embrião (E8). - Após 5 min, neutralizar a tripsina com 300 μL de DMEM/10% de FBS. Centrifugue os embriões agrupados a 100 x g por 4 min em temperatura ambiente (RT). Após a centrifugação, um pequeno pellet aparecerá para todas as amostras. Ressuspenda os pellets em 40 μL de DMEM/10% FBS e coloque-os no gelo.
NOTA: O tamanho do pellet varia de acordo com o número de embriões agrupados. É possível que o pellet não esteja visível, mas prossiga para a próxima etapa. A quantidade de DMEM/10% FBS necessária para neutralizar a tripsina dependerá da quantidade de tripsina adicionada. Adicione 3 vezes a quantidade de DMEM/10% à quantidade de tripsina. - Determinar a concentração das células ressuspensas (40 μL) utilizando um contador de células automático. Misture 5 μL de células com 5 μL de azul de tripano em um novo tubo de 1,5 mL. Pipetar bem a mistura e pipetar sobre uma lâmina para determinar o número de células e a viabilidade celular. A concentração ideal de células é de 700-1200 células/μL e a viabilidade celular é de 90% ou mais.
NOTA: Se a concentração for inferior a 200 células/μL e a viabilidade for inferior a 50%, não continue o experimento. Se a concentração celular for muito alta, dilua a suspensão celular e reconte as células novamente. Se forem observados aglomerados de células, use um filtro de células para garantir uma suspensão unicelular. - Prossiga para o particionamento de célula única usando um chip microfluídico e siga o protocolo dos fabricantes de chips microfluídicos11.
5. Embriões de camundongo de isolamento de núcleos (opção para pontos de tempo embrionários maiores de E8 em diante)
- Prepare a lise fresca e os tampões de lavagem descritos na Tabela 1 e coloque-os no gelo.
NOTA: O isolamento dos núcleos pode ser realizado em amostras frescas ou congeladas. Se as amostras estiverem congeladas, deixe-as descongelar por 2-5 min no gelo. - Antes de iniciar o experimento, confirme todos os genótipos e agrupe apenas embriões com genótipos claros.
- Usando uma pipeta P200, adicione 50 μL de tampão de lise de núcleos aos embriões agrupados em um tubo de 1,5 mL, visando um mínimo de 3 embriões por grupo mutante. Deixe as amostras no gelo com tampão de lise por 5 min e vórtice a cada 30 s.
- Após 5 min de incubação, centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta P200, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 50 μL de tampão de lavagem. Uma vez ressuspenso, centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender a 40 μL de DPBS-/-. Conte as células usando um contador de células automatizado. Misture 5 μL de núcleos com 5 μL de azul de tripano em um novo tubo de 1,5 mL. Pipete bem a mistura e coloque-a em uma lâmina para determinar o número e a viabilidade das células.
NOTA: A membrana nuclear é permeável ao azul de tripano; portanto, a coloração de núcleos isolados é positiva para azul de tripano. Em um contador de células automatizado, a porcentagem de células mortas é usada para estimar a porcentagem de núcleos isolados (Figura 5A). - Se a porcentagem de núcleos intactos for superior a 90% (o que significa que pelo menos 90% dos núcleos estão corados com azul de tripano e exibem uma forma arredondada e aspecto túrgido; consulte a Figura 5B, C), prossiga para utilizar um chip microfluídico e siga o protocolo dos fabricantes de chips microfluídicos11.
6. Partição de célula única (incluindo amplificação de cDNA e construção de bibliotecas)
- Prossiga imediatamente com o protocolo de sequenciamento de RNA de célula única seguindo o protocolo11 do fabricante do chip microfluídico para obter os melhores resultados. Defina a recuperação da célula-alvo para 6000 células ou mais.
7. Sequenciamento
- Depois que as bibliotecas forem construídas, meça a distribuição do tamanho do fragmento e as concentrações das amostras usando um analisador de eletroforese automatizado.
NOTA: As distribuições ideais do tamanho do fragmento estão entre 300-1000 pb. - As amostras estão prontas para serem carregadas no sequenciador. Agrupe bibliotecas de diferentes exemplos juntos. A concentração final de carga das bibliotecas agrupadas é de 750 pM num volume total de 24 μL. Carregar as bibliotecas agrupadas no cartucho de reagentes, seguindo o protocolo do fabricante da sequenciação12.
- Sequencie as bibliotecas carregadas na célula de fluxo pré-montada e no cartucho de acordo com a profundidade de sequenciamento desejada com indexação dupla de extremidade de par. As leituras de sequenciamento seguidas ao protocolo descrito pelos fabricantes de chips microfluídicos são as seguintes11: Leitura 1: 28 ciclos, Índice i7: 10 ciclos, Índice i5: 10 ciclos e Leitura 2: 90 ciclos. Após a conclusão do sequenciamento, os dados passam por análise de bioinformática.
- Use métodos de bioinformática para realizar controles de qualidade. Isso inclui avaliar o número de células sequenciadas, leituras por célula e número de genes mapeados por célula.
NOTA: Para obter os melhores resultados, o número de células sequenciadas é de pelo menos 80% das células-alvo. Recomenda-se que o número de leituras por célula seja de pelo menos 30.000 e o número de genes detectados superior a 3000 (para amostras de camundongos).
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Resultados
A metodologia projetada neste artigo destina-se especificamente a melhorar a preparação de amostras de embriões para ômicas de células únicas de E6.5 a E8. Esse pipeline robusto consiste em cinco etapas principais: gestações cronometradas sincronizadas, isolamentos de embriões, genotipagem no mesmo dia, dissociação celular e avaliação da viabilidade celular (Figura 1A). Embora os dados apresentados se concentrem em pontos de tempo de E7 a E7.5, eles podem ser aplicados a embriões até E8 (
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Discussão
Um pipeline robusto é apresentado neste artigo para a obtenção de suspensões unicelulares e de núcleos de alta qualidade a partir de embriões de camundongos gastrulados, especificamente projetados para facilitar estudos sobre mecanismos de especificação de destino celular no desenvolvimento inicial. Este método aborda uma lacuna crucial no campo da gastrulação, otimizando a análise de embriões que requerem genótipos, como genes sexuais ou somáticos. Ao utilizar modelos de camundongos com mutação genética e empregar seque...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Núcleo de Genômica do Fox Chase Cancer Center e aos membros do laboratório Dr. Johnathan Whetstine Zach Gray, Madison Honer e Benjamin Ferman pelo suporte técnico para os experimentos de sequenciamento. Reconhecemos os membros do laboratório do Dr. Estaras e Alex Morris, um estudante de pós-graduação rotativo que contribuiu para a análise inicial dos estudos de célula única. Este trabalho é financiado pelas bolsas do NIH R01HD106969 e R56HL163146 para Conchi Estaras. Além disso, Elizabeth Abraham foi apoiada pela bolsa de treinamento T32 5T32HL091804-12.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Petri de 10 cm | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µ Ponta de Barreira de Alcance L | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µ Ponta de Barreira de Alcance L | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µ Ponta de Barreira de Alcance L | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µ m Filtro reversível, pequena | célula-tronco | 27215 | |
| placa de Petri de 6 cm | Genesee Scientific | 25-260 | |
| Tubos de PCR de 8 tiras | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Banho Seco | Genesee | 31-437 | |
| Microcentrífuga Refrigerada Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle | Genesee | 33-759R | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Controlador de Cromo Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 10X | PN-1000127 | ||
| Kits de Reagentes de Célula Única 3' Chromium Next GEM v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Contador de Células Automatizado Countess 3 | Invitrogen | ||
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagentes | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR saco vitelino | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol ( DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Fórceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Etanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Sistema de Imagem | Invitrogen | AMF7000 | |
| Tesoura Fina - Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Gråefe Fórceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Termociclador | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagentes (100 Ciclos) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Microscópio Estéreo Nikon SMZ 1000 | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Água Livre de Nuclease | GenClone | 25-511 | |
| Tubo Óptico 8x Tira (401428) | Agilent | 401428 | |
| Tampa do Tubo Óptico 8x Tira (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, Microcentrífuga HS24, com rotor de 24 x 1,5/2,0 mL, 1 Centrífuga/Unidade | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Kits de Ensaio de Quantificação Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| Inibidor de RNase | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Padrão Padrão Fórceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Estação de Fita Dicas de Carregamento | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Qualidade Biológica | 351-007-101 | |
| Trypan Mancha Azul 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Misturador de vórtice IKA MS3 com adaptador de placa de amostra de 96 poços | IKA | 3617000 |
Referências
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
- Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
- Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).
- Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617(2020).
- Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
- Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
- Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
- Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024).
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- Li, Q., et al. editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).
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