Gerando e analisando imagens histológicas de alto parâmetro com citometria de histofluxo

Resumo

Aqui está descrito um método que pode ser usado para obter imagens de cinco ou mais parâmetros fluorescentes por microscopia imunofluorescente. Um pipeline de análise para extrair células únicas dessas imagens e conduzir análises de células únicas por meio de estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo é delineado, o que pode identificar subconjuntos de células em seções de tecido.

Resumo

O uso da histologia para investigar a diversidade de células imunes em seções de tecido, como as derivadas do sistema nervoso central (SNC), é criticamente limitado pelo número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados de uma só vez. A maioria dos subconjuntos de células imunes foi definida usando citometria de fluxo usando combinações complexas de marcadores de proteínas, muitas vezes exigindo quatro ou mais parâmetros para serem identificados de forma conclusiva, o que está além das capacidades da maioria dos microscópios convencionais. Como a citometria de fluxo dissocia os tecidos e perde informações espaciais, há necessidade de técnicas que possam reter informações espaciais enquanto interrogam os papéis de tipos de células complexas. Essas questões são abordadas aqui criando um método para expandir o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados coletando os sinais de fluoróforos espectralmente sobrepostos e usando a separação espectral para separar os sinais de cada fluoróforo individual. Essas imagens são então processadas usando um pipeline de análise para obter imagens histológicas de alto parâmetro e extrair células únicas dessas imagens para que as propriedades fluorescentes exclusivas de cada célula possam ser analisadas em um nível de célula única. Usando estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo, as células podem ser perfiladas em subconjuntos e mapeadas de volta para as seções de histologia para não apenas quantificar sua abundância, mas também estabelecer como elas interagem com o ambiente do tecido. No geral, a simplicidade e o potencial do uso da citometria de histofluxo para estudar populações imunes complexas em seções de histologia são demonstradas.

Introdução

A inflamação impulsionada por células do sistema imunológico e células gliais pode contribuir para distúrbios crônicos do SNC, onde cada população pode promover a atividade da outra ^1,2,3. Compreender como o sistema imunológico interage com esses elementos do SNC para promover a inflamação do SNC é atualmente um grande tópico de interesse e tem sido muito facilitado por técnicas de alto parâmetro, como o sequenciamento de RNA de célula única. Por meio do sequenciamento de RNA de célula única, descobrimos que há uma extensa comunicação ocorrendo entre as células gliais e o sistema imunológico em vários distúrbios do SNC ^4,5,6. Entender como essas interações estão afetando esses distúrbios será crucial para elucidar a biologia dessas doenças.

Um problema com as análises de sequenciamento de célula única é que essas técnicas exigem que o tecido seja interrompido para obter células ou núcleos únicos, resultando em uma perda completa de informações espaciais. Saber onde uma célula existe em um tecido é fundamental para entender o papel da célula na condução da inflamação. Por exemplo, células imunes, como células B, podem se concentrar no SNC durante a neuroinflamação; no entanto, raramente entram no parênquima do SNC e, em vez disso, concentram-se nas barreiras do SNC⁷. Dada a sua localização, é improvável que essas células contribuam para a inflamação do SNC interagindo fisicamente com as células gliais no parênquima do SNC, sugerindo que quaisquer interações que possam estar tendo com as células gliais ocorreriam por meio de fatores secretados. Além disso, a patologia que ocorre nos distúrbios do SNC geralmente tem estrutura ^8,9 de modo que a localização de uma célula no tecido pode determinar criticamente se ela está contribuindo ativamente para o distúrbio ou se é um espectador. Assim, o uso da orientação espacial para avaliar o papel de uma célula na patologia é essencial.

O estudo de células no tecido geralmente é realizado usando imuno-histoquímica ou microscopia de imunofluorescência. Um problema com essas técnicas é que elas normalmente só podem gerar imagens de até quatro parâmetros simultaneamente. Esta é uma grande limitação para essas técnicas, pois sabemos por citometria de fluxo e análises de sequenciamento de RNA de célula única que muitas populações de células requerem dois ou mais parâmetros para sua identificação; Além disso, o número de parâmetros necessários normalmente aumenta ao procurar subconjuntos específicos de um tipo de célula¹⁰. Assim, é impraticável usar técnicas de imagem padrão para estudar como subconjuntos de células podem estar interagindo dentro de um tecido.

Esse problema foi parcialmente superado por meio de métodos mais recentes de alto parâmetro que podem reter informações espaciais, como sequenciamento espacial de RNA¹¹ e citometria de massa de imagem¹². Embora essas técnicas sejam valiosas, elas têm vários problemas, como não estarem amplamente disponíveis, reduzir os dados tridimensionais em duas dimensões e exigir uma experiência considerável para serem executadas. Outra técnica conhecida como coloração sequencial, em que os tecidos são corados com um conjunto de anticorpos seguido pela inativação do conjunto anterior de anticorpos antes da coloração com outro conjunto de anticorpos, pode atingir histologia de alto parâmetro sem a necessidade de equipamento especializado ou experiência 13,14,15. No entanto, a coloração sequencial pode ser extremamente trabalhosa e requer uma grande quantidade de tempo de microscopia, o que pode ser impraticável para laboratórios que não possuem um microscópio pessoal. Assim, há uma necessidade de técnicas que possam expandir o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados de uma só vez em microscópios amplamente disponíveis e em tempo hábil.

Uma vez que os dados de alto parâmetro tenham sido adquiridos, surge outro problema: é improvável que os métodos convencionais de análise de imagem analisem os dados com sucesso. Técnicas como contagem manual ou limiar só são viáveis se a análise consistir em um único parâmetro ou se vários marcadores tiverem a mesma localização onde apenas sinais sobrepostos são contados. Essa limitação torna a análise tradicional inadequada para trabalhar com conjuntos de dados de alto parâmetro. A análise bem-sucedida desses conjuntos de dados foi alcançada segmentando células únicas de imagens histológicas e, em seguida, conduzindo estratégias de bloqueio semelhantes à citometria de fluxo para identificar tipos de células^16,17. No entanto, outra questão que afeta essas análises é que elas funcionam apenas para conjuntos de dados em que todas as células de interesse estão fisicamente separadas umas das outras, pois essas técnicas não empregam métodos que possam separar com precisão as células que estão em contato físico. Assim, é necessário um método mais recente que possa realizar análises de células únicas em seções histológicas, mesmo que as células estejam em contato físico.

Neste artigo, é descrito um protocolo simples chamado citometria de histofluxo, que foi introduzido anteriormente¹⁸ , que expande o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados simultaneamente usando microscópios amplamente disponíveis. Este protocolo funciona colorindo tecidos com corantes espectralmente sobrepostos e, em seguida, usando compensação espectral para remover o sangramento de canais sobrepostos para obter manchas únicas claras. Para facilitar a análise de imagens histológicas de alto parâmetro, é descrito um pipeline de análise detalhado que extrai células únicas de seções de tecido com o objetivo de classificar células em populações distintas usando estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo. Este protocolo funciona em tecidos onde as células estão difusamente presentes e em tecidos onde as células estão compactadas, tornando esta técnica versátil para o estudo de tecidos como o SNC tanto na homeostase quanto na neuroinflamação. A citometria de histofluxo é, portanto, uma técnica útil para estudar interações entre tipos de células complexas que requerem vários marcadores celulares para definir as células, mantendo as informações espaciais.

Protocolo

Este protocolo não cobre a secção de tecidos para histologia; consulte Jain et ^al.18 ou¹⁹ para obter descrições de como seccionar tecidos para histologia. Este protocolo pode ser usado com qualquer tecido seccionado em lâminas de vidro. Este artigo utiliza linfonodos inguinais isolados de um animal imunizado, conforme descrito anteriormente¹⁸. O procedimento e o cronograma para este protocolo estão resumidos na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coloração de seções de tecido

NOTA: Além de corar os tecidos com todos os rótulos de anticorpos nos quais o pesquisador está interessado, o pesquisador também deve preparar controles de cor única (um para cada parâmetro fluorescente que se destina a ser usado) em lâminas de tecido adjacentes ou idênticas, em que cada controle de cor única é corado com os reagentes necessários para produzir o sinal de um parâmetro fluorescente.

1. Prepare Perm e tampão de bloqueio e Perm e tampão de coloração (consulte a Tabela 1 para a composição).
2. Descongele as seções de tecido em lâminas de vidro em temperatura ambiente e limpe a condensação com um pano. Use um marcador hidrofóbico para delinear a borda do(s) tecido(s) que precisa(m) ser corado(s) e deixe as marcas secarem.
3. Reidrate os tecidos embebendo as seções de tecido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 min. Sacuda o PBS e use um lenço para remover o excesso de PBS sem tocar diretamente no tecido.
4. Fixe os tecidos adicionando paraformaldeído (PFA) a 4% suficiente para cobrir completamente o tecido. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
   CUIDADO: O PFA pode ser tóxico e deve ser manuseado dentro de uma capela de exaustão.
   NOTA: Esta etapa é necessária apenas para tecido fresco congelado. Se o tecido já estiver fixado, ignore esta etapa. A fixação do PFA é descrita aqui, mas o tecido pode ser fixado usando outros métodos, dependendo das necessidades do experimento.
5. Lave os lenços em um banho PBS por 1 min com um balanço suave e, em seguida, remova a lâmina do banho. Substitua o PBS e repita a lavagem mais 3 vezes.
6. Sacuda o excesso de PBS e use um lenço para remover o excesso de PBS sem tocar diretamente no tecido.
7. Determinar quais os anticorpos secundários que devem ser utilizados na etapa 1.12 do protocolo e as espécies de animais das quais derivam os anticorpos secundários. Fortifique o Perm e o tampão de bloqueio adicionando soro desses animais ao Perm e bloqueando o tampão até uma concentração final de 5% para cada espécie.
   NOTA: O uso de anticorpos secundários ajuda a amplificar a intensidade do sinal. Assim, recomenda-se que os anticorpos primários que produzem sinais fracos sejam emparelhados com anticorpos secundários para amplificar seus sinais. Se todos os alvos de anticorpos que estão sendo corados forem brilhantes o suficiente para não exigir anticorpos secundários, as etapas 1.7-1.12 e 1.15 podem ser ignoradas.
8. Bloqueie a ligação não específica de anticorpos adicionando Perm fortificado suficiente e tampão de bloqueio para cobrir cada tecido. Incube as lâminas por 1-8 h em temperatura ambiente em uma câmara umidificada protegida da luz.
9. Adicione anticorpos primários não conjugados ao Perm e ao tampão de coloração em diluições determinadas experimentalmente (as espécies ou isotipos de imunoglobulina dos anticorpos primários devem ser diferentes e distinguíveis pelos anticorpos secundários que o pesquisador pretende usar na etapa 1.12).
10. Despeje o Perm e o tampão de bloqueio e use um lenço para remover o excesso de tampão sem tocar diretamente no tecido. Adicione Perm e tampão de coloração suficientes com anticorpos primários ao tecido para cobri-lo e incube a lâmina a 4 °C por 12-48 h.
    NOTA: O pesquisador precisará determinar o momento ideal para a incubação de anticorpos.
11. Prepare o tampão de bloqueio e o tampão de coloração (Tabela 1).
12. Adicionar anticorpos secundários ao tampão de coloração preparado na etapa 1.11 em diluições determinadas experimentalmente. Os anticorpos secundários utilizados devem ter como alvo as mesmas espécies ou isotipos de anticorpos que foram utilizados no passo 1.9.
13. Prepare o tampão de têmpera (como na Tabela 1).
    NOTA: Esta etapa ajuda a reduzir a autofluorescência do tecido. Se isso não for necessário, as etapas 1.13 e 1.14 podem ser ignoradas.
14. Lave os lenços conforme descrito nas etapas 1.5-1.6. Em seguida, adicione tampão de têmpera suficiente para cobrir os tecidos nas lâminas e incube as lâminas em temperatura ambiente por 1-2 min.
15. Lave o lenço conforme descrito nas etapas 1.5-1.6. Em seguida, adicione os anticorpos secundários diluídos no tampão de coloração preparado na etapa 1.12 aos tecidos, de modo que os tecidos fiquem completamente cobertos pelo tampão de coloração. Incubar as lâminas a 4 °C durante 2-8 h.
16. Preparar a solução de bloqueio adicionando 50 μL de soro normal de qualquer espécie de anticorpos que será utilizada no passo 1.18 (5% de cada espécie) ao tampão de bloqueio preparado no passo 1.11.
17. Lave os lenços conforme descrito nas etapas 1.5-1.6. Em seguida, adicione a solução de bloqueio com soro normal preparado na etapa 1.16 aos tecidos para que fiquem completamente cobertos com tampão de coloração. Incube as lâminas em temperatura ambiente por 1-8 h.
18. Preparar a solução de coloração adicionando anticorpos primários conjugados com fluoróforo em diluições determinadas experimentalmente ao tampão de coloração preparado no passo 1.11. Além disso, adicione uma coloração nuclear, como amarelo nuclear, à solução de coloração em uma diluição determinada experimentalmente.
    NOTA: As etapas 1.18-1.19 só são necessárias se o pesquisador precisar usar rótulos de anticorpos adicionais que não exijam anticorpos secundários para amplificação de sinal. Se não estiver usando anticorpos conjugados primários, as colorações de núcleos podem ser adicionadas na etapa 1.12.
19. Sacuda o tampão de bloqueio e use um lenço para remover o excesso de tampão sem tocar diretamente no tecido. Adicione ao tecido uma solução de coloração suficiente preparada na etapa 1.18 para cobri-lo e incube a 4 °C por 12-48 h.
20. Lave os lenços conforme descrito nas etapas 1.5-1.6. Adicione 5 gotas de mountant a cada lâmina sem introduzir bolhas e, suave e lentamente, incline uma lamínula de vidro sobre o tecido para cobrir o tecido completamente com mountant e excluir todas as bolhas de ar. Armazene os slides a 4 ° C no escuro até que estejam prontos para serem fotografados.

2. Imagem das seções de tecido

NOTA: Nesta fase, as seções de tecido são coradas com todos os anticorpos de interesse para todas as condições que se destinam a ser visualizadas, e os controles de cor única são corados com um parâmetro fluorescente em cada seção. A imagem deve ser feita em um microscópio que tenha vários detectores que podem ser ajustados para detectar faixas específicas de luz e, idealmente, deve ter acesso ao maior número possível de linhas de laser para excitação.

1. Insira uma das lâminas totalmente coradas no microscópio e configure o microscópio para obter imagens da seção usando a objetiva que se destina a ser usada para coletar dados.
2. Com base nos fluoróforos com os quais o tecido é corado, identifique as linhas de laser de excitação necessárias para estimular esses fluoróforos e identifique as faixas de emissão para cada fluoróforo que contém a maior quantidade de sinal.
   NOTA: As ferramentas de visualização de espectros de fluorescência on-line (por exemplo, consulte a Tabela de Materiais) podem ser úteis para identificar os comprimentos de onda de excitação ideais dos fluoróforos e identificar as faixas ideais para a detecção de fluoróforos. Os fluoróforos usados para citometria de histofluxo devem ser escolhidos de forma que cada fluoróforo difira na linha de laser ideal pela qual o fluoróforo é estimulado ou difere pela faixa ideal de comprimentos de onda de emissão. Os fluoróforos que têm comprimentos de onda de excitação/emissão mais próximos serão mais difíceis de separar. Os fluoróforos usados para este estudo são detalhados na seção de resultados.
3. Abra o Software 1 (consulte a Tabela de Materiais) em um microscópio confocal e selecione a guia de configuração na parte superior. Em seguida, selecione o botão de hardware no lado esquerdo e altere a profundidade de bits para 16 bits.
   NOTA: Recomenda-se usar profundidades de bits mais altas, como dados de 16 bits, para coleta de dados, pois isso melhorará a precisão da compensação espectral. Além disso, densidades de pixels mais altas, números maiores para médias de linha e mais etapas na pilha z melhorarão a qualidade da separação espectral.
4. Selecione a guia Adquirir na parte superior da tela e insira a configuração de formato para incluir a densidade de pixels da imagem (normalmente, resoluções mais altas produzem melhores resultados).
5. Se disponível, selecione a aquisição X bidirecional para acelerar o tempo de imagem, desde que esse recurso tenha sido calibrado adequadamente.
6. Escolha um valor de orifício para o microscópio confocal (normalmente entre 400-600 nm) onde valores menores normalmente produzirão resultados de citometria de histofluxo de maior qualidade, embora valores de orifício menores dificultem a aquisição de imagens e possam exigir tempo de imagem adicional ou intensidades de excitação mais altas para produzir imagens.
7. Selecione Mostrar painel de verificação sequencial na parte superior do menu à esquerda para abrir a opção de verificação sequencial. Use o sinal '+' para configurar sequências adicionais, onde cada sequência conterá um comprimento de onda de excitação que foi decidido na etapa 2.2.
8. Ligue todos os lasers necessários clicando nos botões ON associados aos lasers de interesse no centro da tela para transformá-los em um estado ON. Vá para cada sequência específica e aumente a potência do laser no centro da tela para qualquer valor desejado, onde cada sequência terá um comprimento de onda de excitação sendo usado.
9. Ligue quantos detectores forem necessários na parte inferior da tela em cada sequência para obter imagens de todos os fluoróforos que serão fotografados nessa linha de laser. Ajuste os intervalos dos detectores clicando duas vezes em seus intervalos e inserindo os intervalos superior e inferior dos comprimentos de onda que precisam ser coletados.
   NOTA: Recomenda-se que detectores de alta sensibilidade sejam usados sempre que possível e, idealmente, todos os canais devem ser coletados nos mesmos tipos de detectores, embora isso não seja obrigatório.
10. Pressione o botão ao vivo e concentre-se na amostra. Use o botão Auto Scale à esquerda da imagem no software para avaliar se os canais estão adequadamente saturados com sinal. O usuário deve ajustar os valores de ganho e as intensidades do laser em cada sequência até que o dimensionamento automático não atinja o valor máximo (65535 para dados de 16 bits), mas esteja muito próximo da saturação para todos os canais.
    NOTA: Como diferentes fluoróforos podem diferir em seu brilho e diferentes alvos de anticorpos podem diferir em sua abundância, a sensibilidade dos detectores precisará ser ajustada para ser de baixa sensibilidade para sinais brilhantes e alta sensibilidade para sinais escuros se ambos os fluoróforos forem estimulados pelo mesmo laser (a intensidade do laser não pode mudar neste cenário, pois ambos os fluoróforos seriam afetados). Para obter melhores resultados, o sinal de fluorescência de cada canal no experimento deve ser balanceado de modo que cada canal tenha quantidades aproximadamente equivalentes de sinal, o que reduzirá o sangramento espectral para outros canais e resultará em sinais mais fortes. Como amostras diferentes podem diferir na abundância dos marcadores de interesse que estão sendo corados, recomenda-se que as configurações do microscópio sejam testadas em várias condições experimentais para confirmar que o branqueamento não está ocorrendo em nenhuma das condições experimentais.
11. Assim que as configurações do microscópio forem finalizadas, carregue o microscópio com as lâminas de controle de cor única e encontre a coloração representativa para cada fluoróforo. Configure uma pilha Z concentrando-se abaixo da amostra e pressionando o botão Iniciar no menu da pilha z, depois focando acima da amostra e pressionando o botão Final .
12. Escolha o número de etapas e a distância entre as etapas (e use o mesmo número de etapas e parâmetros, como densidades de pixels e profundidade de bits, que serão usados para criar imagens dos slides totalmente manchados) e pressione o botão Iniciar.
    NOTA: Idealmente, essas imagens devem incluir os sinais mais brilhantes da coloração real que podem ser encontrados na lâmina.
13. Depois que os controles de cor única forem criados, continue usando as mesmas configurações do microscópio para obter imagens de todas as amostras totalmente coradas.

3. Compensação de fluorescência

1. Abra os arquivos .lif no Software 1 e clique na guia do processo.
2. Escolha o módulo Separação de corantes e, em seguida, escolha a opção Separação automática de corantes . Selecione o método Manual para Separação de Tinta e escolha sem redimensionamento.
3. Abra uma das imagens de controle de cor única. Inspecione manualmente os controles de cor única para sangramento espectral de um canal para o próximo, observando janelas em escala de cinza para cada canal em busca de evidências de um sinal em canais inadequados. Use o botão Auto Scale , se necessário, para ver o sangramento fraco.
4. Comece a remover a sangria inserindo manualmente números (normalmente 0-1, onde 0 representa nenhuma sangria e 1 representa 100% de sangria) na matriz na tela e, em seguida, pressione aplicar para testar se a sangria foi removida adequadamente. Isso deve ser repetido até que os sinais em todos os outros canais, exceto o canal de interesse, tenham sido reduzidos a níveis de fundo.
   NOTA: A supercompensação levará a resultados imprecisos, portanto, a fluorescência deve ser reduzida a níveis de fundo, mas não abaixo deles. Os dados supercompensados aparecerão como um canal com um sinal e outros canais parecendo ter buracos negros onde está o sinal de interesse (Figura 2).
5. Depois que um dos controles de cor única for concluído, registre os valores na matriz e, em seguida, redefina a matriz e passe para o próximo controle de cor única. Repita esse processo para cada controle de cor único.
   NOTA: O primeiro corante estará na linha Corante 1 e a quantidade de fluorescência que precisa ser removida do Corante 1 estará nas colunas adjacentes.
6. Reúna todos os valores adquiridos de cada controle em uma matriz e aplique essa matriz a uma amostra totalmente corada. Se a separação parecer precisa, aplique as configurações a todas as imagens no experimento, caso contrário, reavalie os controles de cor única.
   NOTA: A compensação efetiva deve remover a maior parte do sangramento entre os canais, conforme resumido e mostrado na Figura 3.
7. Salve todos os arquivos compensados em um arquivo .lif separado.

4. Identificação de núcleos e células usando ilastik

1. Abra os arquivos .lif compensados no FIJI²⁰. Habilite a visualização de pilhas em uma hiperpilha e selecione uma imagem.
2. (Opcional) Use uma ferramenta de seleção, como a ferramenta retângulo, para incluir as partes da imagem que serão analisadas e excluir áreas que não serão analisadas. Corte a imagem usando a função de corte de imagem >.
   NOTA: Reduzir o tamanho da imagem é útil nas etapas subsequentes para reduzir o consumo de memória de acesso aleatório (RAM) e aumentar a velocidade de processamento.
3. Salve a imagem como um arquivo .tif. Além disso, salve a imagem como um arquivo hdf5 usando o plug-in ilastik para FIJI clicando em Plug-ins > ilastik > Exportar hdf5. Salve o arquivo como "nome de escolha".h5 com compactação 0.
4. Abra o Ilastik²¹ e faça um projeto de classificação de pixels. Use a função Adicionar novo > Adicionar imagens separadas para adicionar pelo menos 3 imagens representativas adicionando novos dados de entrada.
5. Clique com o botão direito do mouse em uma das imagens, selecione Editar propriedades e altere o Modo de exibição para escala de cinza.
6. À esquerda da tela, selecione a guia de seleção de recursos. Clique em Selecionar recursos e selecione todos os recursos até o valor sigma mais alto que o programa permitirá que você use e pressione OK.
7. Agora selecione a guia Treinamento. Use a ferramenta pincel (enquanto o rótulo um estiver selecionado) para destacar células individuais (Figura 4) de interesse, de modo que o interior (citoplasma e núcleo) e a membrana celular sejam incluídos no destaque.
8. Repita isso em todas as amostras de treinamento onde todos os tipos de células de interesse são selecionados, e várias células de intensidades, morfologias e localizações variadas no tecido devem ser selecionadas de cada amostra.
   NOTA: Dependendo dos marcadores escolhidos para um conjunto individual de colorações, pode ou não haver colorações intracelulares ou colorações de membrana celular para as células de interesse. Quaisquer que sejam os marcadores usados, certifique-se de que o destaque inclua a coloração mais externa nas células de interesse e inclua o interior da célula, independentemente de uma coloração intracelular ser usada.
9. Em seguida, use o rótulo dois para destacar tudo o que não são as células de interesse (Figura 4). Isso pode incluir espaço em branco, núcleos não marcados ou tecido que não possui marcadores de interesse. Certifique-se de incluir o espaço imediatamente adjacente às células de interesse para promover o aprendizado dos limites exatos das células.
10. Use a função Live Update para avaliar a qualidade do treinamento em imagens de interesse. Se o treinamento for inadequado, continue o treinamento nas etapas 4.7 a 4.9. Caso contrário, se satisfatório, clique na guia Exportação de previsão .
11. Defina a origem como probabilidades. Clique no botão Escolher configurações de imagem de exportação e defina o parâmetro c para exportar 0-1 (supondo que o rótulo 1 esteja destacando os parâmetros de interesse).
12. Converta o tipo de dados em um inteiro de 16 bits e exporte como um arquivo hdf5 para o diretório de interesse com o nome de interesse (recomendamos usar {nickname} mask.h5) e pressione OK.
13. Clique na guia Processamento em lote . Pressione o botão Selecionar arquivos de dados brutos , selecione todos os arquivos .h5 de interesse que exigem processamento e pressione Abrir. Clique em Processar todos os arquivos.
14. Repita as etapas 4.4 a 4.13, exceto que, em vez de identificar as células, agora identifique os núcleos e exclua todo o resto (Figura 4). Exporte isso como uma previsão separada para identificar núcleos celulares.
15. Abra o Ilastik e crie um novo projeto de conversão de dados. Adicione um arquivo hdf5 representativo à guia Dados de entrada usando a função Adicionar novo > Adicionar imagem separada .
16. Clique na guia Exportação de dados e escolha o botão Escolher configurações de imagem de exportação com a fonte definida para entrada. Altere o formato para tiff de várias páginas, escolha um local de salvamento com a função select e defina o nome do arquivo como {nickname}. Pressione OK.
17. Clique na guia Processamento em lote e selecione todos os seus arquivos hdf5 usando o botão Selecionar arquivos de dados de entrada e pressione o botão Processar todos os arquivos .
18. Abra o Software 2 (consulte Tabela de Materiais) e adicione todos os arquivos tif/tiff gerados nas etapas 4.3 e 4.17 usando o botão Adicionar Arquivos . Escolha um local para as saídas de arquivo e pressione o botão Iniciar tudo para converter todos os arquivos em arquivos .ims. Os arquivos agora estão prontos para análise no Software 3 (consulte Tabela de Materiais).

5. Análise em Software 3

1. Abra uma das imagens que contém todas as manchas fluorescentes. Selecione Edit-> Adicionar canais e adicione os arquivos .ims correspondentes às máscaras feitas sobre núcleos e corpos celulares. Repita isso para todas as amostras.
2. Selecione o botão Adicionar novas células . Selecione a opção detectar núcleo e célula e prossiga.
3. Selecione a máscara sobre os núcleos para ser o canal de origem para detectar núcleos e selecione a opção avançada para dividir núcleos por pontos de semente. Escolha um valor para o diâmetro do núcleo) e prossiga.
   NOTA: O valor ideal para o diâmetro do núcleo precisará ser testado executando a simulação e avaliando manualmente se o programa não está dividindo núcleos suficientes (vários núcleos são agrupados) ou se há divisão excessiva (um núcleo é dividido em mais de um).
4. Escolha um valor para a avaliação de qualidade e prossiga. Normalmente, é melhor incluir todos os núcleos, pois a omissão de núcleos pode levar à fusão de várias células em uma.
5. Escolha um valor limite para criar superfícies nucleares e prossiga. Certifique-se de que todos os núcleos, mesmo aqueles que são mais escuros, ainda estejam incluídos no limite. Não torne o limite muito baixo, pois isso pode superestimar o tamanho dos núcleos ou potencialmente incluir detritos como coloração nuclear.
6. Selecione um valor para o número mínimo de Voxels por núcleo e prossiga. Normalmente, é melhor manter tudo, a menos que detritos ou não núcleos possam ser excluídos usando este parâmetro.
7. Escolha a opção Limite celular e citoplasma , selecione a máscara sobre as células para ser o canal de origem para detectar corpos celulares e prossiga.
8. Escolha um limite de célula que capture com precisão todas as células de interesse, mas não seja tão baixo que inclua o plano de fundo ou qualquer detecção não específica de células. Selecione a opção para dividir as células em contato de forma que haja um núcleo por célula e elas sejam separadas pela distância dos núcleos. Além disso, opte por expandir as células nos núcleos e prossiga.
9. Selecione um valor para o número mínimo de voxels por célula e prossiga. Normalmente, é melhor manter tudo, a menos que detritos ou não células possam ser excluídos usando este parâmetro.
10. Avalie se as superfícies criadas sobre as células são precisas, observando se várias células foram fundidas ou se as células estão faltando. Se as superfícies forem inadequadas, volte para a etapa 5.2 e tente novos parâmetros até que as configurações ideais sejam determinadas.
11. Depois que as melhores configurações forem estabelecidas, clique no objeto de células criadas no menu à esquerda, clique na guia de criação e clique no botão Armazenar parâmetros para lote para salvar as configurações usadas.
12. Abra várias janelas do Software 3 e abra imagens separadas em cada janela. Pressione o novo botão Células em cada janela, escolha as configurações salvas no menu Parâmetros de criação favoritos e instrua cada janela a ser executada até a conclusão. Repita isso quantas vezes forem necessárias até que todas as amostras sejam analisadas.
    NOTA: A execução de várias instâncias do Software 3 fará com que essa análise prossiga mais rapidamente, mas o número de janelas que podem ser executadas em paralelo dependerá da velocidade de processamento da unidade central de processamento (CPU) e da quantidade de RAM que o computador em que a análise está sendo executada.
13. Depois que todas as amostras forem concluídas, clique no objeto de células criadas no menu à esquerda em cada imagem e clique na guia Estatísticas. Clique no botão Configurar lista de valores de estatísticas visíveis, desmarque todas as estatísticas, exceto o valor 'Média de intensidade da célula' e pressione OK.
14. Para cada imagem que precisa ser analisada, clique no botão Exportar todas as estatísticas para o arquivo na guia de estatísticas e salve os arquivos em um local.

6. Análise de citometria de histofluxo e mapeamento de populações em seções de tecido

1. Abra o Anaconda e o JupyterLab no Anaconda. Em seguida, abra o script fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Execute o código usando o menu Executar e selecione Executar Todas as Células ou execute as células individualmente em ordem selecionando Executar Células Selecionadas.
2. Quando solicitado a inserir o arquivo de origem, insira o diretório de arquivos para os valores fluorescentes exportados gerados na etapa 5.14. O diretório de arquivos pode ser obtido examinando as propriedades de um dos arquivos .csv exportados e copiando o caminho do arquivo para o prompt.
3. Em seguida, o programa solicitará um local de saída para os arquivos processados. Insira o diretório de arquivos para qualquer local adequado para salvar os arquivos processados. O programa detectará automaticamente o número de canais fluorescentes contidos na pasta.
4. Execute a próxima seção do código para anotar os dados com os nomes de cada canal. Esse código pode ser modificado conforme necessário para alterar o parâmetro "numberOfChannels" para corresponder ao número de canais detectados na etapa 6.3. Além disso, os nomes dos canais podem ser modificados para quantos canais forem necessários, repetindo a linha 'ChX':'Marker' quantas vezes forem necessárias e modificando os nomes dos marcadores.
5. A execução da próxima linha de código criará um arquivo .csv no local especificado que é anotado e contém todos os parâmetros fluorescentes no conjunto de dados. Repita as etapas 6.1 a 6.5 para cada conjunto de exportações do Software 3 para criar arquivos .csv para todos os dados.
6. Converta os arquivos .csv em arquivos .fcs abrindo o Software 4 (consulte Tabela de materiais) e arrastando os arquivos .csv para a janela do programa. O Software 4 começará automaticamente a converter os arquivos em arquivos .fcs.
7. Clique duas vezes em uma das amostras no Software 4 para abrir uma janela nessa amostra. Use as ferramentas de gating no Software 4 para criar uma estratégia de gating. Recomenda-se começar com um marcador definidor de linhagem contendo todas as células de interesse, depois prosseguir para portas que removem subconjuntos mais raros primeiro e, em seguida, terminar nos tipos de células mais abundantes.
8. Depois que uma estratégia de gating for estabelecida, teste a precisão do gating clicando com o botão direito do mouse nessa população no menu e escolhendo exportar. Exporte todos os parâmetros como um arquivo .csv com cabeçalhos incluídos.
9. Abra o JupyterLab no Anaconda. Em seguida, abra o script fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 2 e execute o código. Quando solicitado a inserir o local do arquivo Software 4, insira o diretório de arquivos para o arquivo de .csv exportado gerado na etapa anterior. O diretório de arquivos pode ser obtido examinando as propriedades do arquivo .csv exportado e copiando o caminho do arquivo para o prompt.
10. Quando solicitado a adicionar o local de saída, escolha qualquer diretório de arquivo de sua escolha e certifique-se de que o diretório de arquivos inclua o nome do arquivo no final ('diretório de arquivos'\filename.txt). Execute o restante do código.
11. Copie o texto no arquivo .txt e abra o arquivo .ims correspondente no Software 3 para o mesmo exemplo no qual os dados exportados se baseiam. Clique no objeto Cell no arquivo, alterne para a guia de estatísticas, cole o texto na barra de pesquisa e inicie a pesquisa. Todas as células de interesse serão destacadas.
12. Inspecione manualmente se todas as células de interesse foram capturadas usando a estratégia de gating. Se o número de células for subestimado ou superestimado (exemplos mostrados na Figura 5), volte para a etapa 6.7, ajuste a porta e reavalie se as células são capturadas com precisão com a nova porta. Repita isso com todas as portas na estratégia de gating e avalie o gating em várias amostras.
13. Quando todas as portas forem validadas, exporte os dados do Software 4 usando a função de editor de tabelas e analise os dados usando o método de análise preferido.
    NOTA: As populações de células podem ser mapeadas de volta para as seções de tecido no Software 3, identificando a população fechada como nas etapas 6.8-6.11 e, em seguida, criando uma superfície com base nas células selecionadas. Isso pode ser feito para cada população fechada, conforme mostrado na Figura 6 e na Figura 7.

Resultados

Figura 1: Fluxo de trabalho de citometria de histofluxo. As seções de tecido são coradas com corantes espectralmente sobrepostos (etapa 1). As imagens são coletadas em lasers de excitação individuais emparelhados com filtros passa-banda sintonizáveis para minimizar o sangramento espectral entre os fluoróforos (etapa 2). O sangramento espectral entre os canais é corrigido com base em uma matriz de compensação gerada usando controles de tecido corado de cor única (etapa 3). Os núcleos e células nas imagens são então identificados usando ilastik (etapa 4) e divididos em células únicas no Software 3 (etapa 5). Parâmetros adicionais são incorporados antes de exportar todos os dados do Software 3 para o Software 4 para realizar a análise de citometria de fluxo. As identidades das células são então exportadas do Software 4 e mapeadas de volta para os IDs das células no tecido original para resolver a localização espacial das células nas seções do tecido (etapa 6). Os sinais de dinheiro representam software comercial que requer compra, e os sinais de computador representam software livre. O tempo aproximado para cada etapa é indicado ao lado da ampulheta. O software comercial está listado na Tabela de Materiais. Essa figura é adaptada de Jain et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na Figura 3, os tecidos dos linfonodos foram corados com um anticorpo CD138 anti-camundongo de rato emparelhado com um anticorpo secundário Dylight 405 anti-rato de burro, Nuclear Yellow, um anticorpo CD4 anti-camundongo conjugado a Alexa Fluor 488, um anticorpo IgD anti-camundongo conjugado a PerCP-eF710, um anticorpo Iba1 anti-camundongo de coelho emparelhado com um anticorpo secundário Alexa Fluor 546 anti-coelho de burro, um anticorpo anti-camundongo CD3ε de rato conjugado a PE-eF610, um anticorpo anti-camundongo B220 de rato conjugado com Alexa Fluor 647 e um anticorpo anti-camundongo CD45 de rato conjugado a APC-R700. Um laser violeta de 405 nm foi usado para estimular os corantes amarelos Dylight 405 e Nuclear, e suas emissões foram detectadas nas faixas de 408-438 nm e 460-530 nm, respectivamente. Um laser verde de 488 nm foi usado para estimular os corantes Alexa Fluor 488 e PerCP-eF710, e suas emissões foram detectadas nas faixas de 495-545 nm e 682-750 nm, respectivamente. Um laser amarelo-verde de 552 nm foi usado para estimular os corantes Alexa Fluor 546 e PE-eF610, e suas emissões foram detectadas nas faixas de 557-600 nm e 615-652 nm, respectivamente. Um laser vermelho de 640 nm foi usado para estimular os corantes Alexa Fluor 647 e APC-R700, e suas emissões foram detectadas nas faixas de 647-682 nm e 700-750 nm, respectivamente.

Figura 2: Exemplos de remuneração ruim e de qualidade. As esferas foram coradas com um anticorpo conjugado ao PE-eFluor 610 e fotografadas nos canais correspondentes aos canais PE-eFluor 610 (PE-eF610) e Alexa Fluor 546 (A546). Diferentes graus de compensação foram aplicados à mesma imagem no canal A546 (redução de 10% para subcompensação, 28% de redução para compensação correta e 60% de redução para supercompensação) para remover o sangramento do fluoróforo PE-eF610, resultando em diferentes graus de separação. Para visualizar melhor os graus de compensação, é fornecida uma versão iluminada das imagens de sangramento. A seta amarela aponta para a mesma área em cada imagem correspondente a uma área onde há coloração real no canal PE-eF610. Barras de escala: 4 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Compensação de fluorescência usando seções de tecido corado. (A-C) As seções de tecido linfonodal foram coradas com Abs simples conjugado aos fluoróforos listados. Amostras de coloração única não compensadas foram então visualizadas em todos os canais (A, superior) e a compensação foi aplicada aos controles de cor única (A, inferior). (B) O sangramento entre os canais em (A) foi quantificado (intensidade média de fluorescência da imagem atual dividida pela intensidade média de fluorescência do canal do fluoróforo atual) e apresentado em mapas de calor. Os quadrados brancos representam valores que excedem o 100% de sangramento. (C) A sobreposição espectral é avaliada nas condições de compensação não compensada e baseada em células, comparando a separação espectral de Iba1-A546 e CD3-PEeF610 em amostras totalmente coradas. Barras de escala: 30 μm. Essa figura é adaptada de Jain et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Seguindo este protocolo (resumido na Figura 1), os corantes fluorescentes espectralmente sobrepostos devem ser efetivamente separados, conforme mostrado na Figura 3A, B. Embora a separação completa dos corantes possa não ser possível, a separação deve ser suficiente para diferenciar claramente os diferentes tipos de células (Figura 3C). Se ainda houver sombras de células espectralmente sobrepostas em outro canal, isso pode indicar que ainda há sangramento ocorrendo e as imagens podem precisar de reprocessamento (Figura 2). Além disso, a supercompensação será aparente se a área compensada cair abaixo dos níveis de fluorescência associados à coloração de fundo e aparecer como áreas pretas onde o sangramento já foi (Figura 2). A supercompensação pode levar à perda de sinal real no canal ao qual a compensação foi aplicada e deve ser evitada. No entanto, se este protocolo foi seguido corretamente, não deve haver problemas com a compensação e, portanto, o pesquisador deve considerar se qualquer sangramento aparente é artificial ou parte da biologia.

Figura 4: Exemplo de detecção de núcleo e célula baseada em ilastik. A coloração amarelo nuclear (canto superior esquerdo) foi usada para identificar os núcleos (canto superior direito em amarelo) e o que não é um núcleo (em azul). A coloração representativa de CD45 (mostrada no canto inferior esquerdo) é usada para identificar células (canto inferior direito em amarelo) e o que não é uma célula (em azul). Essa figura é adaptada de Jain et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma vez que os corantes são separados com precisão, dividir o tecido em células individuais é essencial para a realização de análises de células únicas. O protocolo descrito aqui usa aprendizado de máquina definido pelo usuário (Figura 4) para separar as células mesmo quando elas estão compactadas, conforme mostrado nos gânglios linfáticos mostrados na Figura 6.

Figura 5: Avaliando se um portão foi ajustado corretamente. A coloração representativa de CD138 (colorida em ciano) em um linfonodo é mostrada, e três portas separadas (o gráfico de pontos à esquerda) foram feitas para identificar células CD138 ⁺ no tecido. Uma estimativa excessivamente conservadora de células CD138⁺ é mostrada como a porta azul e mapeada para o tecido em azul. Uma estimativa equilibrada de células CD138⁺ é mostrada como a porta verde e mapeada para o tecido em verde. Uma estimativa excessivamente permissiva de células CD138 ⁺ é mostrada como a porta vermelha e mapeada para o tecido em vermelho. O círculo amarelo identifica uma área onde as células CD138 ⁺ não estão sendo identificadas pela porta excessivamente conservadora, e o círculo magenta identifica uma área sem células CD138 +, que se afirma conter células CD138 ⁺ pela porta excessivamente permissiva. Barras de escala: 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Deve-se ter cuidado ao determinar as posições precisas das portas na análise de citometria de fluxo (mostrada na figura 5) para garantir que essas portas não superestimam ou subestimam a abundância de células. Isso deve ser determinado mapeando as células de volta ao tecido, como na Figura 5, para ver se as células que expressam seus marcadores de interesse estão sendo capturadas na análise. Se muitas células estiverem sendo selecionadas (por exemplo, células que não expressam CD138 estão sendo selecionadas como sendo CD138⁺), as portas devem ser deslocadas para serem menos permissivas e, se poucas células estiverem sendo selecionadas, as portas devem ser mais permissivas. As portas devem ser otimizadas para seletividade, de modo que as portas upstream sejam otimizadas primeiro e, em seguida, cada porta subsequente na cadeia seja otimizada em seguida. No final, a otimização eficaz de uma estratégia de gating deve ser capaz de resolver subconjuntos de células de interesse (Figura 6 e Figura 7).

Figura 6: Identificação baseada em citometria de fluxo de células em seções de tecido. (A) Valores fluorescentes exportados de células únicas do Software 3 em seções de linfonodos foram analisados no Software 4 para identificar as populações de células declaradas com base na estratégia de gating mostrada. (B) As populações identificadas no Software 4 foram mapeadas de volta para a mesma seção de tecido e as superfícies foram geradas para cada população. A coloração CD45 não é mostrada. Barra de escala: 30 μm. Essa figura é adaptada de Jain et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Detalhamento de colorações individuais e populações em linfonodos de camundongos. Colorações individuais para marcadores de células imunes são mostradas nos painéis superiores, e sua população fechada associada identificada na Figura 6A é mostrada abaixo de cada coloração. Barra de escala: 30 μm, mostrada no painel superior esquerdo. Essa figura é adaptada de Jain et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Essa técnica foi usada anteriormente¹⁸ para caracterizar infiltrados de células imunes na medula espinhal durante a neuroinflamação e validou que proporções equivalentes de células imunes infiltrantes são encontradas usando citometria de histofluxo e citometria de fluxo. A técnica também foi validada, demonstrando que funciona em baços e cérebros de camundongos e pode identificar diferenças entre as condições de tratamento, que foram reproduzidas em experimentos de citometria de fluxo idênticos (não publicados). Essa técnica também tem sido usada para analisar a medula espinhal de camundongos que receberam injeções estereotáxicas dos modelos do SNC.

Figura 8: Separação de 8 corantes em uma seção de amígdala humana. Cortes de amígdalas humanas foram corados com CD20 para identificar células B e IgM, IgA e IgG para identificar células plasmáticas. As colorações Blimp1 e CD38 foram incorporadas para validar ainda mais as identidades das células plasmáticas e Ki67 para identificar células em proliferação. A mancha amarela nuclear não é mostrada na imagem combinada. Barra de escala: 22 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Esta técnica também pode ser aplicada para analisar seções de tecido humano. Como exemplo de coloração em tecidos humanos, seções de amígdalas humanas foram coradas com uma seleção de 8 marcadores: um anticorpo IgM anti-humano de cabra conjugado a Dylight 405, Nuclear Yellow, um anticorpo IgA anti-humano de cabra conjugado a Alexa Fluor 488, um anticorpo anti-CD20 humano de camundongo emparelhado com um fragmento F (ab ') 2 de cabra anti-camundongo conjugado a PerCP-eFluor 710, um anticorpo anti-humano IgG de cabra conjugado a Cy3, um anticorpo anti-humano Ki67 de coelho emparelhado com um anticorpo anti-coelho de cabra conjugado a PE-Alexa Fluor 610, um anticorpo Blimp1 anti-humano de rato emparelhado com um anticorpo anti-rato de burro conjugado a Alexa Fluor 647 e um anticorpo anti-CD38 humano de camundongo conjugado a APC-R700. Após a compensação, pode-se observar a separação desses marcadores na secção da amígdala (Figura 8). Isso demonstra a utilidade dessa técnica em diferentes tecidos e espécies.

Nome da solução	Composição		Como fazer
Buffer de bloqueio	10% de soro de cavalo, 1% de BSA e 0,1% de gelatina de mancha de peixe frio em PBS		Adicione 5 mL de soro de cavalo, 0,5 g de BSA, 50 μL de gelatina fria para manchas de peixe a 45 mL de PBS. Aliquotar estas soluções para tubos de 15 ml e armazená-las a -20 °C até serem necessárias.
Buffer de perm e bloqueio	10% Soro de Cavalo, 1% BSA, 0,1% gelatina de mancha de peixe frio, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween-20 em PBS		Adicione 5 mL de soro de cavalo, 0,5 g de BSA, 50 μL de gelatina fria de peixe, 50 μL de Triton X-100 e 25 μL de Tween-20 a 45 mL de PBS. Aliquotar estas soluções para tubos de 15 ml e armazená-las a -20 °C até serem necessárias.
Perm e tampão de coloração	1% BSA, 0,1% gelatina de mancha de peixe frio, 0,5% Triton X-100 em PBS		Adicione 0,5 g de BSA, 50 μL de gelatina fria de mancha de peixe e 250 μL de Triton X-100 a 50 mL de PBS. Aliquotar estas soluções para tubos de 15 ml e armazená-las a -20 °C até serem necessárias.
Buffer de têmpera	5% Trueblack, 66,5% etanol, 28,5% água		Pré-aqueça a solução de Trueblack a 70 °C durante 5 min. Em seguida, adicione 50 μL de Trueblack a 950 μL de etanol a 70% para fazer o tampão Trueblack. Faça isso fresco a cada vez. Você precisará de ~ 500 μL por lâmina, embora as quantidades específicas dependam da natureza de seus tecidos.
Tampão de coloração	1% de BSA e 0,1% de gelatina de corante de peixe frio em PBS		Adicione 0,5 g de BSA e 50 μL de gelatina fria de corante de peixe a 50 mL de PBS. Aliquotar estas soluções para tubos de 15 ml e armazená-las a -20 °C até serem necessárias.

Tabela 1: Uma lista das soluções e suas composições necessárias para a coloração de seções de tecido.

Arquivo de codificação suplementar 1: Um script Python que coleta os valores de fluorescência de cada canal e cria um arquivo de resumo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: Um script Python que cria uma lista de todos os números de identificação de células fechadas em um arquivo de texto. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Descreve-se aqui o uso da citometria de histofluxo, técnica validada anteriormente¹⁸. Está demonstrado que, ao corar seções de tecido com corantes espectralmente sobrepostos, esse sangramento através dos canais pode ser removido usando compensação espectral, resultando em um número maior de parâmetros fluorescentes sendo claramente resolvidos do que normalmente seria possível através de métodos convencionais. Como as imagens histológicas de alto parâmetro são difíceis de analisar usando métodos convencionais, um pipeline de análise é fornecido para segmentar células individuais dessas imagens. Ao exportar as assinaturas fluorescentes dessas células individuais, demonstra-se que análises de células únicas, como as realizadas na citometria de fluxo, podem ser aplicadas de forma semelhante a imagens histológicas. Enquanto a citometria de fluxo não inclui análise espacial, demonstra-se que a citometria de histofluxo pode mapear populações identificadas por estratégias de gating de volta às seções de tecido para avaliar sua localização espacial. No geral, é demonstrado que a citometria de histofluxo combina os pontos fortes da citometria de fluxo e histologia.

Embora a citometria de histofluxo tenha o benefício de reter informações espaciais, ela também tem muitas das mesmas limitações que a histologia convencional. Embora a citometria de fluxo seja ótima para quantificar células em um tecido inteiro, a histologia é normalmente conduzida analisando uma pequena amostra de seções de tecido que são consideradas representativas do tecido. Para que a histologia quantifique com precisão o número de células em um tecido, seria necessário obter imagens de cada fatia de tecido retirada do tecido e quantificar o número de células em cada uma, o que seria impraticável. Outra questão é que algumas células serão divididas ao meio durante a secção do tecido, e não há como reconstruir essas células. De fato, uma limitação do protocolo listado aqui é que ele não inclui nenhum método para excluir células nas bordas do tecido. Apesar dessas limitações, uma vantagem da citometria de fluxo sobre a citometria de fluxo é que não há necessidade de dissociar os tecidos em suspensões unicelulares, o que pode introduzir vieses nas populações isoladas ou inadequadamente capturadas²². Assim, embora a citometria de histofluxo tenha várias vantagens sobre a citometria de fluxo convencional, a obtenção de medições em todo o tecido continuará sendo um desafio.

Aqui, é demonstrado que oito parâmetros fluorescentes espectralmente sobrepostos podem ser separados; no entanto, outros separaram com sucesso 13 corantes fluorescentes¹⁷. O número de corantes que podem ser separados depende das propriedades do microscópio no qual os dados são coletados. Os corantes fluorescentes diferem em relação aos seus comprimentos de onda de excitação ideais e em seus comprimentos de onda de emissão mais comuns. Os microscópios que fazem uso dessas propriedades usando uma ampla gama de comprimentos de onda de excitação para corresponder com mais precisão aos comprimentos de onda de excitação ideais dos fluoróforos e ajustando os detectores de emissão para corresponder com precisão aos comprimentos de onda emitidos com mais frequência maximizarão a separação de corantes fluorescentes. Minimizar a sobreposição espectral é essencial para gerar dados de alta qualidade, pois a compensação do sangramento entre os canais pode afetar potencialmente a faixa dinâmica de detecção dos fluoróforos interagindo uns com os outros e, portanto, a separação baseada em emissão e excitação é um primeiro passo crítico na separação de fluoróforos. Dependendo das propriedades do seu microscópio e do número de parâmetros fluorescentes que precisam ser visualizados, pode ser necessário colocar vários fluoróforos que compartilham os mesmos comprimentos de onda de excitação, mas diferem em seus comprimentos de onda de emissão nas mesmas linhas de laser. Isso normalmente é obtido usando corantes fluorescentes básicos em combinação com corantes fluorescentes conjugados, onde os corantes conjugados emitem em comprimentos de onda mais longos e, portanto, podem ser distinguidos com base em seus comprimentos de onda de emissão. No geral, os corantes devem ser distinguidos por suas frequências de excitação ou emissão para uma separação eficaz.

A obtenção de uma compensação perfeita é complicada por vários fatores, incluindo o aspecto espacial da compensação. Primeiro, se um fluoróforo emite um fóton é em parte baseado no acaso²³, onde os fótons coletados em cada imagem são tendenciosos para locais de coloração densa. No entanto, áreas menos densamente manchadas podem, por acaso, emitir um fóton que aparece em um dos canais sobrepostos, mas não no canal principal. Como a compensação é aplicada por voxel, a sobreposição espectral não será removida durante a compensação devido à falta de colocalização espacial. Isso pode ser visto na Figura 2, onde a compensação resulta na redução dos locais de coloração densa (as bordas das contas), mas não no centro das contas, onde há coloração mínima e pouca sobreposição com os canais com sangramento. Essa coloração no centro das contas provavelmente se deve a outro problema que pode afetar a compensação, que é que os fótons produzidos fora do plano focal podem aparecer em voxels no plano focal que provavelmente não serão reproduzidos no canal principal e no canal que precisa ser compensado²⁴. Como resultado, esse "ruído" não será efetivamente removido pela compensação sem introduzir uma sobrecompensação. Esses problemas podem ser parcialmente resolvidos usando uma média de linha, medindo os valores fluorescentes de um único voxel várias vezes e usando a média para limitar o impacto de eventos aleatórios. Se estiver usando um microscópio confocal, o tamanho do orifício também pode ser reduzido para excluir fótons fora de foco de serem incorporados às imagens^25,26. O uso dessas correções tem o custo de tempos adicionais de aquisição de imagens, que podem se tornar extensos.

Embora essa técnica tenha sido desenvolvida usando imagens tiradas de um microscópio confocal, ela funcionará com outros tipos de microscópios. Outros usando métodos semelhantes aplicaram essas metodologias a imagens tiradas de microscópios de dois fótons¹⁷ com grande sucesso. Embora essa técnica possa ser aplicada a imagens tiradas de microscópios de campo amplo, existem várias vantagens associadas aos microscópios confocais que melhoram a resolução se um fóton se originou dentro do plano focal. Como uma resolução precisa da localização dos fótons (ou seja, seccionamento óptico) melhora a qualidade da compensação, espera-se que a qualidade da compensação seja relativamente ruim. Isso poderia ser resolvido usando a deconvolução para remover fótons fora de foco para melhorar a resolução das imagens de campo amplo²⁷. Uma ressalva importante que determinará se a deconvolução é compatível com este protocolo é se os valores de fluorescência em cada canal permanecem proporcionais entre si em todas as imagens analisadas. Se os valores de fluorescência após a deconvolução se tornarem arbitrários, é improvável que a mesma matriz de compensação gerada em uma imagem seja aplicada com sucesso a outras imagens. No geral, o fator mais importante que determina se um microscópio pode usar esse fluxo de trabalho é se esse microscópio possui detectores cuja faixa de detecção pode ser ajustada de forma flexível. Se isso estiver disponível, vários fluoróforos estimulados pela mesma excitação podem ser resolvidos através da detecção de seus espectros de emissão em diferentes janelas de detecção.

O número de parâmetros fluorescentes pode ser aumentado ainda mais se combinado com técnicas para corar em série o mesmo tecido várias vezes¹³, como IBEX^14,15. Usando coloração serial, um número efetivamente ilimitado de parâmetros pode ser medido; no entanto, isso pode ser muito demorado. O uso de uma combinação dos métodos de compensação discutidos aqui e a coloração em série pode reduzir consideravelmente o tempo necessário para tirar essas imagens, pois mais canais podem ser visualizados simultaneamente para cada rodada de coloração. O pipeline de análise descrito aqui será dimensionado para quantos marcadores forem desejados e será compatível com seções de tecido coradas em série.

Uma etapa crítica neste pipeline de análise é a segmentação de células únicas a partir de imagens histológicas. Encontrar estratégias eficazes para segmentar com precisão as células a partir de imagens histológicas é um problema comum²⁸, e novos métodos estão sendo desenvolvidos continuamente. Embora esse método possa efetivamente separar células individuais de células compactas, os limites exatos das células geralmente são imperfeitos. Portanto, recomenda-se que os usuários limitem a análise apenas às populações de células nas quais estão interessados, pois quanto menos células precisarem ser separadas, mais precisos serão os limites das células. Os usuários também podem obter uma melhor separação de células definindo várias populações em ilastik, permitindo que o programa segmente diferentes populações de células. Um problema com essa abordagem, no entanto, é que as células definidas dessa maneira não podem ser combinadas no mesmo objeto 'célula' no Software 3 e podem levar à contagem dupla de células. No entanto, se limites celulares mais precisos forem críticos para um experimento, essa abordagem pode ser usada. É recomendável que os usuários experimentem algoritmos de segmentação mais recentes à medida que são desenvolvidos e os incorporem a esse pipeline para obter resultados ainda melhores.

Vários problemas podem surgir ao desenvolver um novo painel de citometria de histofluxo. Primeiro, é fundamental que diferentes marcadores fluorescentes produzam quantidades aproximadamente semelhantes de fluorescência. Se um fluoróforo for muito mais brilhante do que outro, isso pode ser problemático se esse fluoróforo sangrar para outro fluoróforo, pois o sangramento pode ultrapassar a coloração real nesse canal. Isso é visto na Figura 3, onde o Alexa Fluor 546 sangra severamente no PE-eFluor 610. Embora a compensação ainda possa remover esse sangramento, muitas vezes ainda haverá alguma fluorescência persistente devido à luz fora de foco não ser removida, o que pode tornar a compensação incompleta. Além disso, a maioria dos detectores usados em microscópios não possui faixas dinâmicas extensas como as dos citômetros de fluxo. Como resultado, à medida que o sangramento em um canal aumenta, mais da faixa dinâmica nesse detector será saturada com sinais de outros fluoróforos e menos do fluoróforo de interesse. Quando a compensação é removida de tal canal com extenso sangramento, o sinal verdadeiro pode ser resolvido; no entanto, a diferença entre as células positivas para esse marcador e as negativas para ele se tornará menor e pode resultar em uma incapacidade de resolver estados intermediários ou potencialmente até mesmo resolver positivos de negativos. Assim, a sobreposição entre canais deve ser evitada. Em segundo lugar, o brilho dos marcadores pode mudar entre diferentes tecidos. Um painel de marcadores que funciona nos gânglios linfáticos, por exemplo, pode não funcionar mais quando usado no baço ou no sistema nervoso central porque um marcador pode ficar muito claro ou escuro, resultando nesse canal sangrando demais em outros canais ou ficando sobrecarregado pelo sangramento de outros canais. Nesse caso, pode ser necessário trocar os fluoróforos nos marcadores ou mudar o uso de anticorpos conjugados primários para o uso de anticorpos secundários. Por fim, pode ser valioso aproveitar as diferenças na localização dos marcadores quando há sobreposição excessiva entre os canais. Se dois canais se sobrepõem fortemente um ao outro, mas um é um marcador nuclear e o outro é um marcador de superfície celular, então a sobreposição espectral afetará minimamente um ao outro porque a compensação não afetará os mesmos voxels. Se possível, os painéis devem ser projetados para garantir que os canais sobrepostos difiram em sua localização ou que os marcadores sejam expressos em células separadas.

No geral, está demonstrado que a citometria de histofluxo é uma técnica versátil para analisar imagens histológicas em nível de célula única. Enquanto as técnicas mais antigas podem ser limitadas à análise de células que não estão em contato direto célula-célula, esse pipeline de análise pode separar células em contato, tornando-o apropriado para o estudo de células em tecidos em homeostase ou durante a inflamação quando as células imunes se agrupam em locais de dano.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100% Etanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Microscopia Eletrônica Ciências	157-4
Anaconda	N/A	N/A
Albumina de Soro Bovino	Sigma	A4503-50G
Gelatina de mancha de peixe frio	Sigma	G7765
Agrupando dados multicanal do script Imaris.ipynb	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Converter
saída FlowJo para arquivo txt para seleção de células no script Imaris.ipynb	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Donkey
anti-rato Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	concentração 1:300
Burro anti-rato DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	Concentração 1:200
Soro de burro	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Cabra anti-rato IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	Concentração 1:25
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Espectrovisor			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Seções de amígdalas humanas congeladas frescas	amsbio	HF-707
Lamínula de vidro	VWR	48393 106
IgA anti-humana de cabra Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	Concentração de 1:400
IgG anti-humano de cabra Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	Concentração de 1:400
IgM anti-humana de cabra Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	Concentração de 1:300
Cabra anti-coelho A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	concentração 1:250
Cabra anti-coelho IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	Concentração 1:250
Soro de cavalo	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris com módulo celular	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-humano CD20	VWR	CA95024-322	concentração 1:40
Mouse anti-humano CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	concentração 1:20
Soro de cabra normal	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Soro de camundongo normal	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Soro de coelho normal	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Soro de rato normal	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolver em DMSO a uma concentração de 2 mg/ml e armazenar a 4° C no escuro
caneta PAP	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Coelho anti-humano Ki67	Abcam	ab15580	concentração 1:500
Coelho anti-rato Iba1	Wako	019-19741	concentração 1:500
Rato anti-humano Dirigível1	Thermofisher	14-5963-82	concentração
1:40Rato anti-rato B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	concentração 1:250
Rato anti-rato CD138	Biolegend	142502	concentração 1:200
Rato anti-rato CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	Concentração 1:40
Rato anti-rato CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	concentração 1:200
Rato anti-rato CD45 aloficocianina-R700	BD Biosciences	565478	concentração 1:50
Rato anti-rato IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	concentração 1:50
SP8 Microscópio confocal	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42