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Artigo de método

Perfil do pH luminal em organoides gastrointestinais tridimensionais usando microeletrodos

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DOI:

10.3791/66900

⸱

5 de julho de 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology & Cell Biology, Montana State University, 2Department of Physics, Boston University

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve medidas de pH em organoides gástricos derivados de tecidos humanos usando microeletrodos para caracterização espaço-temporal da fisiologia intraluminal.

Resumo

A otimização e caracterização detalhada de modelos organoides gastrointestinais requerem métodos avançados para analisar seus ambientes luminais. Este artigo apresenta um método altamente reprodutível para a medição precisa do pH dentro do lúmen de organoides gástricos humanos 3D por meio de microeletrodos controlados por micromanipuladores. Os microeletrodos de pH estão disponíveis comercialmente e consistem em pontas de vidro chanfradas de 25 μm de diâmetro. Para medições, o microeletrodo de pH é avançado no lúmen de um organoide (>200 μm) que é suspenso em Matrigel, enquanto um eletrodo de referência repousa submerso no meio circundante na placa de cultura.

Usando esses microeletrodos para traçar o perfil de organoides derivados do corpo gástrico humano, demonstramos que o pH luminal é relativamente consistente dentro de cada poço de cultura em ~ 7,7 ± 0,037 e que medições contínuas podem ser obtidas por um mínimo de 15 min. Em alguns organoides maiores, as medições revelaram um gradiente de pH entre a superfície epitelial e o lúmen, sugerindo que as medições de pH em organoides podem ser alcançadas com alta resolução espacial. Em um estudo anterior, microeletrodos foram usados com sucesso para medir as concentrações luminais de oxigênio em organoides, demonstrando a versatilidade desse método para análises de organoides. Em resumo, este protocolo descreve uma ferramenta importante para a caracterização funcional do complexo espaço luminal dentro de organoides 3D.

Introdução

Organoides - estruturas multicelulares em miniatura derivadas de células-tronco - revolucionaram nossa capacidade de estudar a fisiologia humana e estão começando a substituir modelos animais, mesmo em ambientes regulatórios1. Desde a descrição inicial dos organoides intestinais por Sato et al. em 2009, a tecnologia organoide tornou-se imensamente popular2. Um grande número de estudos caracterizou a composição celular e a função dos modelos organoides em grande detalhe 3,4,5,6. No entanto, o espaço luminal dessas estruturas multicelulares 3D permanece em grande parte indefinido 7,8. O lúmen é a cavidade central de organoides derivados de tecidos mucosos que é circundada pelas porções apicais de células epiteliais polarizadas. Como a secreção e absorção celular ocorrem predominantemente na superfície epitelial apical, o microambiente luminal dos organoides é controlado por esses importantes processos fisiológicos. Os modelos organoides usados atualmente demonstram variações nos padrões de sinalização celular, stemness geral, gradientes de concentração de metabólitos e condições ambientais9. Compreender a fisiologia luminal organoide é, portanto, necessário para a modelagem precisa da função e patologia dos órgãos. Infelizmente, a relativa inacessibilidade do lúmen dificulta significativamente as análises funcionais da fisiologia luminal em organoides 3D10.

A capacidade de examinar os perfis de pH é especialmente importante no estômago, que é notório por ter o gradiente de prótons mais acentuado do corpo, variando de aproximadamente 1-3 no lúmen, a quase neutro no epitélio 11,12,13. Permanece uma lacuna significativa em nossa compreensão da manutenção em microescala do gradiente de pH gástrico e a relevância dos modelos organoides na recapitulação desse ambiente dinâmico através da camada de muco gástrico. As abordagens tradicionais para a análise do pH organoide têm envolvido o uso de corantes sensíveis ao pH, que podem ser indicadores fluorescentes ou colorimétricos. McCracken et al. usaram uma injeção luminal de SNARF-5F - um indicador de pH raciométrico - em organoides para analisar uma queda no pH luminal em resposta ao tratamento com histamina. Esses corantes podem ser incorporados ao meio de cultura, permitindo o monitoramento não invasivo e em tempo real do pH. Não apenas os corantes sensíveis ao pH requerem etapas de calibração complexas que contribuem para a baixa confiabilidade e precisão das medições, mas esses corantes também tendem a operar dentro de faixas de detecção específicas que podem não ser representativas de toda a faixa de pH dentro do microambiente de interesse14,15. Pode ser considerado razoável, no entanto, usar corantes indicadores para experimentos confirmatórios. Nanossensores ópticos que usam abordagens de detecção de pH baseadas em optode fluorescente também foram desenvolvidos; no entanto, tais técnicas de detecção requerem imagens microscópicas e também são suscetíveis a fotobranqueamento, fototoxicidade e viés de imagem16,17. Além disso, Brooks et al. têm placas multipoços impressas em 3D contendo microeletrodos sobre os quais os organoides podem ser revestidos18. Essa abordagem, no entanto, não permite medições diretamente dentro do lúmen organoide.

As medições de pH baseadas em eletrodos podem obter maior precisão em comparação com outros métodos, além de fornecer monitoramento de pH em tempo real. Além disso, os eletrodos de pH montados em micromanipuladores permitem uma resolução espacial superior das medições de pH, pois a localização precisa da ponta do eletrodo pode ser controlada com precisão. Isso permite a maior flexibilidade e reprodutibilidade possíveis nas análises de modelos organoides. Os eletrodos usados aqui são microeletrodos de pH miniaturizados que operam com base na difusão de prótons através de vidro de pH seletivo que envolve um fino fio de platina. O microeletrodo é conectado a um eletrodo de referência Ag-AgCl externo e, em seguida, conectado a um milivoltímetro de alta impedância. O potencial elétrico entre as duas pontas dos eletrodos, quando submersas na mesma solução, refletirá o pH da solução19. Tais sistemas de microperfil têm sido usados na análise metabólica de biofilmes20,21, algas planctônicas22, amostras de escarro humano23 e até mesmo em esferoides de células-tronco mesenquimais24. Tanto nosso laboratório quanto Murphy et al. já usaram microeletrodos de O2 controlados por micromanipuladores para avaliar as concentrações de oxigênio nos espaços luminais dos organoides. Murphy et al. emparelharam este método com modelagem matemática para revelar um gradiente de oxigênio dentro de seus esferóides. Nosso grupo foi capaz de encontrar níveis reduzidos de oxigênio luminal em organoides gástricos derivados de tecidos em comparação com a matriz extracelular circundante25.

Aqui, fornecemos um método detalhado para o perfil manual de microeletrodos do pH luminal em organoides esféricos do trato gastrointestinal que permitirá uma compreensão fisiológica aprimorada de seu complexo microambiente luminal. Prevemos que essa técnica adicionará uma nova dimensão à exploração da fisiologia organoide por meio de medições em tempo real e de alta resolução dos níveis de pH em microescala. Além disso, o protocolo a seguir pode ser facilmente adaptado para a análise de O2, N2O, H2, NO, H2S, redox e temperatura em vários tipos de modelos organoides. O perfil fisiológico serve como uma ferramenta valiosa para otimizar as condições de cultura de organoides para melhor imitar ambientes in vivo , aumentando assim a relevância e a utilidade dos modelos organoides na pesquisa biomédica.

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Protocolo

Este protocolo requer organoides 3D de pelo menos 200 μm de diâmetro que tenham um lúmen distinto e que estejam embutidos em uma matriz extracelular artificial (ECM, por exemplo, Matrigel). Os tecidos gástricos humanos para derivação de organoides foram obtidos com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Montana State University e consentimento informado de pacientes submetidos a endoscopia digestiva alta na Bozeman Health (protocolo # 2023-48-FCR, para DB) ou como amostras isentas de gastrectomia total do estômago inteiro ou gastrectomia vertical do National Disease Research Interchange (protocolo #DB062615-EX). As informações sobre as linhas organoides e os números de passagem usados para este estudo são fornecidas na Tabela 1, e a composição do meio está listada na Tabela 2. Consulte os protocolos publicados anteriormente para a geração e manutenção de linhas organoides gastrointestinais 6,26,27.

1. Preparação de organoides gástricos humanos para perfis de pH

  1. Inicie e mantenha culturas organoides gástricas usando protocolos padrão. Mantenha organoides em placas de 24 poços em 500 μL de meio de expansão por poço (Tabela 2). A passagem estabeleceu linhas organoides a cada 5-7 dias, transferindo-se para um prato de fundo de vidro de 35 mm em preparação para experimentos de perfil de pH.
    NOTA: As culturas organoides para nossos experimentos são derivadas de preparações de glândulas gástricas, que são obtidas de tecido adulto, conforme descrito acima. Usamos um método de digestão do tecido colagenase para isolar essas glândulas antes de serem suspensas na MEC, conforme descrito anteriormente 25,28,29.
  2. A partir de culturas organoides em crescimento ativo nas passagens 1-15, selecione poços que contenham pelo menos 100 organoides (aproximadamente 2 milhões de células) com diâmetros entre 200 e 700 μm para transferência e expansão em placas de Petri de 3,5 mm.
  3. Ao preparar organoides para revestimento (etapas 1.4-1.8), deixe alíquotas de matriz extracelular (ECM) descongelar no gelo por pelo menos 45 min. Mantenha o ECM no gelo durante todo este protocolo para evitar a gelificação. Pré-aqueça as placas de cultura de células colocando-as em uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5%.
  4. Remova o meio dos poços e colha as culturas organoides gástricas pipetando PBS gelado em cada gota de ECM e arranhando o gel com a ponta de uma pipeta P1000. Pipetar o PBS com os fragmentos de ECM contendo organoides para um tubo cónico de 15 ml.
  5. Centrifugue o tubo a 200 × g a 4 °C durante 5 min. Os fragmentos de MEC que contêm os organoides serão visíveis como uma camada no fundo do tubo. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e pipete 350 μL de tripsina-EDTA a 0,25% em cada tubo, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo. Incubar os tubos em banho-maria a 37 °C durante 2-5 min.
  6. Após a incubação com tripsina-EDTA, adicione 600 μL de DMEM gelado com penicilina/estreptomicina a cada tubo e pipete vigorosamente para cima e para baixo pelo menos 40x. Centrifugar a 200 × g a 4 °C durante 5 min. Aspire o sobrenadante. Para configurar culturas para medições de pH, ressuspenda o pellet celular em ECM líquido gelado a uma proporção de 1:4 v/v de pellet organoide para ECM para reforço.
  7. Para cada amostra, colocar 40 μL de ECM líquido contendo organoides/fragmentos de organoides em uma linha horizontal fina ao longo do diâmetro de um prato com fundo de vidro de 35 mm.
    NOTA: Dispensar o gel na placa em uma linha em vez de uma gota redonda permite um acesso mais fácil a organoides individuais, afinando a cultura.
  8. Deixe o gel polimerizar por 15-30 min; em seguida, adicione cuidadosamente 2 mL de meio de expansão organoide à placa, pipetando ao longo da borda do poço para evitar perturbar o gel.
  9. Substitua a mídia a cada dois dias. Aguarde de 4 a 8 dias para que um mínimo de 10 organoides cresça até um diâmetro mínimo de 400 μm.
  10. Para prosseguir com um experimento de perfil de pH, certifique-se de que cada cultura contenha pelo menos 10 organoides que atendam aos seguintes critérios: >200 μm de diâmetro, aparência saudável (pouco ou nenhum material escuro visível dentro dos organoides observados com um microscópio de campo claro) e não superlotado por outros organoides.

2. Desembalagem e calibração de microeletrodos

NOTA: Para permitir medições em microescala, um eletrodo de referência separado é usado além do microeletrodo do sensor de pH, em vez de usar um design integrado (e, portanto, mais volumoso). Tanto o microeletrodo de pH quanto o eletrodo de referência devem ser armazenados úmidos. Não permita a exposição ao ar por mais de 10 minutos de cada vez. Determine o tamanho apropriado da ponta para a aplicação. Aqui, usamos um microeletrodo potenciométrico de pH com diâmetro de ponta chanfrada de 25 μm.

  1. Com o microeletrodo ainda em seu tubo de proteção, inspecione visualmente a ponta quanto a danos.
  2. Conecte o eletrodo de referência ao cabo do eletrodo de pH através do conector. Em seguida, conecte o microeletrodo ao amplificador e o amplificador a um PC aterrado com o software por meio de um cabo USB (Figura 1A).
  3. Encha dois tubos cônicos de 50 mL 2/3 com etanol a 70% e H2O deionizado (diH2O). Coloque o microeletrodo e o eletrodo de referência no tubo diH2O, certificando-se de que ambas as pontas pareçam submersas pelo menos 1 cm no líquido.
    NOTA: Copos altos também podem ser usados para esta e outras etapas semelhantes.
  4. Deixe os eletrodos se equilibrarem por ~ 10 min.
    NOTA: O procedimento também pode ser pausado nesta etapa e retomado posteriormente, pois os eletrodos podem ser armazenados em diH2O.
  5. Enquanto os eletrodos estão se equilibrando, abra o software (ícone vermelho) na estação de trabalho do computador. Na guia Configurações, certifique-se de que a caixa ao lado do microeletrodo esteja marcada, indicando que ele está conectado corretamente e reconhecido pelo software. Clique em Iniciar experimento no canto superior esquerdo da janela e insira o nome e o destino do arquivo desejados. Na janela Configurações de calibração e experimento do sensor , clique em Limpar todos os pontos para preparar o software para uma nova calibração.
  6. Encha dois tubos cônicos de 50 mL 2/3 com tampões de calibração de pH 4,01 e pH 9,21. Seque suavemente o tubo de proteção e o eletrodo de referência com um delicado lenço de laboratório.
  7. Começando com os eletrodos no tampão de pH 4,01, insira 4,01 como o valor de pH conhecido. Assim que a leitura de mV se estabilizar, selecione adicionar ponto. Confirme se o sinal está estável em ~380 mV. Depois que a ponta for adicionada, coloque os dois eletrodos de volta em diH2O para enxaguar e seque novamente.
  8. Repita a etapa anterior com o buffer 9.21 e clique em adicionar ponto quando o sinal estiver estável (~83 mV). Verifique se os microeletrodos respondem linearmente entre pH 4,01 e 9,21; portanto, apenas uma curva de calibração de dois pontos é necessária. Certifique-se de que a linha resultante entre esses pontos tenha uma inclinação negativa de 50-70 mV/unidade de pH. Clique em Salvar e usar calibração.
    NOTA: Agora você está pronto para começar a registrar as medições30.

3. Perfil de pH de organoides gástricos humanos

NOTA: O protocolo a seguir é descrito para um usuário destro. CUIDADO: Desative todas as opções de economia de energia em seu PC, pois as medições contínuas serão interrompidas se o PC entrar no modo de suspensão.

  1. Monte um suporte de anel com um grampo no lado esquerdo de um estereomicroscópio para segurar o eletrodo de referência. Posicione um micromanipulador preso a um suporte de laboratório pesado no lado direito do microscópio (Figura 1A).
  2. Remova cuidadosamente o microeletrodo de seu estojo de proteção, colocando-o na bancada e puxando o estojo em um movimento rápido e rápido.
    CUIDADO: Os microeletrodos são incrivelmente frágeis e deve-se tomar cuidado para garantir que a ponta não entre em contato com material rígido e sólido. Para obter melhores resultados, realize medições em uma bancada robusta, livre de equipamentos que possam causar vibração da bancada ou movimento indesejado dos eletrodos.
  3. Monte o microeletrodo em um micromanipulador e organize o estereoscópio e o micromanipulador de forma que o microeletrodo possa avançar em direção à placa de cultura sem atingir a objetiva ou outras partes do microscópio.
  4. Posicione a placa de cultura contendo os organoides para ter uma visualização adequada do primeiro organoide a ser perfilado (Figura 1B).
  5. Prenda levemente o eletrodo de referência ao clamp no suporte do anel à esquerda do estereoscópio. Posicione o eletrodo de referência de forma que fique no meio ao redor do ECM. Tome cuidado para garantir que isso não interrompa os organoides à medida que o estágio é movido entre as medições.
  6. Olhando diretamente para a placa de cultura (não para o microscópio), avance a ponta do microeletrodo até que esteja suficientemente submerso no meio. Na guia Registrador de dados no software, clique no botão Iniciar (triângulo único apontando para a direita) para iniciar a gravação. Certifique-se de que a caixa de seleção Calibrado esteja marcada no lado direito da tela.
    NOTA: Aguarde ~ 10 s para que cada leitura se estabilize antes de avançar para a próxima região.
  7. Antes de entrar no ECM, certifique-se de que a ponta do eletrodo esteja visível ao microscópio e que esteja posicionada para avançar linearmente em direção ao primeiro organoide de interesse. Avance lentamente o eletrodo para dentro do gel, sem entrar em contato com nenhum organoide. Registre pelo menos três leituras de pH e calcule a média.
  8. Posicione o microeletrodo de forma que esteja preparado para avançar em direção ao primeiro organoide de interesse ao longo do eixo perpendicular à superfície. Deixe o eletrodo fazer um pequeno recuo na superfície epitelial sem penetrar (Figura 1C).
    NOTA: Esta etapa também fornecerá informações sobre se o organoide permanecerá no lugar ou se ele pode se mover mais livremente no ECM.
  9. Com um movimento rápido, avance o microeletrodo para dentro do organoide. Se o organoide se mover ao redor do microeletrodo ou se afastar, tente um ângulo ligeiramente diferente ou apoie-o em outro organoide ou na borda de plástico ao redor do fundo da lamínula do prato. Meça o pH luminal (três vezes individuais) de 10 organoides diferentes para cada condição experimental. Quando terminar de registrar as medições, clique no botão quadrado Parar.
    CUIDADO: Estime o diâmetro do organoide para decidir até onde avançar o eletrodo no lúmen do organoide, tomando cuidado para não perfurá-lo. Para maior precisão, meça o diâmetro com o software da câmera do seu microscópio, se disponível. NOTA: Se a ponta do microeletrodo ficar visivelmente revestida com detritos após uma ou várias medições, lave o microeletrodo em solução de dissociação celular, PBS, EtOH e, em seguida, diH2O antes de prosseguir.

4. Perfil motorizado (opcional)

NOTA: Esta opção requer um micromanipulador montado em um estágio de motor mecânico, que é controlado por software de computador por meio de um controlador de motor31.

  1. Abra o software de criação de perfil (ícone marrom) e inicie um novo experimento na guia Criação de perfil .
  2. As configurações do eixo z reconhecerão automaticamente o motor quando um aparelho do motor estiver conectado corretamente.
    NOTA: O movimento nas direções x e y ainda é controlado manualmente com esta configuração.
  3. Localize a guia Interação do perfil30. Antes de iniciar, certifique-se de que é possível fazer a transição rápida para olhar para a ocular do microscópio para garantir a entrada do organoide na distância desejada. Vá para Configurações de perfil e faça o seguinte:
    1. Indique que a distância inicial é 0 μm.
      CUIDADO: Se a casca epitelial for particularmente resistente a um determinado organoide, o organoide pode ser empurrado para longe ou deformado em vez de penetrado. Se for o caso, continue avançando o eletrodo, mas observe o ponto em que a entrada ocorre, pois o software não pode registrar isso automaticamente.
    2. A julgar pelo tamanho do organoide que está sendo perfilado, indique uma distância final que não seja superior a 3/4 do diâmetro estimado de um organoide.
      NOTA: Esta etapa específica foi projetada para evitar danos à ponta do eletrodo.
    3. Indique o tamanho desejado do passo - 100 μm, conforme mostrado na Figura 2E. Certifique-se de que o tamanho mínimo do passo corresponda ao tamanho da ponta do eletrodo (por exemplo, 25 μm para uma ponta de eletrodo de pH 25 μm 25).
    4. Indique uma posição segura para a qual o motor retornará a ponta do eletrodo entre os perfis.
      NOTA: Esta deve ser uma altura confortável acima da amostra (fora do organoide) onde o sensor pode ser movido com segurança para os lados nas direções x e y com o micromanipulador manual. Deixe o Ângulo do sensor em sua configuração padrão.
    5. Para permitir que o eletrodo se equilibre, indique pelo menos 3 s em Aguarde antes da(s) medida(s).
    6. Defina o (s) período(s) de medição para pelo menos 1 s. As medições durante este período serão calculadas em média.
      NOTA: Se estiver realizando medições em um ambiente com alto ruído elétrico, pode ser útil indicar um período mais longo.
    7. Defina o Atraso entre(s) para pelo menos 1 s.
    8. Defina o número preferencial de réplicas a serem medidas em cada profundidade.
    9. Comece a registrar as medições pressionando o botão Iniciar .

5. Limpeza de eletrodos

  1. Coloque o eletrodo a ser limpo de volta em seu tubo de proteção.
  2. Lave os eletrodos com diH2O após as medições.
  3. Lave os eletrodos com etanol a 70% por alguns minutos.
  4. Enxágue os eletrodos com tampão de pH 4,01.
  5. Enxágue os eletrodos mais uma vez com diH2O antes de prosseguir com as medições.

6. Armazenamento de eletrodos

NOTA: Ambos os eletrodos devem ser armazenados em temperatura ambiente em um local de baixa atividade, protegido contra danos acidentais.

  1. Depois de usar o microeletrodo de pH, deslize-o cuidadosamente horizontalmente de volta ao tubo de proteção (deslizando ao longo da bancada do laboratório para suporte horizontal).
  2. Segurando o microeletrodo na posição vertical (ponta apontada para cima), encha suavemente o tubo de proteção com água estéril. Conecte o tubo de proteção com a rolha que acompanha o eletrodo. Certifique-se de que todos os orifícios no tubo de proteção estejam vedados com fita isolante. Armazene em uma caixa à prova de estilhaços até o próximo uso.
    NOTA: Recomenda-se usar a caixa original em que os eletrodos vieram, pois ela conterá inserções protetoras projetadas para manter os eletrodos no lugar quando armazenados.
  3. Armazene o eletrodo de referência em um béquer ou cilindro graduado cheio com uma solução 3M KCl. Cobrir o copo/cilindro graduado com parafilme para evitar a evaporação da solução.
    NOTA: Se estiver usando um cilindro graduado, é recomendável prendê-lo à bancada do laboratório com fita adesiva para evitar movimentos acidentais.

7. Injeção de vermelho de metila (opcional)

NOTA: O vermelho de metila é um corante indicador colorimétrico que pode ser usado para validar as medições de microeletrodos.

  1. Preencha um capilar de vidro de 2 μL com óleo mineral estéril, carregue-o em um autoinjetor nL controlado por micromanipulador e, em seguida, encha-o com uma solução contendo 0,02% de vermelho de metila e 150 mM de HCl.
    NOTA: A solução deve aparecer vermelha / rosa enquanto estiver no capilar devido à acidez do HCl.
  2. Injectar organoides de pelo menos 300 μm de diâmetro com 9,2 μl da solução25.
  3. Capture imagens ou vídeos usando uma câmera adaptada ao estereomicroscópio (Figura 2G).

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Resultados

A secreção de ácido é uma função crucial do estômago humano. No entanto, até que ponto a secreção ácida pode ser modelada em organoides ainda é uma questão de debate 6,32,33,34. Portanto, desenvolvemos o protocolo detalhado acima para medir com precisão a produção de ácido em organoides gástricos. Notavelmente, usamos organoides derivados de células-tronco adultas não estimuladas cultivadas em ...

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Discussão

O acesso limitado ao espaço luminal dos organoides restringiu severamente nossa compreensão da dinâmica fisiológica desse microambiente. Uma ferramenta confiável para análises funcionais da fisiologia luminal expandirá nossa capacidade de alavancar organoides como modelos in vitro para fisiologia, farmacologia e pesquisa de doenças. Os organoides são modelos fisiologicamente relevantes e altamente ajustáveis, com potencial adicional para replicar a variabilidade genética na população humana. Os métodos existente...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à Dra. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart e Bengisu Kilic por seu trabalho anterior e assistência com os microssensores O2 ; Andy Sebrell pelo treinamento em cultura organoide e micromanipulação; Lexi Burcham pela assistência na cultura de organoides, preparação de meios, registro de dados e organização; e Dra. Susy Kohout para aconselhamento geral em eletrofisiologia. Gostaríamos de agradecer à Dra. Heidi Smith por sua assistência com imagens e reconhecer o Centro de Engenharia de Biofilme Bioimaging da Universidade Estadual de Montana, que é apoiado por financiamento do Programa de Ressonância Magnética da National Science Foundation (2018562), do MJ Murdock Charitable Trust (202016116), do Departamento de Defesa dos EUA (77369LSRIP e W911NF1910288) e do Montana Nanotechnology Facility (um membro do NNCI apoiado pelo NSF Grant ECCS-2025391).

Agradecimentos especiais a toda a equipe da Unisense que tornou este trabalho possível, especialmente ao Dr. Andrew Cerskus, Dra. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dra. Line Daugaard, Dra. Karen Maegaard e Mette Gammelgaard. O financiamento para o nosso estudo foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 GM13140801 (DB, RB) e UL1 TR002319 (KNL), e um Prêmio de Expansão de Pesquisa do Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento Econômico da Universidade Estadual de Montana (DB). A Figura 1A foi criada com o BioRender.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3 M KClUnisense
5 mL Pipeta sorológica oscilante-não, embalada individualmente, papel/plástico, saco, estérilCellTreat229091B
10 mL pipeta sorológica oscilante-não, embalada individualmente, papel/plástico, saco, estérilCellTreat229092B
Tubo de centrífuga de 15 mL - rack de espuma, estérilCellTreat229412
Placa de Cultura de Tecidos de 24 Poços, CellTreat Estéril229124 Pipeta
Sorológica Oscilante de 25 mL, Embalada Individualmente, Papel/Plástico, Saco, EstérilCellTreat229093B
Prato de 35 mm | Nº 1.5 Lamínula | Diâmetro do vidro de 20 mm | TuboMatTekP35G-1.5-20-C
- Rack de Espuma, EstérilCellTreat229422
70% EtanolBP82031GALBP82031GAL
70 μ m Cell Strainer, Embalado Individualmente, EsterilizadoCellTreat229483 
1.000 µ L Pontas de Pipeta de Baixa Retenção de Comprimento Estendido, Rack, EstérilSoluçãoCellTreat 229037
Anfotericina B (Fungizone)HyClone Laboratories, IncSV30078.01
Gabinete de BiossegurançaNuaire NU-425-600Classe II Tipo A / B3
Albumina de soro bovinoFisher BiorreagentesBP1605-100
Solução de recuperação celularCorning354253Solução de dissociação celular
DMEM / F-12 (DMEM avançado)Gibco12-491-015
Modificação de Dulbecco do meio de águias (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Soro Fetal BovinoHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfatoCorning30-234-CR
Sulfato de GentamicinaIBI ScientificIB02030
HEPES, Ácido LivreCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-em-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
Ácido clorídricoFisher Incubadora CientíficaA144C-212
Fisher Scientific11676604
Câmera iPhone 12Apple
L-glutaminaCytivaSH3003401
Grande Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicados Limpadores de Tarefa, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA EstereomicroscópioLeica
Matriz de Membrana Matrigel 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControladorUnisense
Metil vermelho
MM33 MicromanipuladorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Destro
MS-15 Estágio MotorizadoUnisense
Nanoject-IIAutoinjetor de nanolitrosDrummond3-000-204
Penicilina/Estreptomicina (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroeletrodosUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160O software SensorTrace não é compatível com computadores Apple
Eletrodo de referênciaUnisenseREF-RM-001652O software SensorTrace não é compatível com Computadores Apple
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Adaptador de câmera para smartphoneGosky
Especificações Suporte de laboratório LSUnisenseLS-009238
Tripsina-EDTA 0,025%, vermelho de fenolGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc  RASPADORES DE CÉLULAS MINI 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dicloridratoTocris Bioscience12-541-0
µ Kit de Calibração do SensorUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4,01 e 9,21, pacotes de 20 mL
de Centrífuga 50 mL Não Revestido

Referências

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