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Artigo de método

Preparação de Suspensão de Célula Única de Células Epiteliais Tímicas de Camundongo e Coloração de Moléculas Intracelulares para Análise por Citometria de Fluxo

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DOI:

10.3791/66945

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26 de julho de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos protocolos para a preparação de suspensão unicelular de células epiteliais tímicas de camundongo e a coloração de moléculas intracelulares para análise citométrica de fluxo.

Resumo

As células epiteliais tímicas (TECs) desempenham um papel essencial na promoção do desenvolvimento e seleção de repertório de células T. As TECs corticais (cTECs) no córtex tímico induzem o desenvolvimento precoce de células T e a seleção positiva de timócitos corticais. Em contraste, os TECs medulares (mTECs) na medula tímica atraem timócitos selecionados positivamente do córtex e estabelecem autotolerância nas células T. Uma variedade de moléculas, incluindo DLL4 e beta5t expressas em cTECs, bem como Aire e CCL21 expressas em mTECs, contribuem para a função do timo, apoiando o desenvolvimento e a seleção de células T. A análise por citometria de fluxo de moléculas funcionalmente relevantes em cTECs e mTECs é útil para melhorar nossa compreensão da biologia dos TECs, embora os métodos atuais para a preparação de suspensões unicelulares de TECs possam recuperar apenas uma pequena fração dos TECs (aproximadamente 1% para cTECs e aproximadamente 10% para mTECs) do timo de camundongo adulto jovem. Como muitas dessas moléculas funcionalmente relevantes em TECs estão localizadas dentro das células, descrevemos nossos protocolos para a preparação de suspensão de célula única de TECs de camundongo e a coloração de moléculas intracelulares para análise de citometria de fluxo.

Introdução

O timo é um órgão mesenquimal epitelial que promove o desenvolvimento e a seleção de repertório de linfócitos T. Nos microambientes corticais e medulares do timo, as células epiteliais tímicas (TECs) desempenham um papel crucial no direcionamento do desenvolvimento e seleção de células T. É bem aceito que os TECs corticais (cTECs) no córtex tímico contribuem principalmente para a indução do desenvolvimento precoce de células T e seleção positiva de timócitos que expressam o receptor de antígeno de células T (TCR) recém-gerados. Em contraste, os TECs medulares (mTECs) na medula tímica são essenciais para a atração de timócitos selecionados positivamente do córtex e o estabelecimento da autotolerância central, eliminando células T autorreativas e gerando células T reguladoras1,2. Essas funções dos TECs no apoio ao desenvolvimento e seleção de células T são mediadas por uma variedade de moléculas expressas em cTECs e mTECs.

Estes incluem o ligante Delta 4 (DLL4), importante para a especificação da linhagem de células T de progenitores linfoides)3,4, beta5t (também conhecido como Psmb11, importante para a seleção positiva de células T CD8)5,6, e Prss16 (também conhecido como serina protease específica do timo, ou TSSP, importante para a seleção positiva de células T CD4)7,8 expresso em cTECs, e Regulador autoimune (Aire, importante para a expressão promíscua de autogenes)9,10, dedo de zinco da família Fez 2 (Fezf2, importante para a expressão promíscua de autogenes independentes de Aire e a geração de células de tufo tímico)11,12,13,14e ligante de quimiocina de motivo CC 21 (CCL21, importante para a migração medular e acúmulo de timócitos selecionados positivamente)14,15,16 expressos em mTECs. A citometria de fluxo fornece um meio para detectar quantitativamente essas moléculas funcionalmente significativas em TECs, facilitando a avaliação do desenvolvimento e da função de cTECs e mTECs. Uma vez que muitas das moléculas em TECs são expressas principalmente dentro das células, como no citoplasma (por exemplo, componente de proteassoma beta5t) e no núcleo (por exemplo, regulador transcricional Aire), é vantajoso analisar quantitativamente moléculas intracelulares em cTECs e mTECs usando citometria de fluxo.

TECs são raros no timo. Um camundongo fêmea com 5 semanas de idade tem aproximadamente 1 × 106 cTECs e aproximadamente 2,5 × 106 mTECs, enquanto o córtex tímico contém aproximadamente 3 × 108 timócitos CD4 + CD8 + e a medula tímica contém aproximadamente 5 ×10 7 timócitos CD4 + CD8 e CD4-CD8 +17. Portanto, a grande maioria (>99%) das células do timo são células hematopoiéticas, incluindo timócitos, em vez de TECs, em camundongos adultos jovens. Além disso, os TECs estão fortemente associados a células vizinhas (por exemplo, timócitos) e componentes extracelulares arquitetônicos (por exemplo, colágeno) dentro do timo, de modo que a liberação de TECs em suspensão celular requer a digestão da protease do timo. Os métodos convencionais de digestão enzimática produzem apenas uma pequena fração dos COT; aproximadamente 1% (1 × 104) e 10% (2 × 105) para cTECs e mTECs, respectivamente, de timo17,18,19. A baixa eficiência da liberação de TEC do timo provavelmente se deve à suscetibilidade das TEC a enzimas proteolíticas e estresse mecânico e à estreita associação das TEC com células vizinhas, particularmente entre cTECs e timócitos CD4+CD8+20. A este respeito, os resultados da análise de célula única de TECs de camundongos, incluindo análise de citometria de fluxo e análise de sequenciamento de RNA de célula única, com base nos métodos atuais de preparação celular mediada por digestão enzimática, são representativos de apenas uma pequena parte dos TECs e, portanto, estão longe de ser abrangentes. No entanto, apesar de tais limitações na recuperação enzimática de TECs, a análise por citometria de fluxo de TECs de camundongos em suspensão de célula única ainda é útil para a análise quantitativa de moléculas funcionalmente relevantes em cTECs e mTECs. Em suspensão celular, as TECs foram definidas como células positivas para a molécula de superfície epitelial EpCAM (CD326) e negativas para a molécula de superfície hematopoiética CD45. Dentro dos TECs EpCAM+CD45-, os níveis de expressão da superfície celular das moléculas Ly51 (também conhecidas como BP-1 e CD249) e a capacidade de ligação à aglutinina I (UEA1) do Ulex Europaeus (ligação principalmente a glicoproteínas e glicolipídios contendo fucose ligada à α) foram usados para marcar fenotipicamente cTECs (Ly51altoUEA1baixo) e mTECs (Ly51baixoUEA1alto). Aqui descrevemos nossos protocolos experimentais para a preparação convencional de suspensão de célula única de TECs de camundongo e a coloração de moléculas intracelulares para análise de citometria de fluxo, com foco na análise quantitativa de moléculas intracelulares beta5t, CCL21 e Aire em TECs de camundongo recém-preparados.

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Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram realizados sob a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional do Câncer (ASP21-431, ASP21-432 e EIB-076-3).

1. Preparação da suspensão de células do timo

NOTA: A ontogenia do camundongo afeta a eficiência da liberação enzimática de TECs do timo. Três métodos, dependendo da idade do camundongo, são descritos a seguir.

  1. Para camundongos pós-parto com mais de 3 semanas de idade
    1. Colha o timo (dois lóbulos do timo) de um camundongo. Coloque o timo em 5 mL de RPMI1640 contendo 10 mM de HEPES em um prato de plástico de 60 mm no gelo.
    2. Remova sangue, tecidos não timos e gordura com pinças curvas de ponta fina sob um microscópio de dissecação. Corte o timo em pedaços pequenos (aproximadamente 1-2 mm de tamanho) com uma tesoura de dissecação.
    3. Transfira os pedaços de timo para um tubo cônico de 15 mL contendo 3 mL de 1 mg / mL de colagenase / dispase e 1 solução de U / mL de DNase em RPMI1640 contendo 2% de soro fetal bovino (FBS). Incubar em banho-maria ou bloco de calor a 37 °C durante 20 min.
    4. Misture delicadamente usando uma pipeta de transferência de plástico de 3 mL. Incube por mais 20 minutos caso os fragmentos de tecido ainda estejam visíveis.
    5. Misture delicadamente usando uma pipeta de transferência de plástico de 3 mL. Incube por mais 10 minutos caso os fragmentos de tecido ainda estejam visíveis.
    6. Misture delicadamente usando uma pipeta de transferência de plástico de 3 mL. Adicione 5 mL de EDTA 5 mM em 1x HBSS contendo 1% de FBS.
    7. Filtre a suspensão celular através de uma malha de nylon de 60 μm e em um novo tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a suspensão celular a 350 × g a 4 °C durante 5 min.
    8. Ressuspenda o pellet celular em 10 mL de tampão FACS (1x HBSS contendo 1% de albumina de soro bovino [BSA] e 0,1% de NaN3).
    9. Armazene as células no gelo e determine o número das células usando um contador de células.
  2. Para camundongos recém-nascidos entre 1 e 2 semanas de idade
    1. Execute a etapa 1.1.1.
    2. Remova o sangue e os tecidos que não sejam do timo com uma pinça de dissecação sob um microscópio de dissecação. Transfira o timo para um tubo de plástico de 1,5 mL contendo 200 μL de RPMI1640 com HEPES 10 mM e corte o timo em pedaços pequenos (aproximadamente 1-2 mm de tamanho) com uma tesoura de dissecação.
    3. Deixe os fragmentos do timo assentarem no fundo do tubo e, em seguida, remova cuidadosamente a suspensão com uma micropipeta de 200 μL.
    4. Transfira os pedaços de timo para um tubo de fundo redondo de polipropileno de 5 mL contendo 2 mL de colagenase / dispase 0,5 mg / mL e 1 solução de DNase U / mL em RPMI1640 contendo 2% de FBS. Incubar em banho-maria ou bloco de calor a 37 °C durante 10 min.
    5. Misture delicadamente usando uma pipeta de transferência de plástico de 3 mL e, em seguida, com uma micropipeta de 1 mL equipada com uma ponta de plástico para maior homogeneização.
    6. Adicione 2 mL de EDTA 5 mM em 1x HBSS contendo 1% de FBS. Filtrar a suspensão celular através de uma malha de nylon de 60 μm e para um tubo cónico de 50 ml. Adicione 16 mL de RPMI1640 contendo 10 mM HEPES.
    7. Centrifugue a suspensão celular a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Ressuspenda o sedimento celular em 10 ml de tampão FACS.
    8. Armazene as células no gelo e determine o número de células usando um contador de células.
  3. Para camundongos embrionários e camundongos neonatais de até 1 semana de idade
    1. Colha o timo (dois lóbulos do timo) de um camundongo. Coloque o timo em um prato de plástico de 60 mm e remova sangue, tecidos não timos e gordura com uma pinça curva de ponta fina sob um microscópio de dissecação.
    2. Coloque o timo em 0,2 mL de RPMI1640 contendo 10 mM de HEPES em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Descarte o líquido com uma micropipeta de 200 μL.
    3. Adicione 0,5 mL de 0,5 mg / mL de colagenase / dispase e 1 solução U / mL de DNase em RPMI1640 contendo 2% de FBS. Incubar em banho-maria ou bloco de calor a 37 °C durante 10 min. Misture delicadamente usando uma micropipeta de 1 mL com uma ponta de plástico.
    4. Adicione 0,5 mL de EDTA 5 mM em 1x HBSS contendo 1% de FBS. Filtre a suspensão celular através de uma malha de nylon de 60 μm e em um novo tubo cônico de 15 mL. Adicione 9 mL de RPMI1640 contendo 10 mM de HEPES.
    5. Centrifugue a suspensão celular a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Ressuspenda o sedimento celular em 1-3 ml de tampão FACS.
    6. Armazene as células no gelo e determine o número de células usando um contador de células.
  4. Método alternativo: Digestão de Liberase
    1. Execute as etapas 1.1.1 e 1.1.2.
    2. Deixe os fragmentos do timo assentarem no fundo do tubo; em seguida, remova suavemente a suspensão com uma micropipeta de 200 μL. Transfira os pedaços de timo para um tubo de 5 mL contendo 1 mL de 0,5 U / mL de Liberase e 1 U / mL de DNase em RPMI1640 contendo 10 mM de HEPES. Incubar em banho-maria ou bloco de calor a 37 °C durante 15 min.
    3. Misture delicadamente usando uma micropipeta de 1 mL com uma ponta de plástico. Incube por mais 15 minutos caso os fragmentos de tecido ainda estejam visíveis.
    4. Misture delicadamente usando uma micropipeta de 1 mL com uma ponta de plástico. Adicione 1 mL de EDTA 5 mM em 1x HBSS contendo 1% de FBS.
    5. Filtre a suspensão celular através de uma malha de nylon de 60 μm e em um novo tubo cônico de 50 mL. Adicione 18 mL de RPMI1640 contendo 10 mM de HEPES.
    6. Centrifugue a suspensão celular a 350 × g, 4 °C por 5 min. Ressuspenda as células em 10 mL de tampão FACS (1x HBSS contendo 1% de BSA e 0,1% de NaN3).
    7. Armazene as células no gelo e determine o número de células usando um contador de células.

2. Coloração de anticorpos das células do timo

  1. Coloque 16 × 106 células em um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL. Centrifugar as células a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
  2. Adicione 10 μL de concentração de trabalho de anticorpo monoclonal anti-receptor Fc (mAb, clone 2.4G2) no tampão FACS para bloquear a ligação inespecífica de coloração de IgG ao receptor Fc de superfície celular. Incubar a 4 °C durante 5 min.
  3. Adicione 40 μL de cada uma das concentrações de trabalho de mAb anti-CD45 (específico da célula hematopoiética; por exemplo, marcado com BV421), mAb anti-EpCAM (específico da célula epitelial; por exemplo, marcado com PE-Cy7), mAb anti-Ly51 (detecção de cTEC; por exemplo, marcado com AF647) e aglutinina I de Ulex europaeus (UEA-1) (detecção de mTEC; por exemplo, marcado com AF594) no tampão FACS. Paralelamente, prepare tubos para células coradas de cor única e células não coradas para configurar um citômetro de fluxo.
  4. Incubar a 4 °C durante 45 min. Misturar bem a cada 10 min. Adicionar 2 ml de tampão FACS.
  5. Centrifugar as células a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante.
  6. Adicione 1 μL de Ghost Dye Violet 510 (para distinguir células viáveis de células mortas na análise de citometria de fluxo de células fixas e permeabilizadas). Use reagente Ghost Dye não diluído; misture bem. Incubar a 4 °C durante 30 min; misture bem a cada 10 min.
  7. Adicione 2 mL de tampão FACS. Centrifugar células a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
  8. Fixe as células adicionando 1 mL de paraformaldeído a 2% (PFA) em PBS e incubando em temperatura ambiente por 10 min.
  9. Adicionar 3,5 ml de PBS ao tubo e centrifugar as células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Rejeitar o sobrenadante.
  10. Permeabilize as células adicionando 1 mL de tampão de fixação/permeabilização intracelular e incubando a 4 °C por 20 min.
  11. Centrifugar as células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Rejeitar o sobrenadante.
  12. Adicione 1 mL de 1x tampão de permeabilização. Centrifugar as células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Descarte o sobrenadante.
  13. Adicione 100 μL de cada uma das concentrações de trabalho do anticorpo anti-beta5t ou anticorpo anti-CCL21, ou 40 μL das concentrações de trabalho do anticorpo anti-Aire (por exemplo, marcado com AF488), em 1x tampão de permeabilização, misture bem e incube por 60 min em temperatura ambiente.
  14. Adicione 1 mL de 1x tampão de permeabilização. Centrifugar as células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Descarte o sobrenadante.
  15. Repita a etapa 2.14.
  16. Adicione 100 μL de concentrações de trabalho de IgG anti-coelho (por exemplo, marcado com AF555) e incube por 30 min em temperatura ambiente.
  17. Adicione 1 mL de 1x tampão de permeabilização. Centrifugar as células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Descarte o sobrenadante.
  18. Ressuspenda as células em 200 μL de FACS Buffer e misture bem.
  19. Conservar as células na obscuridade a 4 °C até à análise por citometria de fluxo.
  20. Filtre as células através de malha de nylon de 60 μm antes da análise por citometria de fluxo.

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Resultados

A análise requer um citômetro de fluxo que permita a detecção de pelo menos seis canais de fluorescência (para CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye e beta5t, CCL21 e/ou Aire), bem como os parâmetros de dispersão para a frente e dispersão lateral. Os perfis citométricos representativos de células de timo digeridas com colagenase/dispase provenientes de camundongos com 0 dia de vida e de camundongos com 2 semanas de vida são mostrados na Figura 1 e na Figura 2, resp...

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Discussão

A colagenase, com ou sem Dispase, é amplamente utilizada para digerir o timo de camundongo para preparar TECs 4,5,9,18,21. A liberase, que contém uma mistura de proteases, incluindo colagenase, também é usada para digerir o timo para preparar TECs17,22. O uso de colagenase e liberase fornece rendimento...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Izumi Ohigashi pela leitura do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural ZIA BC 011806 dos Institutos Nacionais de Saúde, do Instituto Nacional do Câncer e do Centro de Pesquisa do Câncer.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Colagenase/Dispersão Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Conjunto de Buffer de Coloração de Fator de TranscriçãoeBioscience00-5523-00
Corante Fantasma Violeta 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 anti-camundongo CD45 anticorpo monoclonal, Clone 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 anti-camundongo Ly51 anticorpo monoclonal, Clone 6C3BioLegend108312
PE / Cy7 anti-camundongo EpCAM / CD326 monoclonal anticorpo, Clone G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Aglutinina I (UEA1)Vetor LaboratóriosDL-1067-1
Alexa Fluor 488 anti-mouse Aire monoclonal anticorpo, Clone 5H12eBioscience53-5934-82
Anti-mouse Psmb11 / beta5t anticorpo monoclonal de coelho, Clone CPTC-PSMB11 (mouse) -1NIH NCICPTC-PSMB11 (mouse) -1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Anti-mouse CCL21 / exodus 2 anticorpo policlonal de coelhoBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-coelho IgG anti-coelho de corrente pesada cabra recombinante anticorpoInvitrogenA27039
Anti-Mouse CD32/CD16 - ndash; Purificado (Fc Block Antibody)Leinco TechnologiesC247
Nylon Mesh 60 MicronComponent SupplyW31436
Equipamento
ThermomixerEppendorfBloco
Celómetro Auto 2000 Contador de viabilidade celularNexcelomContagem
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesCitômetro de fluxoCinco lasers (355, 408, 488, 595 e 637 nm)
FACSDiva software versão 9.0.1BD BiosciencesAnálise
FlowJo 10.9.0BD Biosciencesdados de citometria de fluxo
Taxa de diluição de anticorpos (concentração de trabalho)de diluição
Anti-Mouse CD32/CD16 – Purificado (anticorpo de bloqueio Fc)1:40FACS Buffer
BV421 anti-camundongo CD45 anticorpo monoclonal1:25FACS Buffer
PE / Cy7 anti-camundongo EpCAM / CD326 anticorpo monoclonal1:100FACS Buffer
Alexa Fluor 647 anti-camundongo Ly51 anticorpo monoclonal1:100FACS Buffer
DyLight 594 Ulex Europaeus Aglutinina I (UEA1)1:400FACS Buffer
Anti-mouse CCL21 / exodus 2 anticorpo policlonal de coelho1:2001x Permeabilization Buffer
Anti-mouse Psmb11 / beta5t anticorpo monoclonal de coelho, Clone CPTC-PSMB11 (mouse) -11:10001x Permeabilization Buffer
Alexa Fluor 555 anti-coelho IgG anticorpo recombinante de cabra de cadeia pesada1:4001x Permeabilization Buffer
BufferPropósito
RPMI1640 contendo 10 mM HEPES Para preparação
RPMI1640 contendo 2% de FBSPara preparação
FACS buffer (1x HBSS contendo 1% de BSA  e azida de sódio a 0,1%)Para preparação celular e coloração de
1 mg / ml de colagenase / dispase e solução de DNase 1U / ml em RPMI1640 contendo 2% de FBSPara digestão
2% de PFA em PBSPara fixação
Tampão de fixação / permeabilização (1 parte de concentrado de fixação / permeabilização com 3 partes de diluente de fixação / permeabilização)Para fixação celular
1x Tampão de Permeabilização (1 parte de concentrado 10X com 9 partes de água destilada)Para coloração de anticorpos intercelulares 
de calorde células viáveispor citometria de fluxo Análise de Tampão de célulasde célulasanticorposenzimáticacelular

Referências

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