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Investigando a angiogênese em nível funcional e molecular, aproveitando o ensaio de migração de feridas por arranhões e o ensaio de brotamento de esferóides

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DOI:

10.3791/66954

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31 de maio de 2024

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1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta o ensaio de migração bidimensional (2D) e o ensaio tridimensional (3D) de brotamento esferóide, juntamente com seus respectivos métodos de análise a jusante, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica, como ensaios adequados para estudar a angiogênese in vitro.

Resumo

A angiogênese desempenha um papel crucial nos processos fisiológicos e patológicos do corpo, incluindo o crescimento do tumor ou a doença ocular neovascular. Uma compreensão detalhada dos mecanismos moleculares subjacentes e modelos de triagem confiáveis são essenciais para direcionar doenças de forma eficaz e desenvolver novas opções terapêuticas. Vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para modelar a angiogênese, capitalizando as oportunidades que um ambiente controlado oferece para elucidar os fatores angiogênicos em nível molecular e rastrear alvos terapêuticos.

Este estudo apresenta fluxos de trabalho para investigar a angiogênese in vitro usando células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Detalhamos um ensaio de migração de feridas por arranhões utilizando um sistema de imagem de células vivas que mede a migração de células endoteliais em um ambiente 2D e o ensaio de germinação de esferóides avaliando o brotamento de células endoteliais em um ambiente 3D fornecido por uma matriz de colágeno. Além disso, delineamos estratégias para a preparação de amostras para permitir análises moleculares adicionais, como transcriptômica, particularmente no ambiente 3D, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica. Ao todo, essa estrutura oferece aos cientistas um conjunto de ferramentas confiável e versátil para realizar suas investigações científicas em ensaios de angiogênese in vitro .

Introdução

A angiogênese, que se refere à formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes1, é um processo crucial durante o desenvolvimento fisiológico e as condições patológicas. É indispensável para fornecer energia a tecidos altamente metabolicamente ativos, como a retina2 ou o sistema nervoso central em desenvolvimento3 e durante a cicatrização de tecidos danificados4. A angiogênese anormal, por outro lado, é a base de inúmeras doenças. Tumores sólidos, como câncer colorretal ou câncer de pulmão de células não pequenas, facilitam seu crescimento e o suprimento energético necessário, promovendo a angiogênese5. Além do câncer, doenças neovasculares do olho, como retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada à idade, que representam as principais causas de cegueira no mundo desenvolvido, resultam do crescimento aberrante dos vasos 6,7. Uma compreensão detalhada do mecanismo patológico subjacente é crucial para compreender como a angiogênese fisiológica pode ser aprimorada, por exemplo, na cicatrização de feridas, controlando melhor as condições patológicas, como doenças oculares vasoproliferativas.

Em nível celular, as células endoteliais vasculares são ativadas por várias moléculas de sinalização na angiogênese, iniciando a proliferação e migração celular8. As células subsequentemente se organizam em uma hierarquia, com células de ponta não proliferativas formando filopódios na borda de ataque do ramo do vaso em desenvolvimento8. Ao lado, as células do pedúnculo de rápida proliferação seguem as células da ponta, contribuindo para a formação do vaso emergente. Posteriormente, outros tipos de células, como pericitos ou células musculares lisas, são recrutados para estabilizar ainda mais o ramo nascente9.

Para explorar os processos moleculares no nível das células endoteliais vasculares, vários protocolos in vitro foram desenvolvidos e recentemente revisados10. Esses ensaios geralmente se enquadram em duas categorias: abordagens 2D mais simplistas, mas escaláveis, e protocolos 3D mais elaborados. Em um projeto recente, realizamos uma análise comparativa abrangente entre o ensaio de migração de feridas por arranhões 2D e o ensaio de brotamento esferóide 3D11 para avaliar a extensão de suas diferenças e sua capacidade de modelar vários aspectos da angiogênese12.

Embora ambos ofereçam as vantagens de serem confiáveis e facilmente implementáveis, em nível molecular, o ensaio de germinação de esferóides 3D foi favorável para abordar aspectos-chave da angiogênese em comparação com dados in vivo, como interruptores metabólicos ou interações célula-matriz. Uma vez que os ensaios de angiogênese in vitro são usados para avaliar o potencial angiomodulador das vias de sinalização13 e para rastrear agentes terapêuticos, a transferibilidade dos resultados in vitro para ambientes in vivo é essencial. Além disso, a oportunidade de análises baseadas em ômicas nos níveis de RNA e proteína para caracterizar as mudanças moleculares em resposta à modulação direcionada de processos angiogênicos sob condições controladas continua sendo um benefício importante em comparação com as configurações in vivo 14,15.

Nesta publicação, apresentamos ensaios-chave para explorar questões relacionadas à angiogênese por meio da utilização de um ensaio de migração de imagem de células vivas e um ensaio de brotamento esferóide, incluindo análises moleculares subsequentes, como sequenciamento de RNA para análise transcriptômica e imuno-histoquímica no nível da proteína.

Protocolo

1. Cultura de células HUVEC

NOTA: Execute todas as etapas a seguir em condições de trabalho estéreis (bancada de trabalho estéril).

  1. Expansão de HUVECs
    1. Para ambos os ensaios de angiogênese, use células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) ou células endoteliais microvasculares humanas (HMVECs).
    2. Cultive as células até atingirem 90% de confluência em um frasco T75 não revestido com meio de crescimento de células endoteliais (EGM) antes de realizar uma divisão. Realize a mudança média 3 vezes por semana.
      NOTA: Para acelerar o crescimento, o meio pode ser trocado diariamente. Não use HUVECs além da sexta passagem. O estudo recebeu os resultados mais consistentes executando todos os experimentos com HUVECs da mesma passagem.
  2. Divisão de HUVECs
    1. Quando as HUVECs atingirem a confluência desejada no frasco T75, lave-as uma vez com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguida de incubação das células com tripsina a 0,5% por 2 min na incubadora.
      NOTA: A exposição prolongada à tripsina pode danificar a função HUVEC.
    2. Retire suavemente as células batendo no frasco. Confirme o descolamento bem-sucedido sob um microscópio de contraste de fase invertida.
    3. Adicione 8 mL de EGM, transfira a solução para um tubo e coloque as células em pellets por centrifugação a 250 x g por 3 min.
    4. Se a contagem de células for necessária, ressuspenda as células em 5 mL de EGM e use uma câmara de Neubauer. Caso contrário, adicione 40 ml de EGM e distribua-o em 4 balões de cultura de células T75 frescos.

2. Ensaio de migração de feridas por arranhões

NOTA: O ensaio de migração de arranhões requer uma duração de 3 dias para ser concluído (Figura 1). Execute todas as etapas a seguir em condições de trabalho estéreis (bancada de trabalho estéril).

  1. Revestimento e fome de células (dia 1)
    1. Usando uma placa especializada de 96 poços para imagens de células vivas, semeie 20.000 HUVECs em 100 μL de EGM por poço. Deixe as células assentarem por 6 h na incubadora.
      NOTA: É aconselhável otimizar o número de células considerando a velocidade variável do crescimento das células endoteliais vasculares entre fornecedores e laboratórios. O objetivo é obter uma monocamada perfeita no dia seguinte antes de iniciar o arranhão. Poços superpovoados podem alterar o comportamento das células endoteliais, por exemplo, por inibição de contato16, enquanto uma monocamada incompleta dificulta drasticamente a análise.
    2. Deixar todos os poços de fome durante a noite com 100 μL de EBM por poço suplementado com 2% de FBS.
      NOTA: Tenha cuidado para não danificar a monocamada celular, especialmente ao usar uma pipeta multicanal.
  2. Preparando soluções de estimulação (dia 2)
    1. Diluir as substâncias desejadas e os controles em meio basal de crescimento de células endoteliais (EBM) suplementado com 2% de FBS. Para cada alvéolo, utilizar 100 μL de solução.
      NOTA: A EBM suplementada com 2% de FBS serve como controle negativo, enquanto o fator de crescimento endotelial vascular humano recombinante (VEGF) a 25 ng/mL pode ser usado como controle positivo. Usando placas de 96 poços, recomenda-se que os experimentos sejam projetados com um mínimo de réplicas técnicas (4 poços com condições idênticas), embora seja sugerido que 8 sejam usados para obter resultados ótimos. Esforce-se para minimizar possíveis efeitos de borda ou canto ao planejar o layout.
  3. Criando o zero (dia 2)
    1. Verifique as células ao microscópio para verificar uma monocamada celular confluente e a viabilidade celular. Posicione a placa de 96 poços em uma ferramenta de fabricação de 96 poços e gere o arranhão pressionando a alavanca do dispositivo. Levante cuidadosamente a tampa da ferramenta de criação de feridas antes de soltar a alavanca para evitar arranhões duplos.
    2. Lave todos os poços duas vezes usando 200 μL de EBM por poço suplementado com 2% de FBS. Confirme ao microscópio se os detritos foram removidos com êxito.
  4. Estimulação celular (dia 2)
    1. Adicione 100 μL das soluções de estimulação ou controle preparadas por poço.
  5. Exames de imagem (dia 2-3)
    1. Adquira imagens uma vez por hora por um período de até 24 horas usando uma programação automatizada fornecida pelo microscópio de imagem de células vivas.
      NOTA: Para garantir uma boa qualidade de imagem, digitalize todos os poços imediatamente após transferi-los para a incubadora que abriga o sistema de imagem de células vivas. Um tempo de aclimatação de 30 minutos na incubadora ajuda a obter uma melhor qualidade de imagem. O software do microscópio é programado para adquirir uma imagem por hora para cada poço na linha média do arranhão definido.
  6. Na ausência de uma ferramenta de criação de feridas e um gerador de imagens de células vivas, siga as etapas descritas abaixo.
    1. Use uma ponta de pipeta em uma placa de 24 poços para induzir um arranhão. Tire imagens com um microscópio clássico de cultura de células em intervalos específicos. Para isso, utilize um microscópio motorizado equipado com recursos precisos de rastreamento x e y. Isso permite o posicionamento automático, garantindo uma captura de imagem consistente em locais predefinidos.
      NOTA: Quando a imagem manual é necessária, é uma opção viável obter apenas imagens de T0, bem como um ponto de tempo 'x' horas após o tratamento. No protocolo descrito usando HUVECs, o ponto de tempo T12 (12 h pós-estimulação) foi um ponto de tempo atraente com uma separação clara entre controle negativo e positivo estimulado por VEGF. No entanto, recomenda-se a execução de experimentos de curso de tempo inicial com imagens a cada 2 h ou 1 h para determinar o ponto de tempo ideal para as configurações experimentais específicas em cada laboratório.
  7. Análise (dia 3)
    1. O software do microscópio de imagem de células vivas pode permitir a análise direta das imagens adquiridas. Defina máscaras delineando o gramado celular, o arranhão inicial e as regiões de densidade relativa da ferida. Determine os limites das células com base nas diferenças de contraste.
      NOTA: Um ajuste de segmentação de 1,6, um arquivo de furo de 500 μm2, um tamanho ajustado de 1 pixel, uma área >500 μm e uma excentricidade >0,6 foram usados para experimentos executados com HUVECs. A verificação visual completa dos parâmetros de detecção de células em relação às imagens reais é essencial. Com configurações otimizadas, o software calcula automaticamente a densidade relativa da ferida (RWD) ao longo do tempo e gera gráficos temporais correspondentes com o desvio padrão (DP) das réplicas técnicas. Esses dados podem ser usados para análise estatística.

3. Extração de RNA com células cultivadas em 2D

NOTA: Execute todas as etapas a seguir até a etapa 3.3 em condições de trabalho estéreis (bancada de trabalho estéril).

  1. Células de revestimento (dia 1)
    1. Separe os HUVECs de acordo com a etapa 1.2 do protocolo de cultura de células HUVEC.
    2. Semeie 50.000 células por poço em uma placa de 12 poços com 2 mL de EGM por poço.
    3. Troque o meio após 6 h para EBM contendo 2% de FBS (mídia faminta) para morrer de fome durante a noite.
  2. Tratamento das células (dia 2)
    1. Diluir agentes de interesse em EBM suplementados com 2% de FBS. Substitua o meio faminto pela diluição preparada e incube as células pelo tempo desejado em uma incubadora.
  3. Extração de RNA (dia 2-3)
    1. Lisar as células com 750 μL de Trizol por poço e incubar durante 10 min num agitador orbital.
    2. Ressuspenda as amostras com uma pipeta de 1000 μL algumas vezes e armazene-as em tubos específicos de RNA de baixa ligação (volume de 1,5 mL). Conservar a -80 °C.

4. Imunocitoquímica com células cultivadas 2D

NOTA: Execute todas as etapas a seguir até a etapa 4.4 em condições de trabalho estéreis (bancada de trabalho estéril).

  1. Preparação de lamínulas
    1. Incubar 100 lamínulas com diâmetro de 12 mm em hidróxido de potássio a 5% em metanol em tubo de 50 mL por 30 min agitando a solução aplicada.
      NOTA: Este é um passo muito importante na desprotonação da superfície das lamínulas e na melhoria das condições de revestimento e cultura. Neste ponto, é altamente recomendável garantir que as lamínulas estejam bem distribuídas dentro do meio e não fiquem secas e coladas.
    2. Lave as lamínulas por 30 min 4 vezes com água desmineralizada.
    3. Após a lavagem, transfira-os para uma solução isopropílica a 70% para armazenamento.
  2. Revestimento de lamínulas
    1. Encostar as lamínulas individualmente à parede de uma placa de Petri quadrada para permitir a evaporação do álcool isopropílico.
    2. Após 5 minutos, transfira as lamínulas para uma placa de 24 poços (uma lamínula por poço). Aplicar 1 ml de uma solução de 10 mg/ml de colagénio I em PBS em cada alvéolo e incubar durante 60 min a 37 °C.
    3. Em seguida, lave as lamínulas 4-5 vezes por 5 min com PBS.
  3. Cultivando células
    1. Retire os HUVECs seguindo os procedimentos descritos na etapa 1.2 do protocolo de cultura de células HUVEC.
    2. Semeie 50.000 células por poço em uma placa de 24 poços com 2 mL de EGM por poço.
    3. Após 6 h, mude o meio para EBM contendo 2% de FBS para permitir que as células se liguem ao poço e deixem as células morrerem de fome durante a noite.
    4. No dia seguinte, diluídos os agentes de interesse em MBE suplementados com 2% de FBS. Substitua a solução de fome nos alvéolos pela diluição preparada e incube as células pelo tempo desejado em uma incubadora.
  4. Fixação e bloqueio
    1. Cultive as células pelo tempo desejado e, em seguida, lave as células com PBS por 5 min.
    2. Fixe as células com paraformaldeído a 2% (PFA) em PBS por 20 min em temperatura ambiente (RT).
    3. Lave com PBS 3-4 vezes por 5 min.
    4. Incubar amostras com tampão de bloqueio contendo 5% de soro de cabra normal (NGS), 0,1% de Triton-X-100 em PBS por 1 h em RT.
      NOTA: Nesta etapa, é importante lavar as amostras para garantir que o PFA seja removido completamente. Escolha a espécie do soro com base na origem do anticorpo secundário.
  5. Mancha
    1. Incubar as amostras durante a noite a 4 °C no tampão de bloqueio com o anticorpo primário.
    2. No dia seguinte, para remover qualquer anticorpo primário não ligado, lave as amostras 3-4 vezes com PBS por 5 minutos cada.
    3. Em seguida, incubar as amostras por 1 h em RT com o anticorpo secundário correspondente e a Faloidina-FITC, diluídos juntos no tampão de bloqueio.
    4. Lave mais 3-4 vezes.
    5. Inverta as lamínulas nas lâminas com uma pequena gota de meio de montagem contendo DAPI, deixe secar no escuro e sele com esmalte. Armazene as amostras no escuro a 4 °C.

5. Ensaio de brotamento esferóide

NOTA: O ensaio de germinação esferóide requer 3 dias para ser concluído (Figura 2). Execute todas as etapas a seguir até a etapa 5.7 em condições de trabalho estéreis (bancada de trabalho estéril).

  1. Gerando esferoides em gotas suspensas (dia 1)
    1. Retire os HUVECs seguindo os procedimentos descritos na etapa 1.2 do protocolo de cultura de células HUVEC.
    2. Combine 200.000 células com 8 mL de EGM e 2 mL de solução estoque de metocel, garantindo uma mistura completa. Consulte o dossiê suplementar 1 para obter instruções sobre como preparar a solução-mãe de methocel.
    3. Dispense gotículas de 25 μL da solução na superfície interna invertida de uma placa de Petri grande e quadrada. Gire suavemente a tampa em 180° e posicione-a no fundo do recipiente de cultura de células de forma que as gotículas fiquem penduradas. Coloque o recipiente em uma incubadora de cultura de células durante a noite.
  2. Prepare o gel de colágeno (dia 2)
    1. Misture bem 2,3 mL de colágeno de cauda de rato tipo I com 0,280 mL de 10x Medium 199 até que a mistura atinja uma tonalidade amarela consistentemente uniforme. Mantenha esta mistura no gelo durante todo o processo.
  3. Titular o gel de colágeno (dia 2)
    1. Titular a mistura para obter um pH fisiológico, indicado por uma cor laranja, usando NaOH (2 N).
    2. Adicione 50 μL de tampão HEPES ao produto final.
      NOTA: Para garantir uma faixa dinâmica ideal para o ensaio, é imperativo aproximar-se o mais próximo possível de um pH fisiológico. Vários lotes de colágeno podem exigir diferentes quantidades de NaOH. Mantenha a mistura estritamente congelada durante todo o processo e homogeneamente misturada o tempo todo.
  4. Colhendo esferóides (dia 2)
    1. Enxágue as gotas penduradas nas tampas de cultura de células com 20 mL de PBS.
    2. Centrifugue a solução por 7 min a 250 x g. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os esferóides em 0,1 mL de FBS e 0,4 mL de EGM batendo suavemente no tubo.
    3. Adicione 2 ml de solução-mãe de methocel e misture bem. Use uma pipeta com capacidade mínima de 5 mL para evitar danificar os esferoides.
  5. Adicionando esferoides à matriz de colágeno 3D (dia 2)
    1. Adicione 2 mL da mistura de colágeno preparada aos esferoides ressuspensos e misture bem.
    2. Dispense 0,5 mL da mistura resultante nos poços de uma placa de 24 poços e incube em uma incubadora de células por 30 min.
  6. Estimulando esferoides em uma matriz de colágeno 3D (dia 2)
    1. Prepare uma diluição das substâncias desejadas em EBM. Para cada alvéolo, utilizar 100 μL de solução.
      NOTA: A MEE serve como controle negativo, enquanto o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) a 25 ng/mL (concentração final em 500 μL de matriz de colágeno e 100 μL de camada de MBE) pode ser usado como controle positivo.
    2. Incubar pelo tempo desejado.
      NOTA: Em um ensaio padrão, recomenda-se 18-24 h, mas o tempo precisa ser cuidadosamente otimizado em cada laboratório.
  7. Imagem de esferoides (dia 3)
    1. Utilize um microscópio invertido e uma plataforma de imagem para capturar imagens de todos os esferoides que não estão em contato com a borda do poço, entre si ou mostram sinais de danos. Mantenha configurações e níveis de zoom consistentes em todas as condições.
  8. Análise (dia 3)
    1. Utilize a ferramenta de medição no ImageJ Fiji para determinar o comprimento de todos os brotos de cada esferóide em cada imagem.
      NOTA: Use o plugin fornecido no Arquivo Suplementar 2, que torna a análise mais eficiente e gera uma saída .txt arquivo.
    2. Importe os dados para uma planilha, R ou qualquer outro software preferido e use o comprimento médio cumulativo de todos os brotos por esferóide como leitura para cada condição.
      NOTA: Os resultados de diferentes géis não podem ser combinados na forma de comprimentos absolutos de germinação. Os dados de cada grupo de tratamento precisam ser normalizados para o grupo de controle EBM ou VEGF (comprimento relativo da germinação) antes que os dados possam ser mesclados.

6. Extração de RNA com células cultivadas em 3D

  1. Ensaio de brotação esferóide
    1. Realize o ensaio de germinação esferóide conforme descrito na seção 5.
  2. Lise do gel de colágeno
    1. Lave os géis esferóides com PBS quente por 5 min.
    2. Corte os géis esferóides em quartos e transfira todos os 4 quartos para um tubo de 50 mL. Use um bisturi para a dissecção mecânica dos géis.
    3. Trate as amostras de gel com solução de lise (contendo 2 mg / mL de colagenase D em PBS) e incube por 45 min a 37 ° C em um agitador.
    4. Lave os géis suavemente com PBS suplementado por 2 mM de EDTA para interromper a reação do tampão de lise.
  3. Extração de RNA
    1. Ressuspenda os géis lisados em 750 μL de Trizol e incube por 10 min para garantir uma extração de RNA suficiente, conforme descrito na etapa 3.3.
    2. Ressuspenda as amostras com uma pipeta de 1000 μL algumas vezes e transfira as amostras para tubos de RNA específicos de baixa ligação (volume de 1,5 mL). Armazene amostras a -80 °C.

7. Imunocitoquímica de esferoides em uma matriz de colágeno 3D

  1. Ensaio de brotação esferóide
    1. Realize o ensaio de germinação esferóide conforme descrito na seção 5.
  2. Fixação e bloqueio
    1. Fixe os géis com 4% de PFA em PBS por 1 h.
      NOTA: Para garantir uma boa fixação das células do gel, os géis precisam ser destacados cuidadosamente nas laterais dos poços com bisturi e pinça após o enxágue com PBS.
    2. Lave os géis suavemente 3-4 vezes com PBS e, em seguida, separe-os totalmente da superfície dos poços e transfira-os para novas placas de 24 poços.
    3. Incubar géis por 1 h em RT com a solução de bloqueio (contendo 5% de NGS e 0,1% de Triton-X-100 em PBS) em um agitador orbital.
  3. Mancha
    1. Incubar as amostras durante a noite a 4 °C num agitador orbital com o anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio.
      NOTA: Virar os géis durante esta incubação não melhorou a qualidade da coloração.
    2. No dia seguinte, lave os géis suavemente 4-5 vezes com PBS por 5 minutos cada.
    3. Incubar o anticorpo secundário correspondente, diluído com faloidina-FITC, em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C num agitador orbital.
    4. Realize 4-5 etapas de lavagem adicionais com PBS.
    5. Transfira os géis para lâminas de microscópio e monte-os com duas gotas de meio de montagem contendo DAPI em uma lamínula colocada em cada gel. Deixe as amostras secarem antes de selar com verniz e guarde-as no escuro a 4 °C.
  4. Microscopia
    1. Imagem de todas as amostras em um microscópio confocal. Use o objetivo 20x e concentre-se na região de interesse. Adquira imagens como pilhas Z, bem como imagens de plano focal individuais.
      NOTA: A aquisição de imagens de pilha Z e plano focal em várias seções ao longo da amostra 3D é essencial para capturar a representação completa, especialmente para amostras 3D espessas.

8. Células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMVECs)

NOTA: Todas as etapas descritas também podem ser realizadas com células endoteliais microvasculares, por exemplo, células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMVECs). Nesse caso, o meio precisa ser trocado por um meio de células endoteliais microvasculares específico contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) para cultivo, bem como etapas específicas em cada ensaio. As diferenças específicas do HRMVEC para os protocolos de ensaio são descritas abaixo:

  1. Ensaio de ferida por arranhões
    1. Cultive células em meio de células endoteliais microvasculares FBS a 10% em vez de EGM.
    2. Semeie 20.000 células/poço.
    3. Não deixe as celas morrerem de fome durante a noite.
    4. Após realizar o arranhão, troque o meio por meio de células endoteliais basais contendo 5% de FBS em vez de EBM com 2% de FBS.
  2. Imunocitoquímica de HRMVECs cultivados em 2D
    1. Cultive as células em meio de células endoteliais microvasculares a 10% em vez de EGM.
    2. Não deixe as celas morrerem de fome durante a noite.
    3. Troque o meio logo antes do tratamento para EBM + 5% FBS em vez de EBM + 2% FBS.
  3. Ensaio de brotação esferóide
    1. Semeie as células como gotas suspensas com meio de células endoteliais microvasculares contendo 10% de FBS em vez de EGM.
  4. Imunocitoquímica de esferoides em uma matriz de colágeno 3D
    1. Semeie as células como gotas suspensas com meio de células endoteliais microvasculares contendo 10% de FBS em vez de EGM.

Resultados

Para o ensaio de migração, é crucial examinar minuciosamente as imagens capturadas no ponto de tempo t = 0 h para garantir que a presença de uma monocamada celular totalmente formada seja detectada com precisão pelo sistema (Figura 1B). Além disso, a clareza e a retidão da borda de arranhões devem ser confirmadas (Figura 1B). A área livre de células deve estar amplamente livre de detritos. Ao final do ensaio, um grupo estimulado com, por exemplo, 25 ng/mL de VEGF como controle positivo deve apresentar migração bem-sucedida na área original arranhada (Figura 1B). Um exemplo de problemas técnicos pode se manifestar como crescimento celular irregular, arranhões duplos ou ondulação nas bordas do arranhão (Figura 1C). Além disso, é importante estabelecer uma faixa dinâmica substancial entre o controle negativo (amostras estimuladas por EBM) e o controle positivo (amostras de VEGF) (Figura 1D). Em nossa configuração experimental, consideramos um aumento de 25% no RWD após 12 h como uma faixa ideal (Figura 1D). Em um ensaio técnico problemático, os controles positivo e negativo não se separam corretamente, indicando uma baixa faixa dinâmica (Figura 1E).

Coloração imunocitoquímica de HUVECs em lamínulas, visualizada em microscópio de fluorescência para validar a coloração bem-sucedida (Figura 1F). É importante pesquisar a maioria das células e identificar uma região característica da lâmina. A especificidade da coloração é avaliada usando uma lâmina de controle tratada apenas com um anticorpo secundário para excluir ligação inespecífica (Figura 1F). Sinais de coloração específicos devem ser examinados criticamente de acordo com a localização subcelular conhecida da proteína-alvo. Usamos padrões de localização subcelular junto com a ausência de sinal na amostra controle como índices de um protocolo de imunocoloração bem-sucedido.

Da mesma forma, certos aspectos devem ser considerados para ensaios de germinação de esferóides de alta qualidade. A qualidade deve, neste caso, ser avaliada no final do ensaio, por exemplo, t = 24 h. A matriz de colágeno observada ao microscópio deve apresentar homogeneidade e não deve parecer friável ou áspera (Figura 2B). Os esferoides estimulados apenas com meio basal como controle negativo e 25 ng/mL de VEGF como controle positivo devem ser claramente distinguíveis (Figura 2B). Além disso, os esferoides devem flutuar no gel e não cair no solo, onde se dispersam, indicando baixa qualidade (Figura 2C). Esse problema geralmente surge do resfriamento inadequado do colágeno durante a titulação da mistura ou da titulação excessiva ou insuficiente do pH (Figura 2C). Um mínimo de 10 esferoides por poço deve ser imageável para cada poço. O controle negativo (amostras estimuladas por EBM) deve demonstrar uma taxa de germinação basal moderada, enquanto o VEGF, servindo como controle positivo, idealmente dobra ou, de preferência, triplica o RSL em comparação com os controles (Figura 2D, gráfico à esquerda). O número de brotos também deve mostrar uma faixa dinâmica semelhante (Figura 2D, gráfico à direita). Um ensaio técnico abaixo do ideal não mostrará essa faixa dinâmica entre os controles e poderia, portanto, levar a uma falsa interpretação dos dados (Figura 2E).

Colorações análogas a 2D, exame das lâminas em microscópio de fluorescência e avaliação crítica das estruturas coradas são de grande importância para o sucesso da coloração (Figura 2F). Se a localização celular das estruturas e a intensidade do sinal em comparação com o controle forem compreensíveis, pode-se supor que a coloração foi bem-sucedida.

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Figura 1: O ensaio de migração de feridas por arranhões de células vivas. (A) Esquema do ensaio de migração de feridas por arranhões. (B) Imagens mostrando uma réplica técnica de alta qualidade em t = 0 h e t = 12 h. As células foram estimuladas com 25 ng/mL de VEGF para servir como controle positivo. (C) Exemplos de dois replicados técnicos de baixa qualidade em t = 0 h devido a arranhões inadequados ou arranhões duplos. (D) Resultados de um ensaio de migração de arranhões bem-sucedido. A separação correta do controle positivo estimulado com 25 ng/mL de VEGF e do controle negativo apenas tratado com meio basal foi ainda visualizada por um gráfico de violino em t = 12 h. Os dados incluem 7-8 réplicas técnicas por grupo. (E) Resultados exemplares destacando um ensaio de migração de arranhões com falha. A separação subótima do controle positivo estimulado com 25 ng/mL de VEGF e o controle negativo apenas tratado com meio basal foi visualizada por um gráfico de violino em t = 12 h. Os dados incluem 7-8 réplicas técnicas por grupo. (F) Imagens exemplares de HUVECs semeadas em lamínulas e coradas para DAPI, faloidina e VEGF-R2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: O ensaio de brotamento esferóide. (A) Esquema do ensaio de germinação de esferóides. (B) Imagens mostrando o controle negativo (esferóides estimulados pelo meio basal) e o controle positivo (esferóides estimulados com VEGF 25 ng / mL) de um ensaio técnico ideal no final em t = 24 h. (C) Exemplos de dois esferóides de baixa qualidade em t = 24 h. As imagens à esquerda visualizam um esferóide danificado que caiu no fundo da placa, o que resulta em um corpo esferóide solto e uma taxa de brotamento anormalmente aumentada. A imagem à direita visualiza o colágeno com manchas de cor perceptíveis, criando um ambiente altamente heterogêneo que compromete significativamente a qualidade do ensaio. (D) Análise do RSL (gráfico da esquerda) e número de brotos (gráfico da direita) de um ensaio bem-sucedido com uma boa faixa dinâmica entre o controle negativo e positivo. Os dados são visualizados usando um gráfico de violino e incluem 10-25 esferóides por grupo. (E) Análise do RSL (gráfico da esquerda) e do número de brotos (gráfico da direita) de um ensaio técnico problemático com uma faixa dinâmica subótima entre controle negativo e positivo. Os dados são visualizados usando um gráfico de violino e incluem 10-25 esferóides por grupo. (F) Imagens exemplares de HUVECs do ensaio de brotamento esferóide corado para DAPI, faloidina e VEGF-R2.c

Processo suplementar 1: Instruções para a preparação da solução-mãe de metocel. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: plug-in SpheroidCount.ijm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste relato, apresentamos um espectro de técnicas com leituras funcionais e moleculares para estudar a angiogênese in vitro.

O ensaio de migração representa uma técnica bem estabelecida usada em todos os campos do trabalho de laboratório úmido. Escolhemos a abordagem de imagem de células vivas disponível comercialmente para aproveitar o formato de 96 poços adequado para experimentos de triagem e dose-resposta, o tamanho padronizado e reprodutível da ferida criado pela ferramenta WoundMaker, a oportunidade de observar a cinética de migração por meio de imagens de lapso de tempo em até 24 horas, bem como o software automatizado de quantificação de imagens. No entanto, é necessária a presença de um sistema de imagem de células vivas equipado com software de análise de angiogênese no laboratório ou em uma instalação central. Numerosas configurações experimentais alternativas foram estabelecidas que não requerem microscópios específicos de imagem de células vivas ou outros equipamentos especiais10.

Com base em nossa experiência, é crucial otimizar as configurações do analisador, pois os HUVECs e outros tipos de células endoteliais vasculares tendem a fornecer contraste ruim, dificultando assim a leitura automatizada pelo software do microscópio. Para resolver esse problema, uma etapa adicional de coloração de fluorescência (por exemplo, coloração de células vivas) pode ser introduzida. Os sistemas de imagem de células vivas suportam essa coloração e até mesmo a coloração multicolorida para rastrear uma proteína de interesse. Uma das principais limitações do ensaio é que a diferenciação entre migração e proliferação celular nem sempre é direta e que os resultados do ensaio representam uma combinação de ambos os processos. A solução de imagem de células vivas usada neste estudo tenta resolver esse problema introduzindo a densidade relativa da ferida (RWD). Em contraste com a confluência tradicionalmente usada na área arranhada, o RWD avalia a confluência dentro da área arranhada em relação à área externa arranhada. A migração na área arranhada eleva a RWD aumentando a confluência dentro dela e, ao mesmo tempo, reduzindo a confluência fora da área arranhada devido à migração celular. Por outro lado, a proliferação celular também aumenta a confluência fora da área arranhada, diminuindo assim a RWD. É importante reconhecer isso como uma abordagem de análise estratégica para apenas diminuir o impacto da proliferação na leitura final. Ensaios complementares de proliferação podem ser necessários para resolver esse problema. Alternativamente, inibidores do ciclo celular, como a mitomicina C, podem ser adicionados ao ensaio para bloquear a proliferação. A implementação de protocolos com esses inibidores precisa ser cuidadosamente otimizada em cada laboratório para alcançar o efeito desejado sem reduzir a faixa dinâmica do ensaio. Além disso, ao aumentar a frequência de varredura de cada poço, essa configuração oferece uma oportunidade facilmente implementável de rastrear com precisão as células em movimento em um nível individual, se esse rastreamento detalhado for de interesse particular.

Embora o ensaio de migração de imagem de células vivas demonstre a vantagem da escalabilidade e análises automatizadas e imparciais, nosso estudo anterior destacou a capacidade do ensaio de brotamento esferóide de capturar detalhes mais intrincados da angiogênese. Isso inclui aspectos fundamentais como formação de células de ponta e pedúnculo, interação célula-matriz e um interruptor glicolítico12. Para garantir a reprodutibilidade do ensaio, um investigador deve ter experiência na preparação da matriz de colágeno, pois variações no pH e na temperatura durante esse processo podem afetar os resultados. Além disso, a análise é realizada manualmente. A análise de imagem é, portanto, demorada e contém o risco de viés. O mascaramento adequado das condições durante a análise é essencial para evitar a introdução de viés. Para resolver essa preocupação, propusemos recentemente uma abordagem baseada em rede neural para identificar e mitigar possíveis vieses na análise de ensaios de germinação, que pode ser facilmente implementada17. Em conclusão, a melhor abordagem para validar os resultados é combinar os dois ensaios. No entanto, é crucial reconhecer que as diferenças podem surgir devido à natureza distinta das configurações 2D e 3D12.

Como existe uma ampla seleção de ensaios de angiogênese in vitro 2D e 3D, é importante considerar as vantagens e desvantagens dos ensaios apresentados em comparação com outros métodos. O ensaio de arranhão, por exemplo, concentra-se na migração horizontal 2D em um prato de plástico, enquanto o ensaio da câmara de Boyden caracteriza a migração vertical através de uma inserção de malha com um quimioatraente na "câmara externa". Com base em sua configuração e leitura simples, o ensaio de arranhadura permite experimentos de alto rendimento, particularmente em seu formato de 96 poços, proporcionando alta reprodutibilidade, bem como a possibilidade de visualizar o experimento e realizar um lapso de tempo. Infelizmente, as desvantagens do ensaio de ferimento por arranhão são a dificuldade em diferenciar entre proliferação e migração, a necessidade de células aderentes e, na ausência de uma ferramenta de ferimento, maior variabilidade devido a arranhões desiguais. A leitura do Ensaio de Câmara de Boyden tem a vantagem de medir o efeito quimiotático de substâncias solúveis em células móveis18 e destaca tanto a invasão quanto a migração. Infelizmente, as desvantagens são a baixa reprodutibilidade e a alta variância do ensaio, a incapacidade de visualizar o movimento das células, o alto número de células migradas necessárias para obter um sinal, a configuração e leitura bastante longas e elaboradas, bem como a falta de oportunidade para uma configuração de lapso de tempo19.

O ensaio de germinação esferóide quantifica o brotamento de células endoteliais em uma matriz de gel 3D, enquanto o ensaio de formação de tubo caracteriza a formação de tubos celulares na superfície de uma matriz de gel20. O ensaio de germinação tem a vantagem de caracterizar a invasão de células em uma matriz, bem como a proliferação e migração. As desvantagens são a maior variância do gel de colágeno titulado e, com base nisso, a qualidade dos esferoides. A vantagem do ensaio de formação de tubos é a formação de tubos vasculares após um período de tempo distinto (dependente da citocina) e uma abordagem fácil. As desvantagens são a falta de invasão de células e o efeito do próprio Matrigel na formação do tubo21.

Todos os experimentos apresentados foram realizados com HUVECs. É bem sabido que existem diferenças significativas no comportamento das células endoteliais vasculares de diferentes origens (por exemplo, macro-vascular vs. micro-vascular)22,23. Assim, pode ser necessário validar os resultados experimentais com outras linhagens de células endoteliais vasculares. As configurações experimentais foram transferíveis para endotelial microvascular da retina humana (HRMVECS), exceto pelo fato de que HRMVECs requerem concentrações mais altas de FBS. Por outro lado, a linhagem de células endoteliais da aorta bovina (BAECs) comumente usada não pôde ser usada no ensaio de brotação de esferóides devido a uma taxa de germinação basal excessiva.

Ambos os ensaios apresentados compartilham a limitação de estarem confinados a um único tipo de célula. Dado que a angiogênese in vivo é um processo multicelular intrincado, esse aspecto crucial não é capturado com precisão por nenhum dos ensaios. Variações de co-cultura para ambos os ensaios foram desenvolvidas, com foco particular no ensaio de brotamento esferóide, e recentemente discutidas 10,24. Alternativamente, validar os dados diretamente em modelos relevantes de angiogênese in vivo representa uma opção viável. Os ensaios estabelecidos para esse fim incluem o modelo de camundongo para retinopatia induzida por oxigênio (OIR)25, o modelo de neovascularização coroidal induzida por laser (Laser-CNV)26 e o ensaio deplugue27.

No geral, tanto o ensaio de migração de imagem de células vivas 2D quanto o ensaio de germinação de esferóides 3D, em conjunto com as ferramentas de análise molecular apresentadas, oferecem uma plataforma robusta para pesquisa de angiogênese e são amplamente reconhecidos na comunidade de angiogênese. A combinação desses ensaios com análises in vivo subsequentes para validar os achados fornece uma base sólida para a investigação de questões específicas relacionadas à angiogênese.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses neste projeto.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Sophie Krüger e Gabriele Prinz pelo excelente suporte técnico. Agradecemos a Sebastian Maier por desenvolver o plugin ImageJ para quantificar brotos de esferóides e ao Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), Departamento de Medicina I, Hospital Universitário de Freiburg pelo uso do sistema IncuCyte. Os gráficos foram criados com biorender.com. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 para F.B.], a Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Programa Berta-Ottenstein para Cientistas Clínicos e Cientistas Clínicos Avançados para F.B.], a Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 para F.B.], o German Cancer Consortium [bolsa CORTEX para Cientistas Clínicos para J.R.] e a Volker Homann Stiftung [para J.N.+F.B.] e a "Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg e.V." [para P.L.]

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-conjugado AffiniPure F(ab)' 2-FragmentoJackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Colágeno Tipo 1 cauda de ratoCorning354236
Collagenase DRoche 
Meio Basal de Células EndoteliaisLonzaCC-3156EBM
Meio de Crescimento de Células EndoteliaisLonzaCC-3162EGM
Ácido etilenodiaminotetracético Serva11290.02EDTA
Soro fetal bovinoBio& VENDAS 0615FBS
Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana, agrupadasPlacas LonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock de 96 poços Sistema4379
Sartorius
MethocelSigmam-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium com 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Faloidina-Fluoresceína Isotiocianato Marcado (0.5 mg/mL Metanol)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Solução salina tamponada com fosfatoThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Células endoteliais microvasculares retinianas humanas primáriasSistemas celularesACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant com NucBlueInvitrogen por ThermoFisher Scientific2260939
Reagentede lise QIAzolQIAGEN79306
Fator de Crescimento Endotelial Vascular Humano RecombinantePeproTech100-20VEGF
Placa de Petri QuadradaGreiner688102
TrizolQiagen79306
TripsinaPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493
11088858001 de Análise de Células Vivas Incucyte S3 Sartorius

Referências

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