Novos recursos no Visual Dynamics 3.0

Summary

O Visual Dynamics é uma ferramenta de código aberto que acelera implementações e aprendizado em simulação de dinâmica molecular usando Gromacs. O protocolo apresentado irá guiá-lo através das etapas para realizar uma simulação proteína-ligante preparada no ACPYPE com facilidade e etapas gerais para outros modelos de simulação.

Abstract

A Dinâmica Visual (VD) é uma ferramenta web que visa facilitar o uso e a aplicação da Dinâmica Molecular (MD) executada no Gromacs, permitindo que usuários sem familiaridade computacional executem simulações de curta duração para fins de validação, demonstração e ensino. É verdade que os métodos quânticos são os mais precisos. No entanto, atualmente não há viabilidade computacional para realizar os experimentos que o MD realiza. A ferramenta descrita aqui tem recebido melhorias contínuas ao longo dos últimos dois anos. Este protocolo descreverá o que é necessário para executar uma simulação em VD com um complexo proteína-ligante previamente preparado em ACPYPE e algumas direções gerais sobre os outros modelos de simulação disponíveis. Para a simulação detalhada, será utilizada a proteína ligadora de FK506 de Plasmodium vivax complexada com o inibidor D5 (PDB ID: 4mgv), e todos os arquivos utilizados serão fornecidos. Observe que este protocolo dirá todas as opções a serem usadas para alcançar os mesmos resultados apresentados, mas essas opções não são necessariamente as únicas disponíveis.

Introduction

De acordo com a definição da IUPAC, MD é o procedimento de simulação que consiste em calcular o movimento de átomos em uma molécula ou de átomos individuais ou moléculas em sólidos, líquidos e gases, de acordo com as leis do movimento de Newton. As forças que atuam sobre os átomos, necessárias para simular seu movimento, são comumente calculadas usando campos de força da mecânica molecular¹. Pode ser aplicado a qualquer fenômeno que busque extrair informações em nível molecular e muitas vezes atômico².

A DM é uma das técnicas incorporadas à bioinformática, especificamente à bioinformática estrutural. Com ele, é possível obter características cinéticas e termodinâmicas de estruturas biomoleculares. Por exemplo, estabilidade macromolecular, identificação de sítios alostéricos, elucidação de mecanismos de atividade enzimática, reconhecimento molecular e propriedades de complexos com pequenas moléculas, associação entre proteínas, enovelamento de proteínas e sua hidratação³. Além disso, a DM permite uma ampla gama de estudos, incluindo o design molecular (amplamente utilizado no design de medicamentos), na determinação da estrutura e seu refinamento (raios-X, RMN e modelagem de proteínas)³. Os resultados obtidos ao final de um MD são os mais ricos e completos em termos de simulação não quântica⁴. A DM clássica é muito mais eficiente do que se poderia esperar de uma consideração completa da física dos sistemas biomoleculares devido ao número de aproximações substanciais. Notavelmente, os efeitos dinâmicos quânticos são geralmente ignorados³. No entanto, implementar um experimento de MD não é trivial⁵. Requer conhecimento de computação, especialmente o Terminal Linux, já que a maioria dos softwares de bioinformática estrutural é feita para isso. Mesmo com esse conhecimento, aprender os comandos e a parametrização do Gromacs é outra curva de aprendizado íngreme.

Desde sua primeira aplicação à biologia em 1977⁶, muito evoluiu devido ao aumento do processamento computacional e à codificação aprimorada. Há mais de duas décadas, foi lançado o primeiro software MD destinado a problemas biológicos, ou seja, Gromacs⁷, AMBER⁸ e NAMD⁹.

Desde suas primeiras versões, esses softwares ainda continuam sendo os mais usados e citados. No entanto, eles continuam com as mesmas dificuldades comuns de implementação que afligem os pesquisadores que não são especialistas em computação⁵. Alguns têm etapas complexas de instalação e configuração, às vezes exigindo amplo conhecimento sobre o hardware em que serão executados para obter o máximo dele e documentação técnica altamente centrada no computador. É necessária uma maneira mais fácil de interagir com eles, além da linha de comando e dos parâmetros infinitos.

Uma interface atua como intermediária entre o processo lógico a ser realizado e o humano¹⁰. O paradigma de como o software é executado evoluiu à medida que os recursos de computação melhoraram. O primeiro paradigma digital foram as interfaces de linha de comando (CLI), seguidas pela evolução para as interfaces gráficas de usuário (GUI) ^conhecidas11. Seguindo o ciclo evolutivo, a interface produzida pela World Wide Web (ou simplesmente WEB) é considerada uma evolução das GUIs¹¹. Esses três paradigmas atualmente coexistem dependendo dos desenvolvedores. Os aplicativos CLI usam comandos textuais no console do sistema operacional. Os aplicativos GUI, também chamados de áreas de trabalho gráficas, usam uma interface gráfica composta de janelas, botões e outros componentes. É específico e pré-programado para um sistema operacional. A principal diferença da CLI é o uso do mouse como elemento adicional na interação homem-máquina¹². As aplicações WEB, apesar de serem confundidas com uma GUI, são mais complexas de desenvolver, mas são mais versáteis e de longe as mais ágeis em operação. Além disso, dependem apenas de um software intérprete denominado navegador, que possibilita que a aplicação cliente se comunique com o servidor por meio de uma rede independente do sistema operacional¹³.

O software de bioinformática estrutural geralmente usa paradigmas CLI e GUI. Alguns exemplos de software clássico que usam CLI são o Modeller¹⁴ para modelagem de similaridade, o Autodock¹⁵ para acoplamento molecular e o Gromacs¹⁶ para dinâmica molecular. Exemplos de softwares que adotam o tipo GUI são SwissPDBviewer¹⁷, Pymol¹⁸, VMD¹⁹, UCSF Chimera²⁰, Autodock tools¹⁵, PyRx²¹, Biovia²², Maestro²³ e Moe²⁴, entre outros.

Com o surgimento das tecnologias Hypertext Markup Language versão 5 (HTML5)²⁵, Cascading Style Sheets (CSS)²⁶ e Javascript²⁷ , entre outras, muitas aplicações de bioinformática estrutural puderam ser trazidas para a WEB, tornando-se assim mais acessíveis. Exemplos de modelagem de similaridade de servidores WEB são o MODWEB²⁸, que usa o Modeller¹⁴ como back-end e o Swissmodel²⁹. Exemplos de servidores de aplicativos da Web para docking molecular são Haddock³⁰, Swissdock³¹, Cluspro³², Dockthor³³ e outros.

Enquanto as metodologias de análise estrutural, modelagem e encaixe evoluíram dos paradigmas CLI para GUI e, finalmente, para WEB, o MD continua a ser suportado principalmente pela execução de linha de comando (tipo CLI). Algumas boas iniciativas têm surgido para melhorar esse panorama. Exemplos dessas iniciativas são a implementação de plug-ins em softwares existentes, como o plug-in QwikMD para VMD³⁴, o plug-in GROMACS para PyMOL e a opção Molecular Dynamics Simulation no UCSF Chimera²⁰, alguns aplicativos CLI novos e mais fáceis, como ASGARD³⁵, Gmx_qk³⁶ e CHAPERONg³⁷, e uma plataforma web robusta, BioBB-Wfs³⁸. Embora o uso desses plugins e aplicativos seja um avanço, sua implementação ainda é um desafio para a maioria dos pesquisadores não qualificados. Dificuldades comuns incluem problemas na instalação e configuração do software MD, que muitas vezes comprometem a execução completa da simulação⁵.

Em 2022, o software Visual Dynamics para simulação computacional baseada na web foi disponibilizado pelo Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal da Fiocruz Rondônia³⁹. Sua versão inicial foi construída em Python e Flask, permitindo simulações de sistemas com proteínas livres (apoenzimas) por apenas 2 ns. Posteriormente, foi aprimorado para incluir uma versão de simulação automatizada com ligantes preparados usando PRODRG⁴⁰.

O VD foi construído para auxiliar todos os pesquisadores da área de biofísica estrutural, biotecnologia e áreas afins que possuem limitações no conhecimento computacional; a ferramenta permite que esses pesquisadores testem suas hipóteses envolvendo simulações de MD a partir de qualquer sistema operacional e sem acesso a um computador de alto desempenho (HPC). O objetivo deste trabalho é apresentar as novas funcionalidades do Visual Dynamics versão 3.0. Além disso, visa introduzir um protocolo de uso atualizado para a ferramenta e destacar as limitações a serem abordadas no futuro, juntamente com as estatísticas de uso até o presente momento (Figura 1).

Protocol

1. Acesso ao software e registro de novo usuário

1. Visite a página da Web do Visual Dynamics (VD). Clique no ícone +Registrar no canto superior direito para criar uma conta. Registre-se para usar o software.
   NOTA: Somente endereços de e-mail institucionais são permitidos. O usuário receberá uma notificação por e-mail assim que seu registro for aprovado.
2. Clique em Login no canto superior direito para acessar a tela de login do sistema. Preencha os campos de nome de usuário/e-mail e senha e clique em Entrar. Após o login, o usuário terá acesso à sua área de envio de simulação. Eles também podem visualizar tutoriais e estatísticas de uso do VD.

2. Submissão de simulação de apoenzima

1. Clique em Nova Simulação na barra lateral esquerda. Na tela que aparece, clique no botão APO, que se refere à apoenzima.
2. Carregue o arquivo 4mvg.pdb de proteína grátis. Selecione o campo de força AMBER94 (ou qualquer outra opção apropriada).
   NOTA: 4mvg.pdb pode ser obtido no Arquivo Suplementar 1 ou baixado diretamente do Protein Data Bank (PDB).
3. Selecione o modelo de água TIP3P. Selecione a caixa cúbica. Selecione a distância de 0,5 nm entre a proteína e a borda da caixa.
   NOTA: As opções selecionadas são apenas sugestões. Todas as outras opções funcionam no VD.
4. Marque a opção Executar em Nossos Servidores para executar a simulação com os arquivos e parâmetros enviados. Após clicar em Executar simulação, o usuário verá a evolução das etapas da simulação na tela e receberá uma notificação por e-mail sobre o status da simulação após a conclusão.

3. Submissão de Simulação de Enzima Complexada com Ligante Preparado em ACPYPE

1. Usando o UCSF Chimera²⁰, abra o complexo proteína-ligante 4mgv.pdb⁴¹, em Selecionar, clique em Resíduo e defina o código como D5I. Em seguida, em Arquivo, clique em Salvar PDB, selecione Salvar Somente Átomos Selecionados, defina o nome do arquivo como ligand.pdb e clique em Salvar.
2. Envie o arquivo ligand.pdb gerado na etapa anterior para o servidor Bio2Byte ACPYPE⁴², a partir dos arquivos de saída, ligand_NEW.itp e ligand_NEW.pdb serão os utilizados e fornecidos neste experimento.
   NOTA: Os arquivos ligand_NEW.itp e ligand_NEW.pdb podem ser obtidos no Arquivo Suplementar 2 e no Arquivo Suplementar 3.
3. Clique em Nova Simulação na barra lateral esquerda. Clique no botão Proteína + Ligante (preparado em ACPYPE).
4. Carregue o arquivo 4mvg.pdb de proteína grátis. Selecione os Arquivos Ligantes preparados no ACPYPE: ligand_NEW.itp e ligand_NEW.pdb. Selecione o campo de força AMBER94.
5. Selecione o modelo de água TIP3P. Selecione a caixa cúbica. Selecione a distância de 0,5 nm entre a proteína e a borda da caixa. As opções selecionadas são apenas sugestões. Todas as outras opções funcionam no VD.
6. Marque a opção Executar em Nossos Servidores para executar a simulação com os arquivos e parâmetros enviados. Após clicar em Executar simulação, o usuário verá a evolução das etapas da simulação na tela e receberá uma notificação por e-mail sobre o status da simulação após a conclusão.

4. Acessando os resultados da simulação

1. Clique em Minhas simulações na barra lateral esquerda.
2. Clique em Baixar arquivos MDP para baixar os arquivos de configuração de simulação usados pela plataforma para o computador do usuário.
3. Faça o download dos elementos de simulação conforme descrito abaixo.
   1. Clique em Comandos para baixar a lista de comandos executados pela plataforma para o computador do usuário.
   2. Clique em GROMACS Log para baixar o arquivo de log que contém as saídas do comando .gmx em sequência para o computador do usuário.
   3. Clique em Resultados para baixar arquivos gerados por comandos .gmx, como _npt.gro, _pr.edr, _pr.tpr, _pr_PBC.gro e pr_PBC.xtc para o computador do usuário.
   4. Clique em Figura Gráfica para baixar gráficos para analisar cada etapa da simulação em formato de imagem e .xvg para o computador do usuário.

Results

O VD fornece uma execução de simulação totalmente autônoma que não requer intervenção do usuário ou recursos computacionais fornecidos pelo usuário. Depois de enviar uma simulação para execução, o usuário pode deixá-la, desligar suas máquinas e a simulação continuará em execução. Ele também permite que os usuários acessem os resultados de qualquer dispositivo, seja um laptop ou dispositivo móvel.

Como exemplo de uso de VD em modo automatizado através da WEB, o teste foi feito para um complexo proteína-ligante preparado em ACPYPE usando a estrutura da proteína de ligação FK506 de Plasmodium vivax complexada com o inibidor D5 (PDB ID: 4mgv)⁴¹. O preparo seguiu o protocolo descrito, e os resultados da análise são mostrados na Figura 2A-D.

A Figura 2A representa o desvio quadrático médio da raiz (RMSD) entre a estrutura inicial da proteína e sua simulação ao longo de 5 ns (conforme fixado no sistema). A estrutura proteica exibiu um RMSD inferior a 2,5 Å durante toda a simulação. A Figura 2B exibe o Raio de Giro (Rg), que descreve a compactação da proteína durante a simulação de 5 ns. Este gráfico mostra Rg nas três coordenadas, x, y e z, bem como o valor geral. A Figura 2C ilustra a Flutuação Quadrática Média da Raiz (RMSF) que representa a distância média de flutuação de cada aminoácido na estrutura da proteína durante a simulação de 5 ns. A Figura 2D mostra a variação de energia em kJ/mol para o sistema durante o processo de minimização de energia usando o método de descida mais íngreme. A partir deste gráfico, observamos que o sistema se estabilizou com uma força máxima inferior a 1000 kJ/mol/nm.

Outro caso de uso é quando o usuário deseja executá-lo em seu próprio servidor com o Gromacs instalado. Essa forma de uso não foi abordada neste protocolo, pois requer um nível moderado de conhecimento sobre o Terminal Linux e os aplicativos CLI. Este método usa VD como um gerador de comandos Gromacs modificáveis que alcançam o mesmo resultado que VD quando executados como gerados. Eles baixam os arquivos MDP e o arquivo que contém os comandos gerados (Figura 3A). Tudo está disponível em VD. Quando eles o executam no terminal Linux, eles obtêm resultados como a Figura 3B.

Figura 1: Usando o VD para gerar scripts de comando. (A) Lista de comandos gerados no VD quando a opção de download da lista de comandos é escolhida. (B) Exemplo de saída da execução de um comando. Basta copiar, colar e executar no prompt local do Linux. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estatísticas de acesso e uso do Visual Dynamics. Mais de 4 mil usuários de IP único de cerca de 63 países já acessaram o VD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplos de gráficos de saída relacionados à análise automática de VD. (A) Desvio quadrático médio (RMSD) ao longo de 5 ns. (B) Raio de giro (Rg) ao longo de 5 ns. (C) Flutuação da raiz quadrada média (RMSF) ao longo de 5 ns. O eixo x do gráfico RMSF representa o número de aminoácidos na enzima e as saídas do software de imagem com um tamanho mínimo. Se a proteína for maior, o eixo x aumentará. (D) Variação de energia durante o processo de minimização de energia. A variação de energia termina quando o processo atinge um valor adequado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Fluxograma simplificado do processo que o Visual Dynamics usa para configurar uma nova simulação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Fluxograma simplificado do processo que o Visual Dynamics usa para gerenciar a execução de simulações enfileiradas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Arquivo de proteína pdb. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Arquivo Ligante itp. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Arquivo pdb do ligante. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Automatizar processos não é fácil, mas também é menos difícil do que reprogramar um sistema do zero. Gromacs é atualmente o software de simulação molecular mais popular e é constantemente atualizado. O Departamento de Química Biofísica da Universidade de Groningen inicialmente o desenvolveu, e agora é mantido pelo Laboratório de Ciências da Vida da Universidade de Estocolmo⁴³.

Para qualquer novo usuário, aprender técnicas de simulação é uma longa jornada. A VD surge como uma alternativa para facilitar esse processo de aprendizagem, bem como para validar experimentos antes de investir recursos na execução de simulações por períodos mais longos. Os usuários podem executar 5 ns de simulação e, assim, avaliar a utilidade de estender ainda mais a simulação.

A automação de concatenações e passagem de parâmetros para comandos Gromacs só é possível através da forma como o Linux fornece e permite o gerenciamento de seu terminal. Um dos principais recursos do VD que permitiu a automação total pode ser visto na Figura 3B. Em uma abordagem manual, é necessário que o usuário interaja no início da execução para escolher os grupos a serem analisados¹⁶. Nesse caso, o grupo 4 (Backbone) foi selecionado como padrão. Para ignorar essa etapa e automatizar a interação do usuário, o comando echo "4 4" é passado para o comando .gmx nos bastidores, juntamente com uma ferramenta de concatenação conhecida como pipe (|) na própria linha de comando. Isso é útil para programadores que desejam desenvolver uma ferramenta semelhante ao VD e permite a automação e emulação da interação do usuário.

Atualmente, o VD está limitado a executar simulações com duração de 5 ns no servidor WEB. Na versão anterior, esse limite era de apenas 2 ns³⁹. Se for necessário um tempo de simulação mais longo, é recomendável baixar o script e os arquivos MDP para execução na própria máquina do usuário com o Gromacs instalado. As opções Neutralizar sistema e Ignorar hidrogênios estão sempre ativadas e não podem ser desativadas. Da mesma forma, a opção Usar precisão dupla está sempre desativada. Essas opções são mostradas para informar o usuário. Por motivos de desempenho, eles são fixos. A versão atual não realiza simulações com ligantes preparados em campos de força OPLS ou CHARMM. Esta limitação é puramente técnica e temporária.

Estruturalmente, o VD tem dois aplicativos: um front-end da web, que é o aplicativo que o usuário vê, e um back-end de servidor, que é o aplicativo que fará o trabalho árduo de configurar e executar o MD. O front-end da web é uma interface simples com formulários para coletar o que os usuários desejam fazer por meio de seleções, alternâncias e seletores de arquivos; O fluxograma do front-end da web será omitido por enquanto, conforme descrito, passo a passo no protocolo.

O back-end do servidor é composto por dois serviços: um aplicativo para gerenciar e configurar MDs e outro para gerenciar e executar MDs simultaneamente. A Figura 1 suplementar mostra o fluxo necessário para configurar um MD e a Figura 2 suplementar mostra o fluxo do aplicativo de fila de execução.

Existem também outras ferramentas automatizadas/web para executar o MD além do Visual Dynamics, cada uma com seu próprio conjunto de prós e contras. ASGARD³⁵, Gmx_qk³⁶ e CHAPERONg³⁷ são excelentes ferramentas que ajudam a facilitar o uso do GROMACS¹⁴ , mas ainda são aplicativos CLI que exigem que o usuário tenha um grau mínimo de conhecimento sobre o shell. O BioBB-Wfs³⁸ é o aplicativo mais semelhante ao VD³⁹, ele também oferece muitas coisas que o VD não oferece, pois usa o BioBB⁴⁴, uma biblioteca composta por wrappers em torno de ferramentas populares de MD. As telas podem ser um pouco complexas demais para alguém que está começando. O processo é bastante complexo em comparação com o VD. Após muitas etapas, um tipo de componente universal chamado Common Workflow Language (CWL) é gerado para execução em HPCs. No entanto, o usuário precisa ter acesso a esses servidores, o que não é naturalmente gratuito.

A instância pública atual do VD tem o Gromacs instalado para usar o processador, mas pode ser instalado com instruções para usar a Unidade de Processamento Gráfico (GPU) da máquina, o que melhora muito o desempenho da simulação⁴⁵. Além disso, o script de comando gerado no VD é transparente para GPU, o que significa que pode ser executado em uma máquina com uma GPU instalada sem a necessidade de modificar nada nos comandos.

Neste momento, o VD é uma ótima ferramenta para apresentar o MD a alguém novo, mas pode ser melhor usado por aqueles que estão familiarizados com o MD e o Gromacs. Pode ser usado em aulas de simulação, onde o professor precisa de uma abordagem rápida sem problemas de instalação ou configuração de parâmetros para executar um exercício. Além disso, o VD pode ser usado para validar uma simulação; se for executado por 5 ns, é justificável investir na extensão da simulação usando os arquivos gerados em VD.In geral, o grupo está trabalhando para incluir análises mais automatizadas, como ligações h e energia de ligação da área de superfície de Poisson-Boltzmann (MMPBSA) da mecânica molecular, ao mesmo tempo em que busca continuamente melhorar a usabilidade.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Servidor ACPYPE	Bio2Byte		Disponível no
software https://www.bio2byte.be/acpype/ GRACE	Laboratório de Plasma no Instituto Weizmann de Ciência		Disponível em https://plasma-gate.weizmann.ac.il/Grace/
Software GROMACS	Equipe		Instruções de instalação em https://manual.gromacs.org/current/install-guide/index.html
A estrutura da proteína de ligação FK506 De Plasmodium vivax complexada com o inibidor D5		Dados de Proteínas RCSB	Disponível em https://www.rcsb.org/structure/4mgv Já contém o ligante complexado à macromolécula.