Obtenção de glândulas paratireoides de suínos doadores vivos e identificação ex vivo

Resumo

Este protocolo apresenta um método rápido e não letal para a obtenção de glândulas paratireoides de suínos. O procedimento consiste em três etapas principais: preparo suíno com anestesia, recuperação unilateral do timo e identificação e extração ex vivo da glândula paratireoide intratímica.

Resumo

O hipoparatireoidismo, muitas vezes resultante de complicações cirúrgicas, interrompe gravemente a homeostase do cálcio, levando a sintomas incapacitantes. Os tratamentos atuais oferecem alívio limitado, destacando a necessidade de terapias alternativas, como o transplante de paratireoide. Este estudo apresenta um método simples para a obtenção de paratireoide de doadores vivos de porcos, com aplicações potenciais na pesquisa de transplantes, especialmente para o campo do xenotransplante. O procedimento envolve três etapas principais: preparação suína com anestesia, recuperação unilateral do timo e identificação e extração ex vivo da glândula paratireoide intratímica. O protocolo utiliza porcos Landrace, com procedimentos que garantem tratamento ético e recuperação pós-operatória. Extraímos com sucesso as glândulas paratireoides, confirmando sua viabilidade e integridade por meio de análises subsequentes. Os níveis de PTH no sobrenadante tecidual excederam 1.000 pg/mL, e a coloração por imunofluorescência distinguiu as glândulas paratireoides do tecido tímico, validando a confiabilidade do procedimento. Este protocolo oferece um método rápido, não letal e eticamente correto para a obtenção da glândula paratireoide de porcos, abordando as diferenças anatômicas entre porcos e humanos. Ele oferece uma abordagem sustentável com implicações significativas para a pesquisa de hipoparatireoidismo e xenotransplante.

Introdução

Este protocolo apresenta um método rápido e não letal para a captação da glândula paratireoide em suínos. O hipoparatireoidismo, caracterizado pela secreção insuficiente de paratormônio, interrompe criticamente a homeostase do cálcio¹. Essa condição, predominantemente uma complicação cirúrgica após paratireoidectomia ou tireoidectomia, manifesta-se por meio de sintomas como astenia, dor crônica, taquicardia, convulsões e até doença renal terminal². Ocasionalmente, surge de doenças autoimunes ou genéticas raras. Os tratamentos atuais, principalmente a suplementação oral de cálcio e vitamina D ou paratormônio recombinante, proporcionam apenas alívio parcial de sintomas sistêmicos como fadiga e depressão ^3,4. A crescente necessidade de alotransplante de paratireoide como um potencial remédio para hipoparatireoidismo grave ressalta a necessidade do estabelecimento de protocolos uniformes de transplante 5,6,7,8,9. No entanto, os estudos pré-clínicos sobre o transplante de paratireoide permanecem limitados e há uma falta de modelos animais padronizados. Além disso, o recente impulso no campo do xenotransplante^10,11 aumenta o interesse em aplicações clínicas do xenotransplante, especialmente no campo da terapia com células endócrinas^12,13. No entanto, os modelos suínos de xenotransplante de paratireoide são desafiadores devido à complexidade da identificação do tecido paratireoidiano em suínos. Há, portanto, a necessidade de fornecer uma técnica reprodutível, sustentável e ética para recuperar glândulas paratireoides de porcos para desenvolver ainda mais o xenotransplante de paratireoide.

Ao contrário dos seres humanos, que normalmente têm quatro glândulas paratireoides localizadas atrás da tireoide, os porcos possuem, para a maioria, duas glândulas paratireoides, cada uma localizada na parte cranial do timo. Estudos anteriores que visavam localizar glândulas paratireoides em porcos dependiam de métodos letais para identificação ex vivo ou técnicas baseadas em fluoróforos, que podem ser difíceis de implementar no xenotransplante 14,15,16. Propomos aqui uma técnica simples e não letal, adequada para xenotransplante, baseada em duas etapas principais: recuperação do timo suíno e identificação ex vivo ida glândula paratireoide por transiluminação. Essa técnica pode ser útil para pesquisas sobre fisiologia da paratireoide, bem como transplante.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade de Lille (referenciado # 20491-20190219161313).

1. Anestesia suína

1. Administre buprenorfina (0,015 mg/kg, por via intramuscular) 30 minutos antes da primeira incisão para fornecer analgesia pré-operatória.
2. Realize uma injeção intramuscular de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) para induzir a sedação. Administre isoflurano a 5% por inalação por 3 a 5 min para aprofundar a anestesia.
3. Avalie a profundidade da anestesia verificando o reflexo de fechamento da pálpebra e o reflexo de deglutição. Intubar o porco e posicioná-lo em decúbito dorsal na mesa de operação. Reduza a concentração de isoflurano para 2% por inalação para manutenção da anestesia.
4. Monitore continuamente a frequência cardíaca e a saturação de oxigênio usando um monitor veterinário multiparamétrico portátil para garantir a profundidade anestésica ideal e a estabilidade fisiológica durante todo o procedimento.

2. Exposição da área de interesse

1. Faça a barba e limpe meticulosamente a região cervical, estendendo-se da região submandibular até o esterno.
2. Aplique sabonete anti-séptico, seguido de clorexidina, para garantir um campo estéril. Seque bem toda a área.
3. Posicione campos estéreis para isolar a região cervical anterior para intervenção cirúrgica.

3. Exposição ao timo suíno

1. Faça uma incisão vertical de 10 cm ao longo da linha cervical branca usando um bisturi. Disseque cuidadosamente a área com uma tesoura de Metzenbaum para separar os músculos pré-tireoidianos, criando um campo cirúrgico claro.
2. Coloque um afastador auto-retentor entre o músculo omo-hióideo e a cartilagem tireóide para facilitar a dissecção do tecido conjuntivo e expor o timo.
   NOTA: Evite pressão excessiva na traqueia para evitar lesões.
3. Exponha gradualmente a parte cranial do timo e separe-a cuidadosamente da bainha carotídea, que contém o nervo vago, a veia jugular interna e a artéria carótida comum.
   NOTA: Para evitar lesões, use eletrocoagulação para obter hemostasia.

4. Recuperação do timo suíno

1. Uma vez liberado, extraia a parte cranial do timo, que normalmente mede 5 a 8 cm.
2. Enxágue o timo extraído em solução salina isotônica para facilitar a identificação da glândula paratireoide.
   NOTA: Esta etapa é crucial para melhorar a visualização e diferenciação da textura distinta da glândula paratireoide

5. Identificação da glândula paratireoide intratímica ex vivo

1. Alise suavemente o tecido tímico para facilitar a identificação da glândula paratireoide.
   NOTA: A glândula paratireoide exibe uma textura distinta, principalmente em comparação com o tecido circundante. A cápsula fibrótica da glândula paratireoide é mais firme e de tamanho semelhante ao de uma ervilha.
2. Use uma fonte de luz para identificar a glândula paratireoide por meio de transiluminação.
   NOTA: A vasculatura ao redor da glândula paratireoide deve ser claramente visível, auxiliando em sua diferenciação.
3. Extirpar cuidadosamente a cápsula e extrair toda a glândula paratiroide. Usando pinça Debakey para manuseio delicado e tesoura Metzenbaum para dissecção precisa. Isole a glândula do tecido tímico circundante.
4. Colocar a glândula paratiroide isolada em solução de armazenamento refrigerado e mantê-la a 4 °C para preservar a sua viabilidade para os procedimentos subsequentes.
5. Incorpore o tecido em parafina para processamento posterior.

6. Fechamento cirúrgico e despertar

1. Após a recuperação da glândula paratireoide, feche o local da cirurgia em camadas. Sutura de músculos e tecidos subcutâneos usando suturas absorvíveis. Feche a pele com suturas não absorvíveis.
2. Desmame gradualmente o porco da anestesia. Ao recuperar a consciência, monitore o porco quanto a complicações pós-operatórias imediatas.
3. Administrar analgésicos e antibióticos de acordo com o protocolo pós-operatório (buprenorfina 0,03 à 0,05 mg/kg e Clamoxyl 15 mg/kg por 48 h). Devolva os suínos às suas instalações de alojamento para recuperação sob supervisão veterinária.

7. Protocolo de imunocoloração

1. Realize desparafinização e desidratação a partir de amostras embebidas em parafina: xileno por 5 min, xileno por 10 min, etanol 100% por 5 min, etanol 90% por 7 min 30, etanol 70% por 7 min 30, etanol 50% por 5 min, água destilada por 5 min e tampão fosfato-salino (PBS) por 5 min.
2. Realize a recuperação do antígeno por micro-ondas as amostras em tampão citrato pH 6, a 650 W por 9 min. Deixe as amostras esfriarem no tampão por 20 min. Enxágüe três vezes com PBS por 5 min cada.
3. Incubar as amostras, circundadas com uma caneta Dako, à temperatura ambiente durante 20 minutos com uma solução de bloqueio de proteínas para bloquear a ligação não específica.
4. Incube as amostras durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário (anticorpo PTH (H-7), de camundongo-α-humano, sc-398856, 1: 100) diluído em albumina de soro bovino a 1% (BSA). Lave duas vezes com PBS por 5 min cada.
5. Incubar por 1 h e 30 min em temperatura ambiente com o anticorpo secundário (Alexa Fluor 488, cabra-α-Mouse, A11001, 1:500) diluído em albumina de soro bovino a 1%. Lave duas vezes com PBS e uma vez com água bidestilada por 5 min.
6. Monte as lâminas com a solução DAPI e guarde-as a 4 °C.

Resultados

Os resultados primários deste estudo incluem a extração bem-sucedida de glândulas paratireoides de porcos Landrace e análise subsequente para confirmar sua viabilidade e integridade. Os resultados são resumidos a seguir. A identificação do tecido paratireoidiano foi confirmada no intraoperatório por transiluminação (Figura 1A). Após a extração, duas pequenas amostras do tecido foram coletadas (aproximadamente 10% cada). Uma amostra foi picada em prato em 1 mL de meio de cultura DMEM...

Discussão

Este protocolo apresenta um método rápido e não letal para a captação da glândula paratireoide em suínos. A etapa principal do protocolo envolve a localização do timo suíno para garantir a recuperação completa para uma investigação ex vivo posterior. Uma vez que o timo é extraído, a glândula paratireoide pode ser facilmente identificada usando transiluminação.

Um dos principais desafios dessa técnica é a necessidade de evitar depender de hábitos cirúr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipment
22G Cateter Periférico Curto	Smiths Medical	5060
Basic set II, crepe	Hartmann	9389253
Bupaq (bupré norphine)	Virbac
Clippers Favorita II	Aesculap Schermaschinen	GT104
Bisturis Descartáveis	Swann-Morton	0510
Espátula de Eletrodo	Erbe	21191-002
Gerador de Eletrocirurgia BE VIO 200p	Erbe	10140-400
Euroklav 23 VS+	MELAG	10056
Válvula de infusão por gravidade de 3 vias com ponta móvel Luer Lock	Care Fusion	A64-3V
Alça com dois botões para eletrodos Slim-Line	Vaporizador de	Erbe 20190-065
	Supera Inovações em Anestesia	VAP3000
Isorano (isoflurano)	Axience
Ketamidor (ké tamine)	Axience
Light Ceiling Double	RIMSA	PENTA81+30E
Medisorb Absorvente de Dióxido de Carbono	Vyaire	8570043
Mersuturas 0	Ethicon	F2520
Micrótomo	LEICA RM2255
Miller Blade	Opticlar	600.020
Concentrador de Oxigênio	DeVilbiss	525KS
Paxman (xilazina)	Virbac
Monitor Veterinário Multiparâmetro Portátil	Mindray	IPM 10
Laringoscópio Reutilizável Alças	Opticlar	600.080
Ventilador de Anestesia para Pequenos Animais	Midmark	91806001
Injeção de Cloreto de Sódio Viaflo	Baxter
Instrumentos Cirúrgicos	Kohler medizintechnik
Mesa Cirúrgica	Vetinox	TA700005
Tubo Traqueal	Smiths Medical	100/179/070
Vicryl 2-0	Ethicon	JV453
VMS	Midmark	91800003
Materiais e Reagentes
DMEM F-12 meio	ThermoFischer	11320033
anticorpo paratormônio	SantaCruz	sc-398856
Ensaio pth intraoperatório rápido	Beckman Coulter	A16972

Enchimento de Funil de Isoflurano