Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

Summary

Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

Abstract

O reparo de quebras de fita dupla de DNA (DSBs) é crucial para a manutenção da estabilidade do genoma e da viabilidade celular. O reparo de DSB (DSBR) em células é mediado por vários mecanismos: recombinação homóloga (HR), junção de extremidade não homóloga (NHEJ), junção de extremidade mediada por microhomologia (MMEJ) e recozimento de fita simples (SSA). Os ensaios celulares são essenciais para medir a proficiência e modulação dessas vias em resposta a vários estímulos.

Aqui, apresentamos um conjunto de ensaios repórteres extracromossômicos que medem a reconstituição de um gene repórter de nanoluciferase por uma das quatro principais vias DSBR nas células. Após a transfecção transitória em células de interesse, o reparo de substratos repórter específicos da via pode ser medido em menos de 24 h pela detecção de luminescência de Nanoluciferase (NanoLuc).

Esses ensaios robustos são quantitativos, sensíveis, tituláveis e passíveis de um formato de triagem de alto rendimento. Essas propriedades fornecem amplas aplicações na pesquisa de reparo de DNA e descoberta de medicamentos, complementando o kit de ferramentas atualmente disponível de ensaios DSBR celulares.

Introduction

As quebras de fita dupla de DNA (DSBs) representam uma classe particularmente tóxica de dano ao DNA¹ devido à qual as células desenvolveram múltiplas vias de reparo de DSB (DSBR) para reparar essas lesões. Os quatro principais mecanismos de DSBR são recombinação homóloga (HR), junção de extremidade não homóloga (NHEJ), junção de extremidade mediada por microhomologia (MMEJ) e recozimento de fita simples (SSA) ^{2 , 3} . As vias DSBR contribuem para a manutenção do desenvolvimento e fisiologia de tecidos saudáveis e protegem contra doenças como o câncer. Além disso, esses mecanismos de reparo possuem potencial terapêutico para o desenvolvimento de moduladores de pequenas moléculas em oncologia de precisão. Por exemplo, o direcionamento da DNA polimerase θ (Polθ), uma enzima fundamental na via de reparo do MMEJ, atraiu interesse devido à sua letalidade sintética com deficiência de HR no câncer⁴.

A compreensão do DSBR, portanto, tem amplas implicações clínicas e são necessários ensaios celulares funcionais capazes de medir a atividade de todas as principais vias do DSBR⁵. Os ensaios devem ser adequados para interrogação genética e farmacológica e implantáveis em modelos celulares de interesse. Para apoiar os esforços de descoberta de medicamentos de moléculas pequenas, os ensaios devem ser altamente sensíveis, tituláveis, ter um retorno rápido e ser escaláveis para formatos de alto rendimento adequados para triagem de compostos.

Em geral, o DSBR foi medido anteriormente usando sistemas de ensaio repórter baseados em fluorescência integrados de forma estável ao genoma celular⁶. No entanto, embora a recapitulação fisiológica do DSBR cromossômico seja uma vantagem distinta, esses ensaios são restritos a um modelo hospedeiro no qual o repórter está integrado, utilizam preparação e análise de amostras trabalhosas por citometria de fluxo e têm rendimento limitado, tempo de resposta, robustez e sensibilidade, todos recursos essenciais necessários para os esforços de descoberta de medicamentos.

Aqui, descrevemos um conjunto de ensaios de repórter DSBR que permitem a avaliação das quatro principais vias DSBR. O conjunto de substratos de ensaio repórter é descrito na Figura 1 e descrito em uma publicação recente⁷. Eles são extracromossômicos, permitindo sua introdução nas células por simples transfecção transitória, e a incorporação de um gene repórter de nanoluciferase⁸, que deve ser reconstituído pelo envolvimento com mecanismos específicos de DSBR, gera sensibilidade, robustez e escalabilidade. As seguintes variantes de substrato do repórter DSBR estão incluídas no protocolo (Figura 1):

MMEJ independente de ressecção: Este substrato linear é composto por uma região central de DNA de fita dupla (dsDNA) com saliências de DNA de fita simples (ssDNA), que imitam as extremidades ressecadas^{do DNA 9}. Quatro microhomologias de nucleotídeos nos terminais das regiões do ssDNA codificam o códon inicial para o gene repórter. O reparo desse substrato por meio do MMEJ restaura o quadro de leitura aberto (ORF) do gene repórter.

MMEJ dependente de ressecção: O éxon do gene repórter N-terminal é interrompido por um segmento contendo um códon de parada, que é flanqueado por 8 microhomologias de pares de bases (bp). A ressecção nucleolítica da extremidade é necessária antes do reparo mediado por MMEJ para restaurar o gene repórter intacto.

NHEJ contundente: O gene repórter é dividido em seções N- e C-terminais, das quais a última é colocada a montante do promotor. O DSB é produzido usando EcoRV e requer ligação direta (sem processamento final) por NHEJ para que ambas as porções do gene repórter sejam reunidas novamente e o ORF repórter seja restaurado.

NHEJ não contundente: O DSB está localizado dentro de um íntron e terá extremidades coesivas ou não coesivas, dependendo da escolha da enzima de restrição. O reparo deste substrato por NHEJ requer que a ligadura seja precedida pelo processamento final.

HR de modelo longo: O éxon N-terminal do gene repórter é interrompido por um segmento de DNA contendo locais de restrição, que substituem 22 pb da sequência original do gene repórter. Para restaurar essa sequência, o reparo por HR usa o modelo de homologia de 2,5 kilobase (kb) colocado a jusante do éxon C-terminal.

Modelo curto de RH: O local de restrição necessário para gerar o DSB substitui parte da sequência do gene repórter nativo e introduz um códon de parada no quadro. Como a versão de modelo longo, este substrato HR requer o modelo de homologia downstream (360 bp) para reparo e restauração precisos do ORF repórter.

SSA: Este substrato contém um códon de parada prematuro localizado dentro do éxon N-terminal do gene repórter. A remoção deste códon de parada e a reintegração da sequência intacta do gene repórter requerem reparo por SSA, que envolve ressecção bidirecional de longo alcance antes do alinhamento das homologias.

Para a geração do DSB, alguns dos substratos repórter podem ser digeridos com I-SceI (Figura 1). Isso gerará um substrato linear com extremidades não coesivas nos repórteres MMEJ dependentes de ressecção, NHEJ não romba, HR de modelo longo e SSA, que possuem locais I-SceI em tandem em orientações invertidas. No substrato de repórter de RH de modelo curto, a digestão do único site I-SceI gerará extremidades coesas. Os plasmídeos NHEJ não contundentes, MMEJ dependente de ressecção, HR de modelo longo e SSA também podem ser digeridos com HindIII, que produzirá extremidades coesivas complementares.

Fornecemos protocolos para a geração dos substratos do ensaio repórter e descrevemos como os ensaios podem ser realizados, fornecendo detalhes sobre como eles podem ser usados para quantificar o DSBR, incluindo respostas tituláveis a pequenas moléculas, avaliação da potência celular, atividade no alvo e seletividade da via.

Protocol

1. Preparação e controle de qualidade (CQ) de substratos repórter

NOTA: Os plasmídeos que codificam os substratos repórteres podem ser propagados em cepas padrão de Escherichia coli (por exemplo, DH5α e derivados) e recuperados por isolamento de plasmídeo. Os detalhes do plasmídeo (tamanho e resistência a antibióticos) são descritos na Tabela 1 e na Figura 1.

Figura 1: Esquemas de ensaios repórter DSBR baseados em NanoLuc extracromossômicos. Representação esquemática dos substratos repórter DSBR, incluindo sua localização dentro de cada plasmídeo de origem, características da sequência principal e layout final após o reparo específico do caminho. O núcleo do substrato MMEJ independente de ressecção é excisado do plasmídeo de origem por digestão com XhoI / HindIII, após o que as tampas devem ser ligadas a ambas as extremidades para produzir o substrato para MMEJ. O substrato repórter NHEJ rombo é gerado por excisão do plasmídeo de origem com EcoRV. Os substratos repórteres MMEJ dependentes de ressecção, NHEJ não romba, HR de modelo longo e SSA são gerados pela linearização dos plasmídeos de origem usando I-SceI (que produz extremidades não coesivas) ou HindIII (que produz extremidades coesivas). O substrato repórter HR de modelo curto é gerado pela linearização do plasmídeo de origem usando I-SceI (que produz extremidades coesivas). O reparo de cada substrato repórter pela via DSBR alvo reconstitui uma nanoluciferase ORF intacta que codifica NanoLuc funcional. Essa figura foi adaptada de Rajendra et ^al.7. Abreviaturas: DSBR = reparo de quebra de fio duplo; NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; HR = recombinação homóloga; SSA = recozimento de fita simples; ORF = quadro de leitura aberto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação de substrato repórter MMEJ independente de ressecção (Figura 1 e Figura 2A-C)
   1. Preparação de tampas de ssDNA/dsDNA (Figura 2A)
      1. Ressuspenda os quatro oligonucleotídeos listados na Tabela 2 individualmente em tampão de recozimento (20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl em água de grau de biologia molecular) para gerar uma solução estoque a 100 μM.
      2. Recozimento de tampas de ss/dsDNA
         1. Misture 50 μL de cada um dos oligonucleotídeos longos e curtos (solução estoque de 100 μM) para a tampa esquerda da etapa 1.1.1.1 em um tubo de 0,2 mL.
         2. Repita para oligonucleotídeos da tampa direita.
         3. Usando um termociclador, incube cada mistura de oligonucleotídeos a 99 ° C por 5 min e depois diminua para 10 ° C a 1 ° C / min.
            NOTA: Isso produzirá as tampas esquerda e direita recozidas.
      3. (QC, opcional) Verificação do recozimento de oligonucleotídeos por eletroforese
         1. Eletroforese 100 ng de cada produto da etapa 1.1.1.2 juntamente com oligonucleotídeos individuais da etapa 1.1.1.1 e uma escada de DNA de baixo peso molecular em um gel de acrilamida-Tris-Borato-EDTA (TBE) a 20% a 200 V por 80 min.
         2. Pinte o gel com tampão de corrida TBE contendo um corante de DNA fluorescente apropriado para visualização de ssDNA e dsDNA por pelo menos 10-15 min.
         3. Visualize a fluorescência em um sistema de documentação de gel (Figura 2A).
            NOTA: As etapas 1.1.1.3.1 a 1.1.1.3.3 são usadas para verificar se as tampas foram recozidas corretamente. Os tamanhos aparentes para a tampa esquerda e a tampa direita devem ser ~ 120 pb e ~ 175 pb, respectivamente.
   2. Purificação do núcleo do substrato repórter (Figura 2B)
      1. Misture 100 μg do plasmídeo do núcleo repórter com 4 μL de HindIII e 4 μL de XhoI (4 U / μg de plasmídeo para cada enzima) e 20 μL de tampão 10x. Levar o volume total a 200 μL com água bidestilada (ddH₂O) e incubar a 37 °C durante 2 h durante a noite para digerir o plasmídeo.
         NOTA: Para digestão de quantidades maiores ou menores, dimensione a reação proporcionalmente.
      2. Incubar a reação de digestão a 80 °C por 20 min para inativar as enzimas de restrição.
      3. Adicionar 40 μL de fosfatase alcalina (plasmídeo 2 U/μg) e 27 μL de tampão 10x à mistura de reação da etapa 1.1.2.2. Incubar a 37 °C durante 2 h para desfosforilar o plasmídeo.
         NOTA: Aumente ou diminua a reação conforme necessário.
      4. Adicione 60 μL de corante de carga 6x à reação da etapa 1.1.2.3. Eletroforese juntamente com uma escada de ADN de elevado peso molecular num gel de agarose-Tris-acetato-EDTA (TAE) a 1,5 % (p/v) contendo uma coloração fluorescente de dsDNA a 120 V durante 2,5 h ou até que as bandas estejam suficientemente resolvidas.
      5. Visualize a fluorescência em um sistema de documentação de gel (Figura 2B).
      6. Extirpar o fragmento do núcleo repórter (~1,5 kb) do gel usando um bisturi limpo, tomando cuidado para não contaminar com a estrutura do vetor (~2,5 kb).
      7. Extraia o fragmento do núcleo repórter usando um kit de extração de gel, seguindo as instruções do fabricante.
      8. Medir a concentração e a qualidade do ADN (A_260/280) por espectrofotometria.
   3. Ligação do núcleo do substrato repórter com tampas de ssDNA/dsDNA e purificação do substrato repórter final (Figura 2C)
      1. Misture 30 μg do fragmento do núcleo repórter da etapa 1.1.2.7 com 3,85 μL de cada tampa esquerda e direita recozida da etapa 1.1.2 (aprox. proporção molar de 6:1 da tampa: DNA do núcleo), 30 μL de tampão ligase 10x e 1,5 μL de DNA ligase T4 (20 U / μg DNA). Traga o volume total da reação para 300 μL com ddH₂O e incube durante a noite a 16 ° C para ligar as tampas ao fragmento do núcleo repórter.
         NOTA: Aumente ou diminua a reação conforme necessário.
      2. (QC, opcional) Eletroforese 200 ng do produto resultante da etapa 1.1.3.1 ao lado do núcleo do substrato repórter e uma escada de DNA de alto peso molecular em um gel de agarose-TAE de 0,7% (p / v) contendo uma coloração fluorescente de dsDNA a 120 V por pelo menos 1,5 h. Verifique se a banda correspondente ao produto ligado migra a uma taxa ligeiramente mais lenta do que o núcleo do substrato repórter não ligado (Figura 2C).
         NOTA: Esta etapa de controle de qualidade é para verificar se a ligação das tampas ao fragmento do núcleo do repórter ocorreu corretamente.
      3. Purifique o DNA da reação de digestão na etapa 1.3.1. usando o método preferido (por exemplo, um método baseado em contas ou colunas), seguindo as instruções do fabricante.
         NOTA: A etapa de purificação 1.1.3.3 reduz substancialmente a presença de tampas não ligadas.
   4. Medir a concentração e a qualidade do ADN (A_260/280) por espectrofotometria.
2. Preparação de substrato repórter NHEJ rombo (Figura 1 e Figura 2D,E)
   1. Misture 100 μg do plasmídeo do núcleo repórter com 5 μL de EcoRV (5 U / μg de plasmídeo) e 20 μL de tampão 10x. Levar o volume total a 200 μL com ddH₂O e incubar a 37 °C durante 2 h a uma noite para digerir o plasmídeo.
      NOTA: Para digestão de quantidades maiores ou menores, dimensione a reação proporcionalmente.
   2. Incubar a reação de digestão a 65 °C durante 20 min para inativar a enzima de restrição.
   3. Adicione 50 μL de corante de carga 6x à reação da etapa 1.2.2. Eletroforese juntamente com uma escada de DNA de alto peso molecular em um gel de agarose-TAE a 1,5% (p / v) contendo uma coloração fluorescente de dsDNA a 120 V por 2 h ou até que as bandas sejam suficientemente resolvidas.
   4. Visualize a fluorescência em um sistema de documentação de gel (Figura 2D).
   5. Extirpar o substrato repórter (~1,7 kb) do gel usando um bisturi limpo, tomando cuidado para não contaminar com a estrutura do vetor (~2,6 kb).
   6. Extraia o fragmento do núcleo repórter usando um kit de extração de gel, seguindo as instruções do fabricante (Figura 2E).
   7. Medir a concentração e a qualidade do ADN (A_260/280) por espectrofotometria.
3. Preparação de substratos repórter baseados em I-SceI (Figura 1)
   NOTA: Esses substratos incluem MMEJ dependente de ressecção (Figura 2F), NHEJ não rombo (Figura 2G), HR de modelo longo (Figura 2H), HR de modelo curto (Figura 2I) e SSA (Figura 2J).
   1. Misture 100 μg do plasmídeo do núcleo repórter com 50 μL de I-SceI (5 U / μg de plasmídeo) e 60 μL de tampão 10x. Levar o volume total a 600 μL com ddH₂O e incubar a 37 °C durante 2 h durante a noite para digerir o plasmídeo.
      NOTA: Para digestão de quantidades maiores ou menores, dimensione a reação proporcionalmente. Os plasmídeos NHEJ não rombos, MMEJ dependente de ressecção, HR de modelo longo e SSA também podem ser digeridos com HindIII, o que gerará extremidades coesivas complementares.
   2. Incube a reação de digestão a 65 ° C por 20 min para inativar o I-SceI. Defina a temperatura para 80 ° C durante esta etapa se HindIII foi usado para digestão.
   3. Purifique o DNA da reação de digestão inativada na etapa 1.3.2 usando o método preferido (por exemplo, um método baseado em esferas ou colunas), seguindo as instruções do fabricante.
   4. Medir a concentração e a pureza do ADN (A_260/280) por espectrofotometria.
4. Controle de qualidade de substratos repórter
   1. Eletroforese 200 ng do substrato repórter ao lado de uma escada de DNA de alto peso molecular em um gel de agarose-TAE a 0,7% (p / v) contendo uma coloração fluorescente de dsDNA a 120 V por 2 h ou até que as bandas estejam suficientemente resolvidas. Carregue o plasmídeo repórter original sem cortes ao lado como um controle.
   2. Verifique se as bandas definidas com o tamanho correto são observadas para cada substrato repórter (consulte a Tabela 1 e a Figura 2F-J).

Figura 2: Análises eletroforéticas em gel da geração de substrato repórter DSBR. (AC) Imagens representativas da análise eletroforética em gel de intermediários e construção final necessária para a geração do substrato repórter MMEJ independente de ressecção. As imagens adjacentes nos painéis (A) e (C) são dos mesmos géis; faixas irrelevantes foram omitidas. (D, E) Imagens representativas da análise eletroforética em gel para plasmídeo de origem, produtos digeridos por EcoRV e construção final extraída em gel necessária para a geração do substrato repórter NHEJ rombudo. (F-J) Imagens representativas da análise eletroforética em gel de plasmídeos de origem e construções DSBR linearizadas para os substratos repórter digeridos por I-SceI: MMEJ dependente de ressecção, NHEJ não rombudo, HR de modelo longo, HR de modelo curto, SSA. Abreviaturas: DSBR = reparo de quebra de fio duplo; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; HR = recombinação homóloga; SSA = recozimento de fita simples. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Transfecção transitória de substratos repórter DSBR

NOTA: Uma visão geral do fluxo de trabalho experimental dos ensaios e algumas permutações potenciais são descritas na Figura 3. O protocolo abaixo descreve um experimento usando células HEK-293, onde estas são transfectadas reversamente com o substrato repórter. Os números abaixo podem ser aumentados ou reduzidos de acordo com o número de poços a serem usados por placa. As etapas a seguir são calculadas para um ensaio realizado em uma placa de 96 poços; veja Discussão para considerações adicionais.

Figura 3: Fluxo de trabalho experimental para ensaios repórter DSBR. As células de interesse são transfectadas com o substrato DSBR linearizado (que codifica uma ORF NanoLuc que precisa ser reparada por meio de um evento específico de reparo de DNA) e um plasmídeo Firefly (controle de transfecção). Então, 6-24 h após a transfecção, a luminescência Firefly e a luminescência NanoLuc podem ser lidas sequencialmente após a adição de reagentes Nano-Glo Dual-Luciferase. Exemplos de permutações para as etapas principais (mostradas em caixas azuis claras) podem ser usadas para testar como a modulação genética (nocaute, knockdown ou superexpressão) ou o tratamento farmacológico afeta a proficiência da via DSBR nas células. Abreviaturas: DSBR = reparo de quebra de fio duplo; NanoLuc = Nanoluciferase; WT = tipo selvagem; KO = nocaute. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. (Opcional) Se estiver avaliando o impacto dos compostos no ensaio repórter, dispense compostos dissolvidos no veículo (por exemplo, dimetilsulfóxido [DMSO]) em poços de uma placa de 96 poços de acordo com um layout experimental predefinido. Normalize a concentração de veículos em todos os poços.
   NOTA: Recomenda-se a realização de réplicas técnicas. Inclua poços de controle (por exemplo, somente para veículos).
2. Em um tubo de 1,5 mL, diluir o plasmídeo de controle Firefly (luciferase de controle) e o substrato repórter NanoLuc DSBR (luciferase repórter) gerado nas etapas 1.1, 1.2 ou 1.3, em 500 μL de tampão de transfecção. Use 0,66 μg de plasmídeo de controle de luciferase por 1 × 10⁶ células. Consulte a Tabela 3 para obter as quantidades de substrato repórter NanoLuc DSBR a serem usadas.
   NOTA: Um plasmídeo de controle positivo que expressa constitutivamente a luciferase repórter pode ser usado para validar as condições de configuração e transfecção do instrumento ou para verificar se há efeitos não específicos na própria luciferase repórter. Como ponto de partida, recomendamos 0,1 μg de plasmídeo repórter de luciferase e 0,66 μg de plasmídeo de controle de luciferase por 1 × 10⁶ células.
3. Adicione o reagente de transfecção à base de lipídios ao DNA diluído da etapa 2.2 na proporção recomendada pelo fabricante (por exemplo, 1:2, μg de DNA: μL de reagente para o reagente descrito na Tabela de Materiais), misture bem por vórtice brevemente e incube por 10 min em temperatura ambiente.
4. Colha as células por tripsinização, ressuspenda-as em meio fresco contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e conte-as.
5. Transfira 3 × 10⁶ células para um tubo de 15 mL e ressuspenda em 8,5 mL de meio.
6. Adicione a mistura de transfecção de DNA da etapa 2.3 na suspensão celular e misture várias vezes por inversão.
7. Placa 80 μL de suspensão de células (aproximadamente 2,7 × 10⁴ células) por poço.
   NOTA: A suspensão contendo células e mistura de transfecção de DNA pode ser dispensada na placa pipetando manualmente ou usando um manipulador de líquido automatizado para experimentos de maior rendimento.
8. Incubar a 37 °C/5% CO₂ durante 24 h.

3. Detecção de luminescência

1. Preparação de reagentes
   1. Siga as instruções do fabricante para a preparação e adição de reagentes de luciferase repórter (NanoLuc) e controle (Firefly), que fornecem os substratos para ambas as luciferases (Furimazina e 5'-Fluoroluciferina, respectivamente):
   2. Prepare o reagente de controle da luciferase. Reconstituir de acordo com as instruções do fabricante e misturar por inversão até que o substrato da luciferase esteja completamente dissolvido.
   3. Prepare o reagente repórter luciferase fresco de acordo com as instruções do fabricante. Calcule a quantidade de reagente necessária para adicionar 80 μL / poço e adicione substrato em um volume apropriado de tampão de ensaio na proporção de 1: 100 (substrato de luciferase: tampão). Para uma placa de 96 poços, dilua 88 μL de substrato de luciferase em 8.800 μL de tampão e misture por inversão.
      NOTA: Essas quantidades incluem uma franquia aproximada de 10%. Uma vez reconstituído, o reagente de controle da luciferase pode ser armazenado de acordo com as instruções do fabricante para uso futuro. O reagente repórter de luciferase deve ser preparado fresco para cada uso.
2. Detecção serial de luminescência de luciferases de controle e repórter (placa de 96 poços)
   1. Deixe a placa e os reagentes de luciferase atingirem a temperatura ambiente.
   2. Adicione 80 μL de reagente de luciferase de controle por poço.
   3. Agite a placa por 3 min em um agitador orbital a 450 rpm.
   4. Meça o sinal de luminescência da luciferase de controle com um leitor de placa de luminescência.
      NOTA: Emissão de leitura a 580 nm (filtro passa-banda de 80 nm) ou a luminescência total por poço. Essa luminescência é usada como uma medida da eficiência da transfecção e densidade celular e também pode informar sobre a toxicidade celular causada pelos tratamentos de teste.
   5. Adicione 80 μL de reagente repórter de luciferase por poço.
      NOTA: Este reagente inibirá a luciferase de controle; Ele também contém o substrato para a luciferase repórter.
   6. Agite a placa por 3 min em um agitador orbital a 450 rpm.
   7. Deixe o prato descansar por 7 min em temperatura ambiente.
   8. Meça o sinal de luminescência da luciferase do repórter com um leitor de placa de luminescência.
      NOTA: Emissão de leitura a 470 nm (filtro passa-banda de 80 nm) ou, alternativamente, luminescência total por poço. Essa luminescência fornece informações sobre a quantidade de substrato repórter que foi reparado pela via DSBR de interesse.
   9. Exporte leituras de luminescência para análise downstream.

4. Análise dos dados

1. Divida o sinal de luminescência da luciferase repórter (NanoLuc) pelo sinal de luminescência da luciferase de controle (Firefly) originado do mesmo poço para calcular o sinal do ensaio. Aplique esse cálculo a todos os poços, conforme mostrado na equação (1).
   Características (1)
2. Calcule a média dos sinais de ensaio para os poços de controle (por exemplo, somente veículo).
3. Normalize os sinais de ensaio para poços de teste para a média do poço de controle usando a equação (2) para calcular o reparo (%) por poço.
   (2)
4. (Opcional, ajuste de curva) Se estiver testando várias doses de compostos, plote o Reparo calculado (%) em relação à concentração do composto e ajuste uma curva dose-resposta usando um modelo de regressão não linear. Use essa curva para interpolação EC₅₀ subsequente.

Results

O reparo de cada um dos ensaios repórter pode ser detectado e quantificado usando o mesmo procedimento. O reparo correto de um substrato por sua via de reparo cognato nas células reconstituirá um ORF funcional intacto que codifica NanoLuc. Este sinal de luminescência pode ser detectado usando um leitor de placas.

A co-transfecção com um plasmídeo intacto que codifica a luciferase Firefly serve como um controle de transfecção. Esse controle serve a dois propósitos. Primeiro, ele fornece um padrão para normalizar o sinal NanoLuc, pois não deve ser perturbado pela modulação do DSBR por meios genéticos ou farmacológicos. Em segundo lugar, pode fornecer uma indicação de perturbações celulares fora do alvo que afetam o sinal da luciferase, como modulação do ciclo celular, efeitos na transcrição/tradução ou toxicidade geral.

A proporção de NanoLuc para Firefly serve como uma leitura substituta do reparo. Os valores de luminescência podem ser exportados e analisados normalizando os dois sinais de luciferase de dentro do mesmo poço. No caso de estudos de perturbação genética (por exemplo, comparando o tipo selvagem e KO ou siRNA não direcionado e alvo), o reparo geralmente é normalizado para a amostra parental (células do tipo selvagem ou células tratadas com siRNA de controle não direcionado). No caso da modulação farmacológica, os valores de uma amostra tratada com composto são normalizados para o valor produzido pelo tratamento com veículo.

A validação completa do conjunto de repórteres descrito foi publicada recentemente⁷. Os dados que exemplificam a caracterização da modulação genética e farmacológica da DSBR são mostrados na Figura 4 (adaptada da ⁷). Polθ é o principal mediador do MMEJ e prevê-se que a perda ou inibição dessa enzima ablação especificamente do MMEJ celular ^3,10. Usando uma linha celular na qual o POLQ, o gene que codifica o Polθ, foi nocauteado¹¹, o ensaio repórter MMEJ independente de ressecção demonstra que o MMEJ é de fato quase totalmente suprimido. A avaliação dos sinais de luminescência do componente NanoLuc e Firefly mostra que o defeito de reparo observado é impulsionado por uma redução no sinal NanoLuc (codificado pelo substrato repórter), enquanto o sinal Firefly (controle) não é perturbado ( Figura 4A-C ). Em contraste, a avaliação da proficiência em NHEJ usando o repórter NHEJ de extremidade romba demonstra que o nocaute POLQ não inibe o reparo do substrato repórter (Figura 4D-F). Juntos, esses dados genéticos apóiam o papel específico de Polθ no reparo mediado por MMEJ. Essas observações são totalmente recapituladas farmacologicamente com ART558^12,13, um inibidor altamente potente e específico recentemente relatado do domínio polimerase de Polθ (Figura 4G), onde é observada inibição titulável de MMEJ, que deriva de uma diminuição específica no NanoLuc e não no sinal Firefly (Figura 4H). Além disso, e de acordo com os dados genéticos, não há efeito sobre o NHEJ (Figura 4I, J). Juntos, esses dados destacam como esses repórteres podem ser usados para caracterizar a modulação genética das vias DSBR e mostrar a potência celular e a especificidade do alvo / via de pequenas moléculas.

Figura 4: Efeitos do nocaute genético e da inibição farmacológica de Polθ nos sinais repórter MMEJ e NHEJ. As células eHAP1 WT e POLQ(^-) foram transfectadas com um plasmídeo de controle Firefly e com (A-C) o repórter MMEJ independente de ressecção ou (D-F) repórter NHEJ de extremidade romba. A porcentagem de reparo de MMEJ ou NHEJ é a razão entre a luminescência de NanoLuc e a luminescência de vaga-lume, normalizada para o controle tratado com DMSO, 24 h após a transfecção. Os dados representam ± SEM médio de três réplicas biológicas, cada uma com média de 8 réplicas técnicas. As células HEK-293 foram transfectadas com um plasmídeo de controle Firefly e (G,H) o repórter MMEJ independente de ressecção ou o repórter NHEJ de extremidade romba (I,J) e tratadas com o inibidor da polimerase Polθ ART558. A porcentagem de reparo é a razão entre a luminescência de NanoLuc e a luminescência de vaga-lume, normalizada para o controle tratado com DMSO, 24 h após a transfecção. A porcentagem de inibição dos sinais de luminescência individuais em (G) e (I) foi calculada em relação ao controle tratado com DMSO e mostrada respectivamente em (H) e (J). Os dados representam ± média de SEM de 2 réplicas biológicas, cada uma com média de 4 réplicas técnicas. Essa figura foi adaptada de Rajendra et ^al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Inibição do sinal repórter HR pelo inibidor RAD51 CAM833. (A) As células HEK-293 foram transfectadas com o substrato repórter HR de modelo longo, um plasmídeo de controle de luciferase Firefly e tratadas com o inibidor RAD51 CAM833¹⁴. A luminescência de NanoLuc e Firefly foi lida 16 h após a transfecção. A porcentagem de reparo de HR é a razão entre a luminescência de NanoLuc e a luminescência de Firefly, normalizada para o controle tratado com DMSO. As linhas tracejadas destacam a porcentagem de inibição de HR e a concentração de CAM833 na curva EC₅₀. Os dados representam ± média de SEM de 2 réplicas biológicas, cada uma com média de 4 réplicas técnicas. (B) A porcentagem de inibição dos sinais de luminescência individuais em (A) foi calculada em relação ao controle tratado com DMSO. As linhas tracejadas destacam a porcentagem de inibição de NanoLuc e Firefly em 3,33 μM CAM833 (EC₅₀). A diminuição do sinal Firefly em concentrações de CAM833 ≥ 10 μM é indicativa de toxicidade do composto em altas doses; no entanto, a redução do sinal de NanoLuc é observada em concentrações onde o sinal Firefly não é afetado, sugerindo que o CAM833 induz a inibição de HR no alvo. Essa figura foi adaptada de Rajendra et ^al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = recombinação homóloga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Substrato repórter		Plasmídeo de origem (tamanho em kb, resistência)	Geração de DSB			Tamanho esperado do substrato do relator final (kb)
MMEJ independente de ressecção		4.0, Kan	Ressecado 3 'caudas através de ligadura de tampas			1.6
MMEJ dependente de ressecção		6.5, Kan	I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)			6.5
NHEJ sem corte		4.3, Kan	Extremidades rombas após a excisão do plasmídeo por EcoRV			1.7
NHEJ não contuso		6.7, Kan	I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)			6.5
HR de modelo longo		9.2, Kan	I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)			9.2
Modelo curto HR		9.3, Amp	I-SceI (coeso)			9.3
SSA		9.5, Kan	I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)			9.5

Tabela 1: Plasmídeos de substrato repórter. Abreviaturas: DSB = quebra de fita dupla; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; HR = recombinação homóloga; SSA = recozimento de fita simples; Kan = canamicina; Amp = ampicilina.

Sequência (5'-3')			Fornecedor	Purificação	Função
5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT			Sigma	PÁGINA	Tampa esquerda, oligonucleotídeo longo
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC			Sigma	PÁGINA	Tampa esquerda, oligonucleotídeo curto
5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			Sigma	PÁGINA	Tampa direita, oligonucleotídeo longo
5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA			Sigma	PÁGINA	Tampa direita, oligonucleotídeo curto

Tabela 2: Oligonucleotídeos para tampas para geração de substrato repórter MMEJ independente de ressecção. Abreviaturas: ssDNA = DNA de fita simples; dsDNA = DNA de fita dupla; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida. As microhomologias são sublinhadas.

Ensaio do repórter	DNA do substrato repórter NanoLuc (μg DNA/1x106 células)	Plasmídeo de luciferase de controle de vaga-lumes (μg DNA/1x106 células)
MMEJ independente de ressecção	0.5	0.66
MMEJ dependente de ressecção	1	0.66
NHEJ sem corte	0.5	0.66
NHEJ não contuso	0.5	0.66
HR de modelo longo	1	0.66
Modelo curto HR	2	0.66
SSA	1	0.66

Tabela 3: Quantidades de DNA para transfecção transitória de substratos repórter NanoLuc e plasmídeo de luciferase de controle Firefly (HEK-293, formato de placa de 96 poços). Abreviaturas: MMEJ = junção de extremidades mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; HR = recombinação homóloga; SSA = recozimento de fita simples.

Discussion

Aqui, descrevemos protocolos para a geração e implementação de um conjunto de repórteres baseados em luminescência extracromossômica para medir a proficiência celular das quatro principais vias DSBR (HR, NHEJ, MMEJ e SSA)⁷. Os substratos repórter podem ser introduzidos nas células por transfecção transitória e usados para avaliar a atividade do DSBR usando uma leitura sensível e robusta baseada em placas da luminescência do NanoLuc, que é reconstituída após o envolvimento com as vias DSBR celulares cognatas.

Vários estágios de geração de substrato repórter, transfecção dos substratos em células e interpretação de dados são essenciais para a execução bem-sucedida desses ensaios. Embora técnicas padrão de biologia molecular sejam usadas para gerar os substratos repórteres, a visualização do processo por eletroforese em gel garante a mais alta qualidade e pureza dos substratos antes da transfecção. Como esses ensaios dependem de transfecção transitória, aplicam-se considerações comuns para esses métodos. Isso inclui a otimização da densidade de semeadura, condições de transfecção (incluindo reagentes e quantidades de DNA) e avaliação da adequação em formatos de transfecção direta e reversa. Esses ensaios repórter foram realizados com sucesso com uma variedade de protocolos de eletroporação e lipofecção, e as opções devem ser totalmente exploradas antes de realizar esses ensaios. Deve-se também tomar cuidado para inspecionar os sinais componentes NanoLuc e Firefly, em vez de apenas o sinal de reparo composto derivado da normalização do sinal NanoLuc (substrato repórter) para o sinal Firefly (controle). Artefatos podem surgir da proporção sendo impulsionada por mudanças no sinal Firefly. Por exemplo, avaliar a inibição no modo dose-resposta usando um composto altamente específico deve suprimir o sinal NanoLuc de maneira titulável sem perturbar o sinal Firefly, que deve permanecer estável ( Figura 4G, H ). No entanto, nos casos em que os sinais do Firefly são perturbados, impactos úteis no reparo ainda podem ser determinados pela identificação de uma janela de dose em que o sinal do Firefly não é afetado (Figura 5).

Em comparação com os ensaios repórter DSBR usados com mais frequência, esses ensaios repórter baseados em luminescência extracromossômica têm algumas vantagens distintas. Como as vias DSBR são altamente conservadas, mesmo que a maquinaria celular varie entre os modelos celulares, os ensaios ainda podem relatar a proficiência em DSBR e a escolha da via. Isso abre a avaliação do DSBR para qualquer modelo de interesse do usuário, desde que as condições ideais de transfecção transitória sejam estabelecidas com antecedência.

O uso da Nanoluciferase como gene repórter também oferece vantagens sobre as opções fluorescentes, que têm sido usadas tradicionalmente em ensaios repórter DSBR. O NanoLuc é de maturação rápida e a luminescência é detectada com alta sensibilidade usando um leitor de placas⁸. Juntamente com a velocidade de reparo do substrato (à medida que os substratos repórter são transfectados em células com extremidades DSB prontas para reparo), este formato de ensaio repórter DSBR é ideal para o retorno rápido e a robustez quantitativa necessária para a triagem de pequenas moléculas como parte de uma cascata de descoberta de medicamentos industriais. De fato, descrevemos recentemente a implementação do ensaio repórter MMEJ independente de ressecção na cascata de descoberta usada para a identificação de inibidores de pequenas moléculas do domínio¹³ da polimerase Polθ.

Há também flexibilidade na implementação dos ensaios repórter para abordar questões específicas sobre perturbações genéticas e farmacológicas do DSBR (Figura 3). Por exemplo, antes da transfecção dos substratos repórteres, as células podem ser transfectadas com siRNA contra um gene de interesse por 48-72 h. Alternativamente, os efeitos da superexpressão gênica nas vias DSBR podem ser testados realizando a transfecção de plasmídeo 24-48 h antes da transfecção de substratos repórter. Para estudos farmacológicos, o presente protocolo já descreve como o uso de pequenas moléculas pode ser incorporado ao fluxo de trabalho padrão, mas formatos alternativos podem incluir alterações nos regimes de tratamento de compostos, como pré-incubações ou washouts.

A escalabilidade da transfecção transitória também pode suportar abordagens de triagem em larga escala nas quais a transfecção em lote de substratos repórter é realizada antes da triagem. Além disso, a duração do ensaio desde a transfecção até a leitura também pode ser variada. Embora as durações padrão possam ser de 16 a 24 horas, alguns ensaios podem ser lidos em apenas 6 horas^{por semana}. Preocupações com a toxicidade de pequenas moléculas ou siRNA que podem comprometer a viabilidade celular também devem ser consideradas na determinação da duração do ensaio.

Em resumo, os ensaios descritos neste estudo e totalmente descritos em uma publicação recente⁷ fornecem uma avaliação rápida e robusta da proficiência celular em DSBR. Eles são altamente sensíveis e tituláveis, tornando-os passíveis de estudos genéticos e farmacológicos. Crucialmente, como os substratos repórteres podem ser introduzidos nas células por transfecção transitória, eles têm o potencial de serem utilizados em qualquer modelo de célula transfectável de interesse, em vez de serem restritos a linhagens celulares específicas por integração estável, como é o caso dos repórteres DSBR cromossômicos. No entanto, uma limitação distinta desses ensaios extracromossômicos repórter é que a falta de integração no genoma pode não recapitular totalmente o contexto fisiológico e cromatinizado do reparo do DNA e suas pistas regulatórias e orquestração associadas¹⁵. Para esse fim, os ensaios repórter extracromossômicos são complementares aos métodos existentes de avaliação DSBR e expandem o kit de ferramentas de recursos adequados para pesquisa básica e descoberta de medicamentos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x tampão TBE	Thermo Fisher	AM9863
20% TBE-acrilamida gel	Invitrogen	EC6315BOX
50x tampão TAE	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye, Roxo	NEB	B7024S
(com fundo e tampa transparentes)	Porvair	204012
Agarose	Cleaver Scientific	CSL-AG500
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Para purificação baseada em contas de
DNA Fosfatase Antártica e tampão 10X	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101 Leitor de	Placas
Contador de Células Automatizado Countess II	Thermo Fisher	AMQAX1000	Contador de Células
Oligonucleotídeos personalizados	Sigma-Aldrich	Pedido personalizado	Para substrato MMEJ independente de ressecção. Veja a Tabela 2.
D300e	Tecan	30100152	Dispensador de compostos à base de DMSO
D300e D4+	Tecan	30097371	de alto volume para dispensador de compostos D300e
T8+		Tecan 30097370	de baixo volume para dispensador de compostos D300e
Dimetilsulfóxido, grau de cultura de células	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Veículo para compostos, usado na Figura 4 e Figura 5
Plasmídeos de fonte repórter DSBR	Artios		Disponível para a comunidade acadêmica mediante solicitação
EcoRV-HF e 10x CutSmart buffer	NEB	R3195M
Etanol absoluto	VWR	20821.365
Soro Fetal Bovino	PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder	Thermo Fisher	SM1211	Escada de DNA de baixo peso molecular
Células HEK-293	ATCC	CRL-1573	Exemplo de linha celular usada no protocolo
HindIII-HF e 10x CutSmart buffer	NEB	R3104M
HyClone Biologia Molecular grau água	Fisher Scientific	10275262
I-SceI e 10x Tango Buffer	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
JetPRIME reagente e tampão	PolyPlus	114-15	Reagente de transfecção à base de lípidos
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	Centrífuga para tubos de 15 ou 50 mL
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	Meio de cultura para células HEK-293
Microplaca agitador	Fisherbrand	15504070	Agitador orbital de microplacas
MicroStar 17R	VWR	521-1647	Centrífuga para tubos de 1,5 ou 2 mL
MultiDrop	Thermo Fisher	5840300	Dispensador de reagentes à base de células ou água
padrão MultiDrop	Thermo Fisher	24072670	para dispensador de reagentes MultiDrop
NanoDLR Stop & Glo Buffer e Substrato	Promega	N1630 ou N1650	Reporter luciferase (NanoLuc) reagente para extinguir a luminescência do vaga-lume e detectar a luminescência do NanoLuc. Parte do kit do Sistema de Ensaio Reporter Nano-Glo Dual-Luciferase
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate	Promega	N1630 ou N1650	Controle o reagente de ensaio de luciferase (Firefly) para detectar Firefly. Parte do kit do sistema de ensaio Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter
PBS (sem cálcio ou magnésio)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Plasmídeo Firefly (ou similar)	Promega	E1310 (ou equivalente)	Plasmídeo de controle Firefly
pNL1.1 NanoLuc plasmídeo (ou similar)	Promega	N1091 (ou equivalente)	NanoLuc
Kit de extração de gel QIAquick	Qiagen	28706
Escada de DNA roxa de carga rápida de 1 kb	NEB	N0552S	Escada de DNA de alto peso molecular
Acetato de sódio (3 M), pH 5,5	Thermo Fisher	AM9740	Para ajuste de pH durante a extração de gel com o kit de extração de gel QIAquick
SYBR Gold (10.000x)	Invitrogen	S11494	Para visualização de ssDNA e dsDNA
SYBR Safe (10.000x)	Invitrogen	S33102	Para visualização de dsDNA apenas
T4 DNA Ligase e tampão 10x Ligase	NEB	M0202L
Trypan Blue mancha 0,4%	Invitrogen	T10282	Para medição da viabilidade durante a contagem de células
Solução de tripsina-EDTA; 0,25% de tripsina e 0,53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI e 10x buffer CutSmart	NEB	R0146M