Artigo de método

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

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DOI:

10.3791/66991

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4 de outubro de 2024

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1Sichuan Provincial Key Laboratory for Human Disease Gene Study, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 3Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.

Resumo

O glaucoma é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo, caracterizada por um mecanismo patogênico complexo que torna a restauração da visão desafiadora. Os camundongos servem como modelos animais valiosos para estudar a patogênese e o tratamento do glaucoma devido ao seu histórico genético relativamente homogêneo e às células ganglionares da retina (RGCs), que estruturalmente se assemelham às dos humanos. A avaliação precisa dos danos do RGC e dos resultados do tratamento em modelos de glaucoma de camundongo requer a determinação do número de RGC em toda a retina. Este protocolo descreve um método abrangente que envolve o isolamento de toda a retina, marcação de RGCs com anticorpos específicos e contagem automática rápida e precisa de RGCs usando um programa baseado em IA. A abordagem simplificada permite a quantificação eficiente e precisa dos números de RGC em retinas de camundongos, facilitando a avaliação da degeneração de RGC e possíveis intervenções terapêuticas. Ao permitir que os pesquisadores avaliem a extensão dos danos do RGC, este protocolo contribui para uma compreensão mais profunda da patogênese do glaucoma e auxilia no desenvolvimento de estratégias de tratamento eficazes para gerenciar e prevenir a perda de visão.

Introdução

O glaucoma é caracterizado pela morte progressiva das células ganglionares, o que representa um desafio significativo para a restauração da visão 1,2. Esta doença é um dos principais focos de pesquisa oftalmológica devido à sua prevalência e impacto na visão3. Modelos de camundongos são indispensáveis no glaucoma
pesquisa devido ao seu histórico genético homogêneo, alta capacidade reprodutiva e semelhança de suas propriedades de células ganglionares com os humanos4. O objetivo principal deste método é quantificar com precisão as células ganglionares da retina (RGCs) em modelos de camundongos, o que é essencial para entender a patogênese do glaucoma e desenvolver tratamentos relevantes.

A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica decorre da necessidade de um método confiável e eficiente para avaliar a degeneração do RGC em modelos de camundongos. Os métodos tradicionais, como a rotulagem de RGCs em seções da retina, geralmente fornecem resultados não confiáveis devido à distribuição não uniforme de RGCs na retina5. A quantificação de RGCs em toda a retina reflete melhor as mudanças em seus números e é crucial para avaliar a progressão da doença e as intervenções terapêuticas.

Este método oferece várias vantagens sobre as técnicas alternativas. Por exemplo, a contagem manual de células ganglionares da retina (RGCs) em uma retina normal de camundongo adulto, que contém 40.000 a 60.000 RGCs, pode ser demorada e propensa a erros 6,7,8. O software para contagem automática de RGC que desenvolvemos permite uma contagem precisa em menos de 3 minutos, potencialmente economizando uma quantidade significativa de tempo dos pesquisadores. Além disso, o software baseado em IA usado para contagem automática minimiza o viés e aumenta a reprodutibilidade.

Além disso, esta técnica fornece uma abordagem padronizada para avaliar a degeneração do RGC em diferentes modelos de camundongos e condições experimentais, contribuindo com dados valiosos para o campo da pesquisa do glaucoma. O método se alinha com outros estudos que enfatizam a importância da análise da retina de montagem total para a compreensão das alterações retinianas nas doenças9.

Para ajudar os leitores a determinar se esse método é adequado para sua aplicação, é importante observar que essa técnica é particularmente vantajosa para pesquisadores que estudam a degeneração das células ganglionares da retina (RGC) em modelos de camundongos com glaucoma ou outras doenças da retina. O método é adaptável a várias configurações experimentais e oferece um alto grau de precisão e eficiência na contagem de RGC, tornando-o ideal para estudos de pequena e grande escala. Além disso, o design simples do protocolo e a disponibilidade de software amigável o tornam acessível a pesquisadores com vários níveis de especialização em análise de retina.

Protocolo

O procedimento obedeceu às diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o uso de animais em pesquisa e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Hospital Popular da Província de Sichuan. Camundongos machos C57Bl/6J (2 meses de idade) foram utilizados neste estudo. A Figura 1 ilustra o procedimento geral descrito aqui. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de retinas de montagem total

  1. Sacrifício de animais
    1. Sacrifique os camundongos usando luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) (Figura 2A). Antes da luxação cervical,
      anestesiar os camundongos inalando isoflurano (3% -5% em oxigênio) ou por injeção intraperitoneal da mistura de cetamina / xilazina.
  2. Enucleação e processamento do globo ocular
    1. Marque a borda da córnea no lado dorsal do globo ocular com um marcador azul para lembrar a orientação durante a dissecção subsequente.
    2. Remova os tecidos musculares residuais presos ao globo ocular com uma tesoura. Transfira o globo ocular enucleado para um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL cheio de 1x PBS para um breve enxágue (Figura 2C).
  3. Fixação
    1. Transfira o globo ocular para outro tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL contendo paraformaldeído a 4% (PFA) recém-fabricado para fixação a 4 ° C por 10 min (Figura 2D).
    2. Faça uma pequena incisão (aproximadamente 1-2 mm) na córnea usando uma tesoura fina sob um microscópio de dissecação.
    3. Volte a colocar o globo ocular no fixador para posterior fixação a 4 °C durante 3 h para preservar a morfologia do tecido (Figura 2D).
  4. Remoção da córnea e do cristalino 1,9
    1. Faça uma pequena incisão de aproximadamente 1 mm ao redor do limbo da córnea, a borda entre a córnea e a esclera, usando uma tesoura cirúrgica fina.
    2. Corte cuidadosamente ao redor da circunferência da córnea, extirpando-a inteiramente para expor as estruturas subjacentes.
    3. Use uma pinça fina para segurar suavemente e levantar cuidadosamente a lente dos tecidos circundantes para evitar danos à retina. Mantenha a integridade estrutural da retina com operação delicada.
    4. Transfira a ocular para um tubo de microcentrífuga para processamento posterior.
      NOTA: Extirpar a córnea e extrair a lente com mais eficiência usando a técnica de "fenda cruzada"10. Faça duas fendas perpendiculares na córnea e use uma pinça para extrair o cristalino.
  5. Incisão escleral
    1. Corte um corte preciso na esclera com uma tesoura oftálmica fina para facilitar as etapas de dissecção subsequentes (Figura 2J).
  6. Separação da retina
    1. Insira uma pinça com dentes na incisão entre a esclera e a retina. Segure suavemente a borda da esclera, evitando força excessiva para evitar rasgar o tecido.
    2. Aumente gradualmente a incisão movendo a pinça ao longo da fronteira entre a esclera e a retina com movimentos lentos e constantes das mãos. Use a parte dentada da pinça para separar cuidadosamente a esclera da retina, garantindo que a retina não seja danificada (Figura 2J).
  7. Corte de retina
    1. Divida a retina em quatro abas de tamanhos aproximadamente iguais usando uma tesoura afiada. Certifique-se de que os cortes estejam aproximadamente na metade do caminho em direção ao nervo óptico e orientados a 90° um do outro.
  8. Limpeza da retina
    1. Desdobre suavemente a retina dissecada usando uma escova de cerdas macias e remova meticulosamente os detritos de sua superfície (Figura 2K).
  9. Fixação final
    1. Transfira a retina isolada para um tubo de microcentrífuga contendo PFA fresco a 4% usando uma pipeta Pasteur descartável. Deixe a fixação no gelo por mais 5 h durante a noite para preservação do tecido.

2. Imunocoloração

  1. Lavagem
    1. Lave a retina isolada de montagem total em 1x PBS com agitação suave por 5 min. Descarte a solução PBS. Repita este processo duas vezes para remover o fixador residual e os detritos.
  2. Bloqueio
    1. Mergulhe a retina lavada em uma solução tampão de bloqueio (1x PBS com 4% de soro de burro normal (NDS) e 0,2% de Triton X-100) por 30 min para evitar a ligação inespecífica de anticorpos e aumentar a permeabilização ( Figura 3A ).
  3. Incubação primária de anticorpos
    1. Substitua o tampão de bloqueio pelo anticorpo primário BRN3A (diluído 1:200 no tampão de bloqueio). Incubar a retina durante a noite a 4 °C para permitir a ligação antígeno-anticorpo específico (Figura 3B).
  4. Lavagem
    1. Lave a retina três vezes com 1x PBS por 5 minutos cada para remover anticorpos primários não ligados e reduzir a coloração de fundo (Figura 3C).
  5. Incubação secundária de anticorpos
    1. Incube a retina com anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Alexa594 ou Alexa488 (diluído 1:300) por 2 h em temperatura ambiente para visualizar os antígenos-alvo (Figura 3D).
  6. Lavagem
    1. Realize três lavagens consecutivas com 1x PBS por 5 min cada para remover o excesso de anticorpos secundários e minimizar a ligação inespecífica.
  7. Montagem
    1. Transfira suavemente a retina imunocorada para uma lâmina de microscópio de vidro, achatando-a cuidadosamente para minimizar dobras ou distorções.
    2. Aplique uma pequena gota de meio de montagem anti-desbotamento no centro da retina, garantindo uma distribuição uniforme pelo tecido.
    3. Posicione cuidadosamente uma lamínula sobre a retina montada, evitando bolhas de ar (Figura 3E, F).

3. Processamento de imagem

NOTA: Importe a imagem para o software de contagem automática RGC e comece a contar. O número de células positivas para BRN3A para toda a retina pode ser obtido em minutos. Baixe o software AutoCount do GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Siga as etapas detalhadas de instalação do software abaixo:

  1. Baixe o código no link do GitHub . Um receberá um arquivo chamado "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Descompacte este arquivo.
  2. Baixe os arquivos necessários do disco na nuvem (consulte Tabela de materiais) e descompacte-os. O arquivo baixado é chamado de "yolov5_cpu". Descompacte este pacote na pasta atual para evitar problemas inesperados.
  3. Localize o arquivo de configuração da etapa 1 e modifique seu conteúdo para apontar para o caminho "yolov5_cpu".
    NOTA: Por exemplo, se o "yolov5_cpu" baixado for colocado em "D:\1me\yolov5_cpu_", altere o arquivo "config.ini" na etapa 1 para "D:/1me/yolov5_cpu" (use / em vez de \). (Figura 4A).
  4. Abra a interface gráfica clicando em userinterface.exe. O carregamento inicial pode ser lento (executado como administrador) (Figura 4B).
  5. Após abrir o software, verifique se o arquivo do modelo "pmse_plus.pt" está presente no diretório raiz da unidade C. Se não estiver presente, copie-o para este diretório.
    NOTA: O ficheiro do modelo "pmse_plus.pt" encontra-se na pasta weights da pasta "yolov5", encontrando-se na pasta RGCs de quantificação inteligente extraída (Figura 4C).
  6. Prepare as imagens a serem detectadas.
    NOTA: O software permite que apenas uma ou cinco imagens sejam lidas por vez. Ler mais resultará em um erro.

4. Contagem automatizada de células

  1. Abra o software de contagem (Figura 5A).
  2. Clique em ABRIR IMAGEM para importar a imagem (Figura 5B).
  3. Clique em EXECUTAR para permitir que o software conte automaticamente as células (Figura 5C).
    NOTA: O software marcará as células contadas com uma caixa quadrada vermelha e exibirá a contagem de células no canto superior direito (Figura 5D).

Resultados

Este protocolo detalha a metodologia para imunocoloração de montagem total de retinas de camundongos, garantindo uma preparação meticulosa do tecido, incubação precisa de anticorpos e contagem automatizada confiável de células. O procedimento facilita a marcação e quantificação robustas de células ganglionares da retina (RGCs), permitindo uma avaliação precisa de populações celulares em vários contextos experimentais. O método foi usado para contar RGCs em camundongos do tipo selvagem e modelados para glaucoma, produzindo resultados consistentes. Um resultado representativo mostra que o número de RGCs em um camundongo adulto normal aos 2 meses de idade é de aproximadamente 45.000 (Figura 6).

Para avaliar se o software de IA pode quantificar com precisão os RGCs marcados com BRN3a em modelos normais e de doenças, geramos um modelo de glaucomade glaucoma 7 induzido por N-metil-D-aspartato (NMDA). A retina de montagem total deste modelo foi imunomarcada com anti-BRN3A, e os RGCs foram quantificados usando o software de contagem automática. O resultado indicou uma coloração de fundo relativamente alta (Figura 7). No entanto, o software foi capaz de identificar com precisão quase todos os RGCs. Um total de 15.231 RGCs foram identificados nesta retina, em comparação com aproximadamente 45.000-50.000 RGCs em uma retina normal de camundongo, indicando degeneração grave. Assim, o software de IA também pode ser usado com eficácia para contar RGCs em retinas com qualidade de coloração menos ideal.

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Figura 1: Diagrama esquemático para preparação do RGC. (A) O globo ocular é removido e colocado em 1x PBS. (B) O globo ocular é fixado em 4% de PFA no gelo por 3 h. (C) Remoção da córnea. (D) Extração da lente. (E) A ocular é dividida em 4 abas usando uma tesoura. (F) A esclera é removida e os detritos são removidos suavemente da superfície da retina com uma escova macia. (G) A retina é imunomarcada com anti-BRN3A. (H) Os sinais fluorescentes são fotografados usando um microscópio confocal. (I) Contagem automática de RGCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Isolamento da retina de camundongo de montagem total. (A) O camundongo é sacrificado por luxação cervical. (B) O mouse é colocado em uma superfície plana. (C) O globo ocular é cuidadosamente removido com uma tesoura. (D) O globo ocular é colocado suavemente em 1x PBS. (E) O globo ocular é fixado com uma pinça na borda da córnea. (F) Uma pequena incisão é feita na borda da córnea com uma agulha. (G) A estrutura em forma de tigela é removida após a remoção da córnea. (H) A lente é cuidadosamente removida com uma pinça. (I) Uma pequena incisão é feita ao longo da borda da córnea em direção ao nervo óptico na esclera, evitando danos à retina. (J) A esclera é aberta ao longo da incisão com uma pinça. (K) A retina é achatada e limpa com um pincel. (L) A retina é achatada e rapidamente fixada com metanol gelado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imunocoloração da retina de camundongo de montagem inteira. (A) Após a lavagem com 1x PBS, a retina é bloqueada com um tampão de bloqueio. (B) A retina é incubada com um anticorpo primário a 4 °C durante a noite. (C) A retina é lavada com 1x PBS três vezes. (D) A retina é incubada com um anticorpo secundário por 2 h à temperatura ambiente. (E) A retina é montada em uma lâmina de vidro com RGCs voltados para cima. (F) As imagens são adquiridas usando um microscópio confocal a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Instalação de software de contagem automática. (A) A etapa 1 envolve a atualização do caminho do arquivo para o diretório "yolov5_cpu". (B) A interface gráfica é iniciada. (C) Verificação da presença do arquivo de modelo no diretório raiz da unidade C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Operação do software de contagem RGC automatizado. (A) O software de contagem é aberto. (B) O botão ABRIR IMAGEM é clicado para importar a imagem. (C) O botão RUN é clicado para iniciar a contagem automática. (D) As células contadas são marcadas com uma caixa quadrada vermelha e o número da célula é exibido no canto superior direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Contagem automatizada de RGCs de camundongos. O painel superior (à esquerda) mostra resultados representativos de retina de montagem plana imunomarcada com anti-BRN3A; o painel superior (à direita) mostra a contagem automatizada de RGCs com software desenvolvido anteriormente. Barra de escala: 100 μm. As inserções dos painéis superiores são ampliadas e mostradas no painel inferior, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Contagem de RGC em um modelo de glaucoma de camundongo induzido por NMDA. Painel esquerdo: Visão geral da retina de montagem inteira, mostrando RGCs reconhecidos pelo software de IA. Painel direito: Visão ampliada de uma área parcial da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo fornece um método para determinar todas as células ganglionares da retina (RGCs) em uma retina de camundongo, que pode ser usado para monitorar a progressão da degeneração RGC em modelos de camundongos para estudos de glaucoma. A retina do camundongo é um tecido nervoso delicado5, e isolar as retinas de montagem total dos olhos do camundongo requer prática repetida. Durante a experimentação, verificou-se que o tempo de fixação afeta significativamente a morfologia da retina. Para camundongos com cerca de 2 semanas de idade, um tempo de fixação de 20 min é suficiente para obter bons resultados devido à esclera fina e fraca. No entanto, para camundongos adultos com mais de 2 meses, 20 minutos de fixação são inadequados. Um tempo de fixação de 3 h é ideal para obter retinas intactas de montagem total.

No processo de isolamento da retina, a etapa mais desafiadora é separar a esclera da retina10. A esclera pode ser removida da retina com relativa facilidade usando dois conjuntos de pinças com pontas dentadas. Usando os dois conjuntos de pinças para segurar a esclera e separá-la, a esclera é rasgada em pequenos pedaços e separada da retina.

Uma imagem de alta qualidade das células ganglionares da retina (RGCs) é fundamental para uma contagem precisa. Como a retina é tridimensional, nem todos os RGCs estão no mesmo nível em uma retina plana8. Quando a retina é montada em uma lâmina de vidro, ela deve ser espalhada o mais plana possível para facilitar a imagem subsequente. Durante a imagem, as imagens são adquiridas em vários níveis de foco para capturar todos os RGCs em diferentes áreas de toda a retina.

Em resumo, este protocolo fornece um procedimento padronizado para a contagem automática de todos os RGCs em uma retina de camundongo de montagem plana. Este método permite que os cientistas avaliem com precisão a degeneração do RGC em modelos de camundongos, aumentando a eficiência e a precisão da quantificação do RGC. Essa precisão é crucial para a compreensão e tratamento do glaucoma e doenças relacionadas.

Divulgações

Os autores não têm conflitos a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto de pesquisa foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82371059 (HZ)), o Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan, China (2023JDZH0002 (ZZ)), o Departamento de Ciência e Tecnologia de Chengdu (2022-YF05-01984-SN (HZ)) e o Hospital Popular da Província de Sichuan (30320230095 (JY), 30420220062 (JY)).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 e vezes; PBSServicebioG4202
Alexa594-conjugado com IgG Anti-Coelho para Cabras  (H + L)Anticorpo anti-BRN3A ThermoFisherA-11012
[EPR23257-285]Software Abcamab245230
AutoCounthttps://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Disco em nuvemLinkhttps://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 
Disco em nuvemBaidu linkCódigo de extração: g44khttps://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg 
MarcadorSharpie
Soro Normal de BurroBiosharp, Labgic25030081
ParaformaldeídoMacklinP804536
ProClean 300BeyotimeST853
SacaroseBBI, SangonA610498
Triton X-100BioFroxx, neoFroxx1139ML100
do Google Drive

Referências

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  10. Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).

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