Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.
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Artigo de método
Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O glaucoma é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo, caracterizada por um mecanismo patogênico complexo que torna a restauração da visão desafiadora. Os camundongos servem como modelos animais valiosos para estudar a patogênese e o tratamento do glaucoma devido ao seu histórico genético relativamente homogêneo e às células ganglionares da retina (RGCs), que estruturalmente se assemelham às dos humanos. A avaliação precisa dos danos do RGC e dos resultados do tratamento em modelos de glaucoma de camundongo requer a determinação do número de RGC em toda a retina. Este protocolo descreve um método abrangente que envolve o isolamento de toda a retina, marcação de RGCs com anticorpos específicos e contagem automática rápida e precisa de RGCs usando um programa baseado em IA. A abordagem simplificada permite a quantificação eficiente e precisa dos números de RGC em retinas de camundongos, facilitando a avaliação da degeneração de RGC e possíveis intervenções terapêuticas. Ao permitir que os pesquisadores avaliem a extensão dos danos do RGC, este protocolo contribui para uma compreensão mais profunda da patogênese do glaucoma e auxilia no desenvolvimento de estratégias de tratamento eficazes para gerenciar e prevenir a perda de visão.
Introdução
O glaucoma é caracterizado pela morte progressiva das células ganglionares, o que representa um desafio significativo para a restauração da visão 1,2. Esta doença é um dos principais focos de pesquisa oftalmológica devido à sua prevalência e impacto na visão3. Modelos de camundongos são indispensáveis no glaucoma
pesquisa devido ao seu histórico genético homogêneo, alta capacidade reprodutiva e semelhança de suas propriedades de células ganglionares com os humanos4. O objetivo principal deste método é quantificar com precisão as células ganglionares da retina (RGCs) em modelos de camundongos, o que é essencial para entender a patogênese do glaucoma e desenvolver tratamentos relevantes.
A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica decorre da necessidade de um método confiável e eficiente para avaliar a degeneração do RGC em modelos de camundongos. Os métodos tradicionais, como a rotulagem de RGCs em seções da retina, geralmente fornecem resultados não confiáveis devido à distribuição não uniforme de RGCs na retina5. A quantificação de RGCs em toda a retina reflete melhor as mudanças em seus números e é crucial para avaliar a progressão da doença e as intervenções terapêuticas.
Este método oferece várias vantagens sobre as técnicas alternativas. Por exemplo, a contagem manual de células ganglionares da retina (RGCs) em uma retina normal de camundongo adulto, que contém 40.000 a 60.000 RGCs, pode ser demorada e propensa a erros 6,7,8. O software para contagem automática de RGC que desenvolvemos permite uma contagem precisa em menos de 3 minutos, potencialmente economizando uma quantidade significativa de tempo dos pesquisadores. Além disso, o software baseado em IA usado para contagem automática minimiza o viés e aumenta a reprodutibilidade.
Além disso, esta técnica fornece uma abordagem padronizada para avaliar a degeneração do RGC em diferentes modelos de camundongos e condições experimentais, contribuindo com dados valiosos para o campo da pesquisa do glaucoma. O método se alinha com outros estudos que enfatizam a importância da análise da retina de montagem total para a compreensão das alterações retinianas nas doenças9.
Para ajudar os leitores a determinar se esse método é adequado para sua aplicação, é importante observar que essa técnica é particularmente vantajosa para pesquisadores que estudam a degeneração das células ganglionares da retina (RGC) em modelos de camundongos com glaucoma ou outras doenças da retina. O método é adaptável a várias configurações experimentais e oferece um alto grau de precisão e eficiência na contagem de RGC, tornando-o ideal para estudos de pequena e grande escala. Além disso, o design simples do protocolo e a disponibilidade de software amigável o tornam acessível a pesquisadores com vários níveis de especialização em análise de retina.
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Protocolo
O procedimento obedeceu às diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o uso de animais em pesquisa e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Hospital Popular da Província de Sichuan. Camundongos machos C57Bl/6J (2 meses de idade) foram utilizados neste estudo. A Figura 1 ilustra o procedimento geral descrito aqui. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento de retinas de montagem total
- Sacrifício de animais
- Sacrifique os camundongos usando luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) (Figura 2A). Antes da luxação cervical,
anestesiar os camundongos inalando isoflurano (3% -5% em oxigênio) ou por injeção intraperitoneal da mistura de cetamina / xilazina.
- Sacrifique os camundongos usando luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) (Figura 2A). Antes da luxação cervical,
- Enucleação e processamento do globo ocular
- Marque a borda da córnea no lado dorsal do globo ocular com um marcador azul para lembrar a orientação durante a dissecção subsequente.
- Remova os tecidos musculares residuais presos ao globo ocular com uma tesoura. Transfira o globo ocular enucleado para um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL cheio de 1x PBS para um breve enxágue (Figura 2C).
- Fixação
- Transfira o globo ocular para outro tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL contendo paraformaldeído a 4% (PFA) recém-fabricado para fixação a 4 ° C por 10 min (Figura 2D).
- Faça uma pequena incisão (aproximadamente 1-2 mm) na córnea usando uma tesoura fina sob um microscópio de dissecação.
- Volte a colocar o globo ocular no fixador para posterior fixação a 4 °C durante 3 h para preservar a morfologia do tecido (Figura 2D).
- Remoção da córnea e do cristalino 1,9
- Faça uma pequena incisão de aproximadamente 1 mm ao redor do limbo da córnea, a borda entre a córnea e a esclera, usando uma tesoura cirúrgica fina.
- Corte cuidadosamente ao redor da circunferência da córnea, extirpando-a inteiramente para expor as estruturas subjacentes.
- Use uma pinça fina para segurar suavemente e levantar cuidadosamente a lente dos tecidos circundantes para evitar danos à retina. Mantenha a integridade estrutural da retina com operação delicada.
- Transfira a ocular para um tubo de microcentrífuga para processamento posterior.
NOTA: Extirpar a córnea e extrair a lente com mais eficiência usando a técnica de "fenda cruzada"10. Faça duas fendas perpendiculares na córnea e use uma pinça para extrair o cristalino.
- Incisão escleral
- Corte um corte preciso na esclera com uma tesoura oftálmica fina para facilitar as etapas de dissecção subsequentes (Figura 2J).
- Separação da retina
- Insira uma pinça com dentes na incisão entre a esclera e a retina. Segure suavemente a borda da esclera, evitando força excessiva para evitar rasgar o tecido.
- Aumente gradualmente a incisão movendo a pinça ao longo da fronteira entre a esclera e a retina com movimentos lentos e constantes das mãos. Use a parte dentada da pinça para separar cuidadosamente a esclera da retina, garantindo que a retina não seja danificada (Figura 2J).
- Corte de retina
- Divida a retina em quatro abas de tamanhos aproximadamente iguais usando uma tesoura afiada. Certifique-se de que os cortes estejam aproximadamente na metade do caminho em direção ao nervo óptico e orientados a 90° um do outro.
- Limpeza da retina
- Desdobre suavemente a retina dissecada usando uma escova de cerdas macias e remova meticulosamente os detritos de sua superfície (Figura 2K).
- Fixação final
- Transfira a retina isolada para um tubo de microcentrífuga contendo PFA fresco a 4% usando uma pipeta Pasteur descartável. Deixe a fixação no gelo por mais 5 h durante a noite para preservação do tecido.
2. Imunocoloração
- Lavagem
- Lave a retina isolada de montagem total em 1x PBS com agitação suave por 5 min. Descarte a solução PBS. Repita este processo duas vezes para remover o fixador residual e os detritos.
- Bloqueio
- Mergulhe a retina lavada em uma solução tampão de bloqueio (1x PBS com 4% de soro de burro normal (NDS) e 0,2% de Triton X-100) por 30 min para evitar a ligação inespecífica de anticorpos e aumentar a permeabilização ( Figura 3A ).
- Incubação primária de anticorpos
- Substitua o tampão de bloqueio pelo anticorpo primário BRN3A (diluído 1:200 no tampão de bloqueio). Incubar a retina durante a noite a 4 °C para permitir a ligação antígeno-anticorpo específico (Figura 3B).
- Lavagem
- Lave a retina três vezes com 1x PBS por 5 minutos cada para remover anticorpos primários não ligados e reduzir a coloração de fundo (Figura 3C).
- Incubação secundária de anticorpos
- Incube a retina com anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Alexa594 ou Alexa488 (diluído 1:300) por 2 h em temperatura ambiente para visualizar os antígenos-alvo (Figura 3D).
- Lavagem
- Realize três lavagens consecutivas com 1x PBS por 5 min cada para remover o excesso de anticorpos secundários e minimizar a ligação inespecífica.
- Montagem
- Transfira suavemente a retina imunocorada para uma lâmina de microscópio de vidro, achatando-a cuidadosamente para minimizar dobras ou distorções.
- Aplique uma pequena gota de meio de montagem anti-desbotamento no centro da retina, garantindo uma distribuição uniforme pelo tecido.
- Posicione cuidadosamente uma lamínula sobre a retina montada, evitando bolhas de ar (Figura 3E, F).
3. Processamento de imagem
NOTA: Importe a imagem para o software de contagem automática RGC e comece a contar. O número de células positivas para BRN3A para toda a retina pode ser obtido em minutos. Baixe o software AutoCount do GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Siga as etapas detalhadas de instalação do software abaixo:
- Baixe o código no link do GitHub . Um receberá um arquivo chamado "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Descompacte este arquivo.
- Baixe os arquivos necessários do disco na nuvem (consulte Tabela de materiais) e descompacte-os. O arquivo baixado é chamado de "yolov5_cpu". Descompacte este pacote na pasta atual para evitar problemas inesperados.
- Localize o arquivo de configuração da etapa 1 e modifique seu conteúdo para apontar para o caminho "yolov5_cpu".
NOTA: Por exemplo, se o "yolov5_cpu" baixado for colocado em "D:\1me\yolov5_cpu_", altere o arquivo "config.ini" na etapa 1 para "D:/1me/yolov5_cpu" (use / em vez de \). (Figura 4A). - Abra a interface gráfica clicando em userinterface.exe. O carregamento inicial pode ser lento (executado como administrador) (Figura 4B).
- Após abrir o software, verifique se o arquivo do modelo "pmse_plus.pt" está presente no diretório raiz da unidade C. Se não estiver presente, copie-o para este diretório.
NOTA: O ficheiro do modelo "pmse_plus.pt" encontra-se na pasta weights da pasta "yolov5", encontrando-se na pasta RGCs de quantificação inteligente extraída (Figura 4C). - Prepare as imagens a serem detectadas.
NOTA: O software permite que apenas uma ou cinco imagens sejam lidas por vez. Ler mais resultará em um erro.
4. Contagem automatizada de células
- Abra o software de contagem (Figura 5A).
- Clique em ABRIR IMAGEM para importar a imagem (Figura 5B).
- Clique em EXECUTAR para permitir que o software conte automaticamente as células (Figura 5C).
NOTA: O software marcará as células contadas com uma caixa quadrada vermelha e exibirá a contagem de células no canto superior direito (Figura 5D).
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Resultados
Este protocolo detalha a metodologia para imunocoloração de montagem total de retinas de camundongos, garantindo uma preparação meticulosa do tecido, incubação precisa de anticorpos e contagem automatizada confiável de células. O procedimento facilita a marcação e quantificação robustas de células ganglionares da retina (RGCs), permitindo uma avaliação precisa de populações celulares em vários contextos experimentais. O método foi usado para contar RGCs em camundongos do tipo selvagem e modelados para glaucoma, produzind...
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Discussão
Este protocolo fornece um método para determinar todas as células ganglionares da retina (RGCs) em uma retina de camundongo, que pode ser usado para monitorar a progressão da degeneração RGC em modelos de camundongos para estudos de glaucoma. A retina do camundongo é um tecido nervoso delicado5, e isolar as retinas de montagem total dos olhos do camundongo requer prática repetida. Durante a experimentação, verificou-se que o tempo de fixação afeta significativamen...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos a divulgar.
Agradecimentos
Este projeto de pesquisa foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82371059 (HZ)), o Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan, China (2023JDZH0002 (ZZ)), o Departamento de Ciência e Tecnologia de Chengdu (2022-YF05-01984-SN (HZ)) e o Hospital Popular da Província de Sichuan (30320230095 (JY), 30420220062 (JY)).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 e vezes; PBS | Servicebio | G4202 | |
| Alexa594-conjugado com IgG Anti-Coelho para Cabras (H + L) | Anticorpo anti-BRN3A ThermoFisher | A-11012 | |
| [EPR23257-285] | Software Abcam | ab245230 | |
| AutoCount | https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs | ||
| Disco em nuvem | Link | https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 | |
| Disco em nuvem | Baidu link | Código de extração: g44k | https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg |
| Marcador | Sharpie | ||
| Soro Normal de Burro | Biosharp, Labgic | 25030081 | |
| Paraformaldeído | Macklin | P804536 | |
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| Sacarose | BBI, Sangon | A610498 | |
| Triton X-100 | BioFroxx, neoFroxx | 1139ML100 |
Referências
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
- Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
- Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
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- Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
- Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).
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Reimpressões e permissões
