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Modelo de rato de remodelamento cardíaco do lado direito e arritmia usando bandagem da artéria pulmonar

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DOI:

10.3791/67001

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30 de agosto de 2024

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1Montreal Heart Institute, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Faculty of Medicine, Université de Montréal

Neste artigo

Resumo

A insuficiência cardíaca direita (ICD) é caracterizada por dilatação e hipertrofia cardíaca do lado direito, levando a disfunção ventricular e atrial. As condições cardiopulmonares associadas à ICD são acompanhadas por um risco aumentado de arritmias cardíacas. Este artigo descreve um modelo padronizado de FTE induzida por bandagem da artéria pulmonar associada a arritmogênese ventricular e atrial aumentada.

Resumo

Condições clínicas, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica ou hipertensão arterial pulmonar (HAP), podem levar à sobrecarga crônica da pressão do ventrículo direito e insuficiência cardíaca direita progressiva (ICD). A ICD pode ser identificada por hipertrofia cardíaca direita e dilatação associada à função miocárdica anormal que afeta o VD e o átrio direito (AR). Recentemente, demonstramos que a ICD grave é acompanhada por um risco aumentado de inflamação atrial, fibrose atrial e fibrilação atrial (FA), o tipo mais comum de arritmia cardíaca (AC). Estudos recentes mostraram que a inflamação do VD e da AR desempenha um papel importante na arritmogênese da CA, incluindo a FA. No entanto, o impacto da inflamação no desenvolvimento de AC e FA na ICD é pouco descrito.

Modelos experimentais de ICD são necessários para entender melhor a associação entre inflamação miocárdica direita e AC. O modelo de rato de hipertensão pulmonar (HP) induzida por monocrotalina (MCT) está bem estabelecido para provocar ICD. No entanto, o TCM desencadeia pneumotoxicidade grave e inflamação pulmonar. Portanto, a FTR induzida por TCM não ajuda a distinguir se a inflamação miocárdica subsequente se origina da ICD per se ou de sinais inflamatórios circulantes secretados pelo pulmão lesado.

Neste artigo, um método mecânico envolvendo bandagem do tronco da artéria pulmonar (PAB) foi usado para provocar arritmogênese cardíaca à direita. O PAB consiste na realização de uma sutura permanente do tronco da artéria pulmonar por 3 semanas. Tal abordagem gera maior sobrecarga de pressão do lado direito. No D21 pós-PAB, a sutura resulta em VD e AR hipertrofiados, dilatados e inflamados. A FTD induzida por PAB também é acompanhada por vulnerabilidade a arritmias ventriculares e atriais, incluindo FA.

Introdução

A insuficiência cardíaca direita (ICD) é caracterizada por hipertrofia e dilatação do ventrículo direito (VD) e do átrio (AR), levando ao mau funcionamento cardíaco do lado direito em resposta à sobrecarga pressórica crônica do VD devido à constrição das artérias pulmonares (AP)1. Assim, as condições que provocam o estreitamento da AF podem ser responsáveis por um risco aumentado de FCR 1,2,3,4. Os dados clínicos revelaram que a ICD é a principal causa de hospitalização (56%) em pacientes com hipertensão arterial (HAP)2. Estudos clínicos mostraram que, independentemente da causa da HAP, incluindo hipertensão pulmonar (HP) tromboembólica e HAP idiopática, os pacientes são frequentemente afetados por ICD e são 20% mais suscetíveis a desenvolver arritmias cardíacas, incluindo taquiarritmias supraventriculares e fibrilação atrial (FA)2,5,6.

Para melhor compreensão da associação entre HAP e ICD, estudos em animais, incluindo o modelo de dose única de monocrotalina (TCM), têm sido utilizados para provocar inflamação pulmonar grave e ICR 7,8. Recentemente, observamos que a ICD induzida por TCM foi associada à inflamação da AR e FA9. No entanto, devido à importância da inflamação pulmonar induzida por TCM e citocinas circulantes, foi difícil descrever se a inflamação da AR induzida por TCM é uma consequência apenas da ICD9. Assim, um novo modelo de arritmia cardíaca induzida por ICD foi necessário para estudar o estado inflamatório da AR.

O modelo experimental de bandagem do tronco do PA (PAB) tem sido utilizado em várias espécies animais para mimetizar doenças obstrutivas do PA e estudar o remodelamento cardíaco patológico associado ao lado direito do coração10. A PAB tem sido relatada como um método eficaz para induzir disfunção e falha do VD direito em vários estudos que mimetizam a sobrecarga do VD 10,11,12,13,14,15,16. Tecnicamente, o PAB é a colocação de uma sutura permanente no tronco do AP, provocando uma redução mecânica do diâmetro do tronco do AP10. O PAB gera uma sobrecarga de pressão aumentada para o VD10. Primeiro, como uma adaptação compensatória ao aumento súbito da pós-carga do VD, a cavidade do VD é dilatada, levando à hipertrofia crônica do VD10,13. A dilatação e hipertrofia do VD acometem as valvas tricúspide, que se tornam permeáveis13. Mais precisamente, a dilatação pronunciada do VD combinada com alta pós-carga do VD tem o efeito de alongamento do anel da valva tricúspide localizado entre o VD e o AR 13,17. Devido à oclusão incompleta da válvula, uma porção do sangue ejetado do VD durante a sístole será direcionada para a cavidade da AR17. O extravasamento da valva tricúspide pode ser observado através do ecocardiograma e é denominado regurgitação tricúspide17. Em seguida, a AR recebe pressão arterial inadequadamente elevada, contribuindo para o aumento da dilatação e hipertrofia da AR13. O remodelamento crônico do VD e da AR é acompanhado por reações inflamatórias miocárdicas locais, levando à fibrose do VD e da AR e perda de função 9,13. A fibrose cardíaca é caracterizada pelo desenvolvimento de zonas de baixa voltagem, menos contráteis e mais suscetíveis a provocar bloqueios de condução e circuitos de reentrada envolvidos no desenvolvimento de arritmias cardíacas, incluindo fibrilação ventricular eFA18,19.

A originalidade deste artigo reside na utilização de um método padronizado de remodelamento cardíaco do lado direito induzido por PAB para provocar e estudar a indutibilidade de arritmias cardíacas em 3 semanas pós-PAB. As principais vantagens dessa abordagem cirúrgica são: i) o controle direto sobre a redução do diâmetro do tronco do AP e ii) a prevenção da inflamação pulmonar para focar na inflamação miocárdica induzida por ICD para estudar arritmias cardíacas, incluindo FA.

A abordagem aqui descrita envolve um procedimento microcirúrgico preciso para criar o PAB, avaliação do aumento da pós-carga do VD, ecocardiografia para observar o remodelamento estrutural e funcional miocárdico induzido pelo PAB e estudo eletrofisiológico para avaliar a vulnerabilidade a arritmias cardíacas, incluindo FA.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo comitê de ética do Montreal Heart Institute (números de protocolo: 2021-2938-2021-47-01 e 2024-3412-2024-48-01) e seguiram rigorosamente as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Ratos Wistar machos (225-275 g) com idade entre 6-8 semanas foram utilizados para os procedimentos. Todos os animais foram alojados na unidade de cuidados com animais do Montreal Heart Institute, com acesso gratuito a água e comida.

1. Preparo pré-operatório

  1. Esterilize todos os instrumentos e materiais cirúrgicos antes da cirurgia usando uma autoclave de vapor saturado de alta pressão a temperaturas entre 121 °C e 134 °C abaixo de 15-30 psi por 30-40 min, seguido por um ciclo de secagem de 25 min.
  2. Prepare todos os volumes de medicamentos necessários para a cirurgia. Use uma abordagem analgésica multimodal envolvendo buprenorfina (0,05 mg / kg) e cetoprofeno (5 mg / kg) injetados por via subcutânea 30 minutos antes da cirurgia e repetidos 6 h (buprenorfina) e 24 h pós-cirurgia (buprenorfina e cetoprofeno). Além disso, realizar uma analgesia local no local da incisão (lidocaína 5 mg/mL).
  3. Realize uma ecocardiografia transtorácica basal antes da cirurgia (consulte o procedimento detalhado para ecocardiografia transtorácica nas etapas 6.1-6.13.) para determinar o diâmetro do PA e selecione a agulha de medição apropriada que será usada como eletrodo para gerar a redução esperada de 60% do diâmetro do PA durante o PAB.
    NOTA: Neste trabalho, foram utilizados ratos Wistar machos de 225-275 g, e a utilização de uma agulha de 19 G foi adequada para gerar uma redução de 60% do diâmetro do PA.
  4. Prepare uma agulha de 19 G (ou o calibre apropriado, conforme determinado na etapa 1.3) que será usada como eletrodo (veja abaixo: etapas 4.18 e 4.19) para obter uma constrição ideal do tronco da AP, provocando remodelação severa do coração do rato. Usando uma pinça, dobre o 19 G para 90-110° (Figura 1A).
    NOTA: A flexão do 19 G facilita i) o posicionamento próximo ao tronco do PA e ii) a aplicação da ligadura durante o procedimento. O 19 G é usado como eletrodo em torno do qual a sutura será instalada para reduzir o diâmetro do PA para 1,0 mm (redução de 60% para ratos com peso de 225-275 g), o que induz uma sobrecarga pressórica significativa do VD responsável pelo remodelamento grave do VD em 3 semanas.

2. Indução da anestesia e preparação do animal

NOTA: As análises foram realizadas em ratos Wistar machos (225-275 g) com idade entre 6 e 8 semanas. Use uma almofada de aquecimento durante todas as etapas dos procedimentos a seguir para manter a temperatura corporal do animal em torno de 37 °C. Aplique uma sonda retal para monitorar a temperatura corporal.

  1. Anestesiar o animal com isoflurano 3% inalado continuamente e oxigênio 100% 2-3 L/min.
  2. Aplique gel lubrificante para os olhos para proteger a córnea da dessecação.
  3. Verifique o nível de anestesia usando o reflexo de pinça do dedo do pé.

3. Intubação

NOTA: A intubação foi realizada conforme descrito anteriormente20.

  1. Transfira o animal para uma estação de intubação inclinada em decúbito dorsal. Segure o rato pelos incisivos superiores usando um laço de fio para manter o corpo em posição suspensa a 45° para obter uma melhor visualização da garganta.
  2. Direcione uma fonte de luz flexível para a superfície do pescoço para transiluminar através da região faringoepiglótica.
  3. Estenda a língua usando um cotonete e estabilize-a na maxila com uma espátula de pesagem curva como abaixador da língua.
  4. Visualize a traqueia e as cordas vocais.
  5. Use um angiocateter de 16 G para realizar a intubação. Use o cateter como tubo traqueal e embote a agulha de ponta chanfrada para usar como introdutor.
  6. Avançar o tubo endotraqueal (angiocateter 16 G) montado no introdutor (agulha de ponta chanfrada) na traqueia e, uma vez posicionado, remover o introdutor (Figura 1B).
  7. Confirme a posição correta do tubo observando um padrão respiratório normal (cerca de 80 respirações/min para ratos com peso de 225 g e cerca de 70 respirações/min para ratos com peso de 275 g) e a presença de névoa na superfície da espátula de metal (ou pequeno espelho) quando colocada no flange do cubo da cânula.
  8. Uma vez intubado corretamente, transfira rapidamente o animal para a estação cirúrgica em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento homeotérmico.
  9. Ajuste o volume corrente e a taxa do ventilador de acordo com o peso corporal do rato. Ratos em torno de 225-275 g recebem um volume corrente de 2,0-2,5 mL e 70-80 respirações/min com o ventilador.
  10. Conecte o tubo endotraqueal ao ventilador para iniciar a ventilação mecânica. Coloque a ponta de saída do ventilador em um cilindro de água. As bolhas de ar que saem do fluxo de saída após cada respiração indicam uma intubação bem-sucedida.
  11. Uma vez estabelecida a respiração constante, prenda o tubo endotraqueal com fita cirúrgica e fixe a sonda retal ao longo da cauda para monitorar a temperatura corporal.

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Figura 1: Principais instrumentos necessários para a preparação do procedimento microcirúrgico de PAB. (A) Agulha modificada de 19 G usada como eletrodo para obtenção de um diâmetro de 1 mm do tronco do AP após PAB. (B) Ferramentas endotraqueais usadas ou intubação bem-sucedida de ratos. 1. A espátula é usada como abaixador de língua em ratos anestesiados para expor a traqueia. 2. O cateter 16G atua como um tubo endotraqueal após embotar a ponta de sua caneta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Cirurgia PAB (Figura 2)

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados de acordo com técnicas rigorosas de cirurgia asséptica.

  1. Raspe o lado esquerdo do tórax usando um aparador e creme depilatório e prepare a pele com aplicações de clorexidina a 2% seguidas de esfoliações com álcool a 70% (repetidas três vezes).
  2. Imobilize os membros anteriores em posição aberta com fita adesiva, tomando cuidado para não estender demais os membros para evitar afetar a respiração.
  3. Puxe o membro posterior direito ligeiramente para baixo e fixe-o ao longo da cauda.
  4. Estenda e aduza o membro posterior esquerdo e fixe-o no lado direito do animal para gerar uma leve posição lateral direita, expondo o lado esquerdo do tórax.
  5. Use luvas estéreis nesta etapa para o restante da cirurgia.
  6. Posicione uma cortina estéril sobre o animal e faça uma incisão na pele de 2-3 cm no lado esquerdo do tórax, começando cerca de 2 cm acima do processo xifóide e orientada diagonalmente em direção à base do membro anterior esquerdo do rato.
  7. Sob a pele, separe os músculos peitorais subsequentemente (peitoral menor e maior) e mova-os para o lado por dissecção romba usando uma tesoura de ponta redonda. Use afastadores magnéticos para segurar os músculos, para permitir a visualização adequada da caixa torácica localizada embaixo.
  8. Desinfle os pulmões removendo o tubo de saída (conectado ao ventilador) do cilindro de água (consulte a etapa 3.10). A remoção do tubo de saída da água diminui a pressão nos pulmões, o que gera a desinflação dos lóbulos.
  9. Realize uma toracotomia do lado esquerdo com pinça de dissecação curva. Faça um pequeno orifício na linha clavicular média do músculo localizado entre a3ª e a4ª costelas.
  10. Introduza a pinça curva na abertura e deslize-a ao longo da parede interna esquerda do músculo entre as duas costelas para levantar levemente a parede torácica esquerda e evitar tocar nos pulmões ao cortar o músculo.
  11. Use a pinça introduzida como guia e faça uma incisão longitudinalmente às costelas em aproximadamente 1 cm com uma tesoura de íris. Mantenha a parede torácica esquerda levantada e manipule a tesoura com cuidado para evitar danificar os lobos pulmonares esquerdos diretamente abaixo.
  12. Expanda a incisão intercostal para 1-2 cm à esquerda do animal usando uma tesoura de ponta redonda.
  13. Reposicione os afastadores sob as costelas para manter a ferida aberta.
  14. Observe a parte inferior do timo e uma porção do lobo esquerdo do pulmão.
  15. Afaste o timo e os pulmões neste nível, dado o espaço significativo ocupado por esses órgãos. Separe os lobos do timo usando dissecção romba com fórceps e segure o pulmão do lado esquerdo usando gaze úmida. Em seguida, exponha a porção superior do coração, o átrio esquerdo (AE), bem como o tronco pulmonar e o arco aórtico.
  16. Disseque cuidadosamente a fina camada de pericárdio que cobre o coração nesta área, juntamente com qualquer tecido adiposo aderido, para ajudar a localizar a porção onde a aorta e o tronco pulmonar ainda estão presos. Disseque minimamente o pericárdio e evite tocar na membrana pleural.
  17. Insira a pinça curva em posição fechada no espaço entre o apêndice AE e o tronco pulmonar, no meio da porção visível do vaso, para alcançar o outro lado do vaso (Figura 2A).
    CUIDADO: Evite trabalhar muito perto da raiz aórtica do coração para evitar o risco de ruptura do vaso e hemorragia.
  18. Visualize a ponta da pinça através da membrana conjuntiva cranialmente ao tronco pulmonar. Use a segunda pinça para dissecar sobre a ponta e perfure cuidadosamente a membrana para criar uma pequena abertura. As pinças curvas posicionadas sob o tronco pulmonar são então ligeiramente abertas para agarrar um fio de seda 5-0. Retraia a pinça para trazer o fio de um lado para o outro do tronco pulmonar (Figura 2B, C).
  19. Realize a constrição do tronco pulmonar. Em primeiro lugar, pratique um nó duplo solto do 5-0 Silk perto da artéria. Insira a agulha de 19 G ao longo do recipiente e sob o fio. Aperte este primeiro nó e fixe-o com um segundo nó simples antes de remover o 19 G (Figura 2D).
    CUIDADO: Trabalhe rápida e cuidadosamente para minimizar a duração da obstrução completa do tronco pulmonar.
  20. Faça um último nó simples e corte o fio de seda 5-0 restante a cerca de 0,5-1 cm do nó (Figura 2D).
  21. Reposicione os lobos do timo e remova os afastadores do tórax.
  22. Encha novamente os pulmões beliscando a saída do ventilador por 2 s.
  23. Feche a caixa torácica executando um padrão de ponto de cruz com um fio de sutura sintético absorvível 5-0.
  24. Aplique algumas gotas de soro fisiológico a 0,9% sobre a área da ferida e comprima cada lado da parede torácica para remover bolhas de ar e restabelecer a pressão negativa torácica.
  25. Reposicione os músculos peitorais e limpe o soro fisiológico restante com uma gaze estéril.
  26. Use uma seringa para aplicar um bloco de lidocaína na superfície e na área circundante da ferida.
  27. Feche a pele usando um fio de sutura sintético absorvível 5-0 com agulha em um padrão subcuticular contínuo.
    NOTA: Os ratos simulados recebem o mesmo procedimento sem as etapas 4.18 e 4.19.

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Figura 2: Procedimento PAB e validação da sutura de seda 5.0 versus clipes metálicos. Fotografia do isolamento e ligadura passo a passo do tronco do AP, mostrando (A) a exposição e isolamento do tronco do PA, (B) o posicionamento da sutura (seda 5.0) ao redor do tronco do AP, (C) a ligadura do PA (PAB) (usando uma agulha 19G como eletrodo); (D) a verificação do movimento cardíaco e da sobrecarga da raiz do AP e do VD após o PAB; (E) uma comparação do PAB realizado com sutura de seda versus um clipe de metal; e (F) a validação da escolha da sutura de seda para PAB para criar um diâmetro mais reprodutível de 1 mm ao redor do tronco do PA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Recuperação pós-operatória

  1. Remova o isoflurano enquanto mantém o rato sob ventilação mecânica apenas com fluxo de oxigênio. Vire o rato para o lado direito ou ventral para facilitar a respiração.
  2. Injete um volume de soro fisiológico a 0,9% por via subcutânea na região dorsal do pescoço para promover a recuperação de fluidos (calculado como 10 mL/kg/h de anestesia).
  3. Assim que a respiração autônoma for confirmada, remova suavemente o tubo endotraqueal.
  4. Observe quando o rato começa a se mover sozinho e transfira o animal da almofada de aquecimento para uma nova gaiola estéril para recuperação. Forneça água e comida úmida ad libitum.
  5. Durante o período pós-operatório (4-6 h), coloque a gaiola sobre uma almofada de aquecimento (metade da gaiola) para ajudar a manter a temperatura corporal e monitorar de perto o animal.
  6. Gerencie prontamente quaisquer sinais de dor, dificuldade respiratória ou comportamento anormal.
  7. Nos cuidados pós-operatórios, 6 h após a cirurgia, injetar uma segunda dose de 0,05 mg/kg de buprenorfina. No dia seguinte, 24 h após a cirurgia, injetar uma terceira dose de 0,05 mg/kg de buprenorfina e uma segunda dose de 5 mg/kg de cetoprofeno.
  8. Monitore os ratos até sua recuperação completa da saúde.

6. Ecocardiografia transtorácica

NOTA: Este trabalho mostra os dados obtidos no 21º dia de pós-operatório, quando os ratos foram submetidos ao ecocardiograma transtorácico. No entanto, dependendo dos objetivos da pesquisa e dos requisitos do desenho do estudo, os pesquisadores podem definir outros pontos de tempo para a ecocardiografia transtorácica pré e pós-PAB.

  1. Realize uma ecocardiografia transtorácica basal antes da cirurgia para determinar o diâmetro do PA e selecionar a agulha de calibre apropriada usada como eletrodo para gerar a redução esperada de 60% do diâmetro do PA durante o PAB.
    NOTA: Neste estudo, foram utilizados ratos Wistar machos de 225-275 g e a utilização de uma agulha de 19 G foi adequada para gerar uma redução de 60% do diâmetro do PA.
  2. Pesar e anestesiar os ratos com isoflurano continuamente inalado (3% e 2 L/min O2).
  3. Realizar ecocardiografia transtorácica em cada animal usando uma sonda setor/multielemento 12S (4,5-11,5 MHz) e um sistema de aquisição de imagem.
  4. Use o mapeamento de cores em uma visão de eixo curto paraesternal bidimensional (2D) posicionando a sonda 12S no nível da válvula aórtica. Clique no botão Doppler colorido na máquina de eco para visualizar o padrão de fluxo sanguíneo cruzando a área de bandagem da artéria pulmonar (PAB) no tronco pulmonar.
  5. Realize o Doppler de onda contínua (CW) cruzando o PAB guiado por mapeamento colorido na visão paraesternal de eixo curto 2D para registrar as propriedades do fluxo sanguíneo que atravessa a área do PAB, incluindo a velocidade de pico (cm/s) e o gradiente de pressão média (mmHg). Para obter as curvas de Doppler, ajustar o volume da amostra ao nível da bandagem da artéria pulmonar.
  6. Aplique uma visão apical 2D de 4 câmaras posicionando a sonda 12S ao nível do ápice do coração para demonstrar o aumento da AR e do VD após a cirurgia e determine a dimensão horizontal da AR no final da sístole cardíaca (RADs) expressa em milímetros (mm).
  7. Aplique o mapeamento de cores na visualização apical 2D de 4 câmaras para revelar a regurgitação tricúspide devido ao PAB adquirindo cine-loops na máquina de eco.
  8. Realize a ecocardiografia do modo M na visão apical de 4 câmaras cruzando a conjunção do anel tricúspide e da parede lateral do VD para estudar a excursão sistólica do plano do anel tricúspide (TAPSE) expressa em mm.
  9. Use a imagem Doppler tecidual (TDI) na visão apical de 4 câmaras ao nível da conjunção do anel tricúspide e da parede lateral do VD para a medição da contratilidade sistólica (Sr) da parede lateral do VD expressa em centímetros por segundo (cm/s) para avaliar o desempenho sistólico do VD.
  10. Registre o fluxo transtricúspide diastólico (TTF) usando Doppler de onda pulsada na visão apical de 4 câmaras para estudar as propriedades diastólicas do VD, incluindo velocidade de pico na onda de enchimento inicial (E), onda de enchimento atrial (A) e a proporção de E/A no TTF.
  11. Realize a ecocardiografia do modo M na visão paraesternal do eixo longo ao nível da válvula aórtica para medir a via de saída do VD no final da diástole cardíaca (VSVD, expressa em milímetros) e a dimensão do átrio esquerdo no final da sístole cardíaca (LADs, expressa em milímetros).
  12. Realizar ecocardiografia 2D M-Mode na visão paraesternal de eixo curto ao nível dos músculos papilares para avaliar as dimensões do VE no final da sístole e diástole (LVDs e LVDd); e espessura da parede anterior do VE no final da diástole (VDVEd), todos expressos em milímetros.
  13. Execute o modo M 2D na visão paraesternal de eixo curto para determinar o encurtamento fracionário do VE (LVFS, expresso em porcentagem) e a fração de ejeção do VE (LVEF, expressa em porcentagem).

7. Estudo eletrofisiológico (Figura 3)

  1. Manter os ratos sob anestesia após ecocardiografia in vivo para estudo eletrofisiológico transesofágico (EPS) in vivo .
  2. Insira os eletrodos de ECG sob a pele dos ratos (1 perto do membro anterior esquerdo, 1 perto do membro posterior direito e 1 perto do membro posterior esquerdo).
  3. Introduza suavemente um cateter quadripolar 4F com uma distância interpolar de 5 mm no esôfago (Figura 3A).
  4. Ajuste a posição do cateter transesofágico próximo à AR, determinando com precisão quando a onda P, que representa as contrações atriais no ECG de superfície, corresponde à onda P obtida com o ECG do cateter transesofágico (Figura 3A, B).
  5. Determine o limiar de estimulação para cada animal. Esse limite é a voltagem mínima na qual o estimulador influencia diretamente a frequência cardíaca.
  6. Avalie a vulnerabilidade da FA aplicando uma rajada de tensão equivalente a 4 vezes a tensão limite seguindo um protocolo de 3 séries de 12 rajadas de estimulação, cada uma com duração de 3 s a 50 Hz, seguidas de 2 s de repouso (1 min/série). Entre cada série, os ratos tiveram um período de repouso de 1 min 9,13,21.
  7. Identificar e quantificar, após cada explosão, a ocorrência de taquiarritmias cardíacas, incluindo FA ou flutter atrial.
    NOTA: A FA é definida como batimentos atriais irregulares e ultrarrápidos (>800 bpm). O flutter atrial é definido como um ritmo atrial regular, mas rápido, associado à ausência da onda P ou à presença de um padrão regular de múltiplas ondas P entre intervalos RR regularmente consecutivos. Apenas episódios arrítmicos com duração superior a 1 s são considerados.
  8. Evite interromper episódios contínuos de FA ou flutter atrial interrompendo o próximo conjunto de estímulos se o ritmo sinusal não for recuperado por conta própria dentro do período de repouso entre duas estimulações consecutivas.

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Figura 3: Ilustração dos batimentos cardíacos em repouso e a posição apropriada de um cateter transesofágico para estudo eletrofisiológico in vivo . (A) ECG representativo de dois batimentos cardíacos consecutivos em repouso mostrando a onda P, o intervalo PR, o complexo QRS, o intervalo QT e o intervalo RR. (B) Esquema de uma seção longitudinal do coração (1) e do esôfago (2) em que um cateter quadripolar (3) é introduzido para estimular e adquirir ECG atrial. (C) Sinais de ECG representativos mostrando a posição preferida do cateter transesofágico quando o sinal atrial (linha vermelha) do ECG de superfície (traços superiores) coincide com o sinal atrial do ECG do cateter (traços inferiores). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Análise de ECG

NOTA: Os registros e estímulos de ECG foram realizados usando um software de aquisição de ECG. As análises foram realizadas por meio de um software de análise de ECG (Figura 3A).

  1. Meça a duração da onda P correspondente à contração atrial expressa em milissegundos (ms).
  2. Determine o intervalo PR (expresso em milissegundos) correspondente à duração da condução elétrica através do nó atrioventricular (AV).
  3. Relate a duração do complexo QRS (expressa em milissegundos) correspondente à despolarização ventricular.
  4. Avaliou-se o intervalo QT (expresso em milissegundos) refletindo a duração total da despolarização e repolarização ventricular.
  5. Quantifique o intervalo RR (expresso em milissegundos) indicando a duração entre dois batimentos cardíacos consecutivos e determinando a frequência cardíaca.

9. Análises histológicas

  1. Eutanasiar os ratos por exsanguinação sob anestesia com isoflurano (5%, 2 L/min O2) no dia 21 pós-PAB.
  2. Isolar a AR e o AE para analisar o remodelamento histológico atrial associado ou não à ICD e às arritmias cardíacas.
  3. Realizar um corte transversal dos corações recém-excisados, a 5 mm do ápice, para avaliar o remodelamento ventricular associado ou não à ICD e arritmias cardíacas.
  4. Fixar as amostras miocárdicas em formalina e corar as lâminas histológicas com solução tricrômica de Masson22 para quantificar a espessura e dilatação da parede ventricular e fibrose atrial em D21 pós-PAB.

10. Análises estatísticas

  1. Avalie a normalidade das distribuições pelo teste de Shapiro-Wilk. Compare os dados normalmente distribuídos usando o teste t de Student.
  2. Se os dados forem distribuição não paramétrica, execute um teste de Mann-Whitney. Analise variáveis categóricas como indutibilidade de FA usando o teste exato de Fisher.
  3. Expresse os resultados como média ± erro padrão para a média (S.E.M.). Considere as diferenças estatisticamente significativas em valores de P bicaudal < 0,05.

Resultados

Confirmação visual da ligadura adequada do tronco PA durante a cirurgia
Durante o procedimento de PAB, uma indicação de bom posicionamento da sutura é um aumento imediato da pressão arterial e dilatação imediata do VD e da raiz do tronco do PA na junção com o VD. A sutura não deve se mover para garantir uma sobrecarga de pressão constante e permanente por 3 semanas. Neste estudo, o uso de um Silk 5-0 foi validado como mais estável do que um clipe de metal (Figura 2E,F). O 5-0 Silk também permite a possibilidade de remover a sutura, se exigido por um desenho de estudo específico.

Uma observação importante feita durante este estudo foi que a aplicação de clipes metálicos resultou em formas aleatórias do diâmetro livre em torno do chumbo 19 G, que é uma importante fonte de variabilidade. Neste estudo, foi necessário um diâmetro constante de 1 mm. Além disso, a remoção dos clipes metálicos muitas vezes resultou no rompimento do tronco do PA, o que não é aceitável em um desenho de estudo que exigiria a remoção da sutura para avaliar a restauração da pressão normal (Figura 2E, F).

Confirmação e mensuração da sobrecarga de pressão ventricular direita induzida por PAB (Figura 4 e Figura 5)
A confirmação ideal do aumento da pressão pós-BAP seria a medida hemodinâmica da pressão com cateter intravenoso e intracardíaco, conforme descrito anteriormente9. Para protocolos que requerem preservação do coração por um longo período e abordagens não invasivas, a metodologia ecocardiográfica descrita acima ajudou a avaliar o aumento da velocidade sanguínea e do gradiente de pressão ao redor da sutura usando o CW Doppler (Figura 4A,C). Esse método não invasivo permitiu, inclusive, a visualização da ligadura e da interrupção do fluxo sanguíneo causada pelo estreitamento do diâmetro da artéria pela PAB (Figura 4B,C). Aqui são mostrados os dados ecocardiográficos obtidos no D21 pós-PAB, mas os pesquisadores que aplicam esse método podem realizar essa ecocardiografia transtorácica não invasiva em vários momentos pré e pós-PAB, de acordo com os requisitos de sua investigação específica e objetivos de pesquisa.

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Figura 4: Avaliação da ligadura do tronco do PA pós-PAB. O Doppler de onda contínua em uma visão paraesternal de eixo curto 2D foi usado para visualizar o padrão de fluxo cruzando o tronco PA em PAB em comparação com ratos simulados. (A) Medição da velocidade do fluxo sanguíneo ejetado do VD através do tronco PA em uma simulação (painel esquerdo) e ratos PAB (painel direito). (B) Mapeamento de fluxo de cores do tronco PA em sham (painel esquerdo) e rato PAB (painel direito). O sangue normalmente ejetado do VD e afastando-se do coração com fluxo laminar aparece em azul, e o fluxo sanguíneo turbulento após o PAB devido à obstrução fixa do fluxo de saída do VD aparece em vermelho e amarelo. A ligadura parcial do tronco PA pode ser reconhecida no painel direito devido à opacidade da sutura de seda. (C) Velocidade de pico do PA expressa em cm/s no PAB em comparação com a simulação em D21 pós-PAB. (D) Quantificação do gradiente médio de pressão do PA expresso em mmHg no PAB em comparação com o simulado em D21 pós-PAB. (Análises estatísticas: Os dados foram normalmente distribuídos pelo teste de Shapiro-Wilk. A comparação dos dados foi realizada por meio do teste t de Student. n = 6 ratos por grupo. Os resultados são expressos como média ± S.E.M.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No lado direito do coração, a BAP induziu uma ICD grave confirmada pelo aumento da espessura do VD e dilatação da AR acompanhada de mau funcionamento miocárdico, conforme observado pela ecocardiografia no D21 pós-PAB. Em termos de função do VD, a pressão sistólica do VD foi significativamente aumentada em ratos PAB em comparação com sham, e a ecocardiografia in vivo também revelou que a taxa de contratilidade (Sr) foi diminuída em PAB em comparação com sham (Figura 5A-C). Em comparação com ratos simulados, a dimensão do VD no final da diástole (RVDd) e a espessura da parede anterior do VD no final da diástole (VDAWd) foram significativamente aumentadas. Essas observações ecocardiográficas foram confirmadas após eutanásia e análise histológica da secção transversal do coração de ratos PAB em comparação com sham (Figura 5D). O aumento da capacidade volumétrica do VD em resposta à pós-carga elevada fez com que o septo interventricular fosse empurrado em direção ao VE, gerando uma compressão relativa do VE (Figura 5A,D).

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Figura 5: Confirmação do remodelamento do ventrículo direito induzido por PAB em D21 pós-PAB. (A) Visão apical 2D de 4 câmaras das quatro câmaras cardíacas destacando a dilatação do AR e VD em ratos PAB (painel direito) em comparação com sham (painel esquerdo). O Doppler tecidual foi utilizado para (B) a quantificação da pressão sistólica do VD expressa em mmHg em ratos PAB em comparação com sham e (C) a medição da contratilidade sistólica (Sr) da parede lateral do VD expressa em cm/s em ratos PAB em comparação com sham. (D) Imagens histológicas de seções transversais do coração na simulação (painel esquerdo) e PAB em ratos (painel direito) confirmando que a PAB induziu um aumento significativo do VD em comparação com a simulação. Barras de escala: 5 mm. (Análises estatísticas: Os dados foram normalmente distribuídos pelo teste de Shapiro-Wilk. A comparação dos dados foi realizada por meio do teste t de Student. n = 6 ratos por grupo. Os resultados são expressos como média ± S.E.M.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação da dilatação atrial direita induzida por PAB e regurgitação tricúspide (Figura 6)
A ecocardiografia in vivo realizada no D21 pós-PAB confirmou que os RADs aumentaram significativamente enquanto os LADs permaneceram inalterados, devido ao aumento constante da pressão induzido pelo PAB no lado direito do coração (Figura 5A, Figura 6A, B). A sobrecarga de pressão persistente do lado direito induzida por PAB foi acompanhada pela deformação do anel da valva tricúspide. O mau funcionamento da valva tricúspide induzido por PAB foi avaliado por ecocardiografia in vivo realizada no D21 pós-PAB, pela observação de regurgitação tricúspide caracterizada por extravasamento de sangue para a AR na sístole (Figura 6C-E).

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Figura 6: Avaliação da remodelação induzida por PAB da AR e da válvula tricúspide em D21 pós-PAB. (A) Quantificação da dimensão da AR no final da sístole (RADs) em ratos simulados e PAB medidos por visão apical 2D de 4 câmaras. (B) Quantificação da dimensão LA no final da sístole (LADs) em ratos simulados e PAB. (C) O mapeamento de cores na visão apical 2D de 4 câmaras foi registrado para observar o fechamento normal da valva tricúspide em simulado (painel esquerdo) em comparação com a regurgitação tricúspide caracterizada por vazamento de sangue do VD para a AR de ratos PAB (painel direito) em resposta ao alongamento do lado direito induzido por PAB e deformação do anel da valva tricúspide. (D) A ecocardiografia em modo M em incidência apical de 4 câmaras foi usada para a quantificação da excursão sistólica do plano do anel tricúspide (TAPSE) em ratos PAB em comparação com a simulação. (E) O Doppler de onda pulsada foi usado para a quantificação da velocidade de movimento do anel tricúspide em ratos PAB em comparação com o sham. (Análises estatísticas: Os dados foram normalmente distribuídos pelo teste de Shapiro-Wilk. A comparação dos dados foi realizada com o teste t de Student. n = 6 ratos por grupo. Os resultados são expressos como média ± S.E.M.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação da arritmogênese cardíaca induzida por PAB (Figura 7 e Figura 8)
O remodelamento cardíaco induzido por AB foi observável por análises eletrofisiológicas em D21 pós-PAB. Os parâmetros do ECG, incluindo o intervalo RR, a duração da onda P e o intervalo QT, aumentaram significativamente em ratos PAB em comparação com a simulação (Figura 3A). Essas alterações revelaram que a freqüência cardíaca, a condução atrial e a contratilidade ventricular foram afetadas pela BAP (Figura 7).

Além disso, em comparação com o sham, os ratos PAB foram significativamente mais vulneráveis a arritmias cardíacas, incluindo FA, em resposta a estímulos elétricos (Figura 8).

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Figura 7: Análises do eletrocardiograma. Os parâmetros do ECG (em ms) foram medidos, incluindo (A) intervalo RR, (B) duração da onda P, (C) segmento PR, (D) complexo QRS e (E) intervalo QT. (Análise estatística: Os dados foram normalmente distribuídos pelo teste de Shapiro-Wilk. As comparações foram realizadas pelo teste t de Student. Cada ponto representa um animal individual. n = 6 ratos por grupo. Os resultados são expressos como média ± S.E.M.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Arritmias cardíacas induzidas por PAB, incluindo FA. (A) ECG de superfície representativo observado em ratos sham (painel superior) e PAB (painel inferior) durante o estudo eletrofisiológico mostrando ritmo sinusal (SR), estimulação burst de 3 segundos (estimulação) seguida de recuperação de FA e/ou SR. (B) Quantificação da vulnerabilidade induzida por PAB a taquiarritmias atriais, incluindo FA e flutter atrial (AFl). (C) Duração da FA em ratos sham induzíveis e PAB. (Análises estatísticas: (B) Texto exato de Fisher. (C) n era muito curto em sham para realizar um teste de comparação. n = 6 ratos por grupo. Os resultados são expressos como média ± S.E.M.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mortalidade (Figura 9)
A colocação da sutura em D0 foi acompanhada por uma mortalidade de 30% entre PAB versus 0% em ratos simulados nos minutos até D3 após a cirurgia. Os ratos que sobreviveram aos primeiros 3 dias pós-operatórios sobreviveram até o dia dos experimentos finais (D21). Após o D21, a taxa de mortalidade aumentou significativamente entre os ratos PAB (60% versus 0% em sham) devido à gravidade do remodelamento do lado direito e da FCD (Figura 9).

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Figura 9: Taxa de mortalidade. Mortalidade expressa em porcentagem (%) em ratos sham e PAB entre D0 e D3, D4 e D21, e após D21 pós-operatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O desempenho bem-sucedido do PAB é a parte mais crucial deste protocolo. É importante distinguir adequadamente a aorta e o tronco da AP. O isolamento do PA deve ser realizado meticulosamente para evitar lacrimejamento, sangramento e morte durante o procedimento. A aplicação da sutura ao redor do eletrodo 19G deve ser realizada rapidamente e seguida pela remoção imediata do eletrodo, para evitar "obstrução completa" do AP por muito tempo devido à presença do eletrodo.

De acordo com as exigências das investigações, determinamos que um Silk 5-0 era mais estável do que um clipe metálico para realizar o PAB10,13. Além disso, o 5-0 Silk permitiu a remoção, enquanto os clipes provocaram riscos de rasgar o PA. Os pesquisadores que realizam o PAB devem adaptar a escolha do material de sutura (seda, metal, clipe plástico) de acordo com seus objetivos de pesquisa10.

Neste estudo, o PAB (deixando 1 mm de diâmetro livre) foi seguido por análises in vivo 3 semanas após o PAB. Após 21 dias, a taxa de mortalidade aumentou entre os animais devido à gravidade do remodelamento cardíaco à direita 10,13,23 (Figura 9). Este protocolo foi desenhado e adaptado para nossa exploração do remodelamento cardíaco arritmogênico em 3 semanas. Os pesquisadores que reproduzem esse modelo podem considerar a adaptação do diâmetro usando outro eletrodo que o 19 G e/ou prolongar ou diminuir a duração do remodelamento pós-PAB até a eutanásia23.

A injeção de TCM em dose única é um método reconhecido para induzir HAP grave e FCR 8,9. No entanto, devido à importância da pneumotoxicidade induzida por TCM, esse método não foi relevante em nosso contexto específico, que teve como objetivo estudar o impacto da inflamação na CA induzida por ICD9. A hipótese de pesquisa específica deste estudo exigia o uso de um método de aumento da AF sem lesão pulmonar para evitar a sinalização de inflamação originada do pulmão. Assim, a estratégia PAB foi a melhor opção em nosso contexto13.

Este método pode encontrar aplicações em várias áreas de pesquisa. Em cardiologia, o protocolo PAB pode ser útil no estudo da hipertrofia cardíaca direita, arritmogênese cardíaca e distúrbio valvar (estenose PA, disfunção tricúspide)24,25,26. Em pesquisas sobre envelhecimento, o protocolo PAB pode ser útil para avaliar o impacto da ICD no agravamento da disfunção cardíaca relacionada à idade27. Em pneumologia, o protocolo PAB pode ser usado para estudar o impacto da estenose do tronco do AP na função intrapulmonar28. Entre outros caminhos, o PAB também pode ser útil para avaliar o papel da FCR induzida por PAB de longa data na função cerebral e distúrbios neurodegenerativos29. De modo geral, o impacto da inflamação cardíaca e da fibrose nos distúrbios cardíacos associados é uma grande preocupação30. O modelo PAB de fibrose e inflamação cardíaca oferece uma abordagem padronizada e reprodutível interessante para avaliar os mecanismos associados à inflamação cardíaca e a possibilidade de testar potenciais estratégias intervencionistas31,32.

Dependendo da especificidade do modelo estudado, os pesquisadores podem preferir induzir outros níveis de gravidade da FCR além do descrito neste artigo, utilizando agulhas de calibre diferentes do 19 G apresentado no artigo. Portanto, é importante notar que para diâmetros de eletrodos menores, usando 20 G ou 21 G, tivemos 100% de mortalidade de ratos com peso de 225-275 g minutos após a sutura devido à obstrução do tronco do AP.

A FTD induzida por PAB é um método reprodutível e eficiente para induzir e estudar AC, incluindo FA em ratos. O remodelamento atrial e ventricular provocado pelo PAB estreito (1 mm de diâmetro) é caracterizado por inflamação miocárdica e fibrose, o que confere uma abordagem interessante para investigar a arritmogênese ventricular e atrial associada à ICD.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Colombe Roy, YanFen Shi, Sandra Querry e Josiane Deslandes pelo desempenho técnico da ecocardiografia transtorácica e a Nathalie L'Heureux pela assistência técnica preliminar durante a padronização do método PAB. Somos gratos aos membros do centro de cuidados com animais do Montreal Heart Institute.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Injeção de Cloro de Sódio 0.9% USB (100 ml) Solução JB1302P Baxterutilizada para diluição de fármacos (analgésicos e anti-inflamatórios) e para preparação de seringas de água salina dedicadas à reidratar o animal após a cirurgia
19 G x 1 1/2 Agulha PrecisionGlideBD305187Agulha modificada (dobrada e embotada) para ser utilizada como espaçador durante a constrição parcial do tronco pulmonar
2" x 2" Esponja de gaze não estéreil não tecida, Esponjas deAMD-RitmedA2101-CHusadas para absorver o sangue da ferida ou para empurrar suavemente os órgãos (ex: timo) para o lado.
Esponja de Gaze Ritmed Não Tecida Não Estéril 4" x 4", 4-Ply (x200)AMD-RitmedA2100-CHEsponjas de Gaze usadas para absorver sangue da ferida ou para empurrar suavemente órgãos (ex: timo) para o lado.
5-0 Vicryl Violet Sutura RB-1 1/2 Agulha Circular 17mm 27"EthiconJ303HSutura cirúrgica estéril absorvível sintética com uma agulha cônica usada para fechamento de feridas musculares e cutâneas.
Anafen (100 mg/mL)Merial Canada, Inc.1938126Solução injetável diluída de cetoprofeno administrada como antiinflamatório, analgésico e antipirético não esteróide
AutoClipe  SistemaFST12020-00Pode ser usado para fechar a ferida na pele. Inclui um aplicador de clipe, clipes enrolados (9 mm) e um removedor de clipe.
Fórceps Dumont #5/45 FST11251-35Fórceps Dumoxel com pontas anguladas a 45°. Usado para apertar os nós ao redor do espaçador colocado no tronco pulmonar.
Tesoura Fina - SharpFST14060-10Tesoura de íris de aço inoxidável dedicada à incisão dos músculos intercostais e corte de sutura.
Forano (isoflurano) 100 mLBaxter CanadaBAXCA2L9100Anestésico inalatório usado para roedores durante a cirurgia de PAB.
Cateter IV 16 G x 1,77 " (Reto)BD Insyte381257Cateter utilizado como tubo endotraqueal com o seu estilete metálico embotado.
Luz  LED 130 F - DrMachEickemeyer M130300Luminária LED de parede.
Sistema de Retração do Fixador Magnético: Placa de baseFST18200-50Placa metálica na qual os acessórios associados estão instalados. Ele é colocado ao redor da placa de aquecimento.
Sistema de Retração do Fixador Magnético: Elastômero (Rolo de 2 m)FST18200-07Usado para prender os afastadores aos fixadores.
Sistema de Retração do Fixador Magnético: FixadoresFST18200-02Âncoras móveis que podem ser colocadas na placa de base.
Sistema de Retração do Fixador Magnético: RetractoresFST18200-11Retractores que permitem manter a ferida cirúrgica com a abertura desejada
Tesoura de Metzenbaum (Curva)FST14017-14Tesoura romba de aço inoxidável utilizada para dissecção romba da pele e músculos.
Pinça Micro-AdsonFST11018-12Pinça serrilhada de aço inoxidável usada para agarrar a pele e outros tecidos.
Tosquiadeira Oster Golden A5 2-SpeedOster Professional34264416949Pet tosquiadeira usada para preparar o campo cirúrgico. Como deve ser usado com animais de grande porte, o usuário precisa ter cuidado com ratos.
Placa de aquecimento de roedores ou sistema de aquecimentoPlacaN/Aconectada a uma unidade equipada com uma tela de LED exibindo a temperatura detectada pela sonda retal, bem como a temperatura alvo.
Ventilador para roedores Modelo 683Harvard Apparatus74240-2Ventilador mecânico usado para pequenos animais de laboratório (máx. 5 kg).
Fórceps Semken com serrilhas (curvas)FST11009-13Pinça de aço inoxidável usada para dissecção de tecidos.
Pinça Semken com Serrilhas (Reta)FST11008-13Pinça de aço inoxidável usada para dissecção de tecidos.
Creme de depilação Silky Fresh Veet62200825036Produto de depilação usado para preparar o local cirúrgico após o barbear.
Soluprep 3M103.26Solução anti-séptica engarrafada com clorexidina a 2% e álcool a 70% 225 mL.
Espátula de aço inoxidável 195 mmHeathrow ScientificHS15907Espátula usada como abaixador de língua durante a intubação de ratos.
Sistema de estereomicroscópio SZ61TROlympus88-126Microscópio equipado com binóculos e uma câmera embutida que permite a filmagem de vídeo.
Frasco de irrigação estéril de cloreto de sódio a 0,9% (60 mL)Solução salina H2O25-6048SA-Lusada para manter a ferida úmida durante toda a cirurgia.
Tesoura Cirúrgica - Sharp-Blunt (Reta)FST14001-12Tesoura de aço inoxidável usada para fazer a incisão inicial da pele.
Sutura 5-0 Seda Sem AgulhaHenry Schein102-6344Fio de seda utilizado para fazer a constrição do tronco pulmonar
Pomada SystaneAlcon2444062Lubrificante para os Olhos proporcionando um alívio temporário da queimação e irritação causada pelo ressecamento dos olhos durante a cirurgia.
Suporte para estereomicroscópio SZ2-STU2OlympusN1198900O braço preso à base proporciona uma grande liberdade de movimento à cabeça do microscópio.
Pinça de tecido - 1X2 DentesFST11021-15Pinça de aço inoxidável que permite agarrar, segurar e manipular tecidos (pele e músculos).
Fita Cirúrgica Transpore3M1527-1Fita médica usada para imobilizar os membros anteriores e posteriores dos ratos.
Adesivo de Tecido Vetbond (3 mL)3M1469SBCola cirúrgica que pode ser aplicada em pequenas quantidades na pele Pode ser usada como complemento de suturas subcutâneas.
Vetergesic Multidose (0,3 mg/mL) 10 mLCeva Canada2342510Solução injetável diluída de buprenorfina administrada como analgésico.
Evaporador de anestesia veterinária Tec 4Dispomed34001 IsoPermite a vaporização de isoflurano e concentração em 0– 5%.
gaze de 4 camadas . personalizada

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