O estudo apresenta o Zebra II, um sistema avançado para aquisição e análise prolongada de ECG em peixe-zebra. Este sistema possui um sistema de perfusão independente e eletrodos de múltiplos pontos para o manuseio de vários peixes em ambientes controlados. Os efeitos agudos da amiodarona foram avaliados e analisados com o peixe-zebra do tipo selvagem.
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Artigo de método
Zebra II como um novo sistema para registrar sinais eletrofisiológicos em peixe-zebra
Neste artigo
Resumo
Resumo
O peixe-zebra e suas linhagens mutantes têm sido amplamente utilizados em investigações biomédicas, estudos cardiovasculares e triagem de drogas. No presente estudo, a versão comercial do novo sistema, Zebra II, é apresentada. O protocolo demonstra a aquisição e análise de eletrocardiograma (ECG) de vários peixes-zebra em ambientes de trabalho controláveis. O dispositivo é composto por um sistema de perfusão externo e independente, um eletrodo de 4 pontos, sensores de temperatura e um sistema eletrônico embarcado. Em estudos anteriores, o protótipo do dispositivo foi validado contra o sistema iWORX estabelecido por meio de vários testes, demonstrando qualidade de dados e resposta de ECG semelhantes a intervenções medicamentosas. Em seguida, o estudo se aprofundou no exame do impacto das drogas anestésicas e das flutuações de temperatura no ECG do peixe-zebra, necessitando de avaliação instantânea dos dados. Graças à capacidade do aparelho de administração consistente de anestésicos e medicamentos, foi possível estender a coleta de dados de ECG em até 1 h, marcadamente mais longa do que a duração de 5 min suportada pelos sistemas atuais. Este artigo apresenta uma análise automatizada pioneira, baseada em nuvem, utilizando dados de quatro peixes-zebra, oferecendo um método eficiente para conduzir experimentos combinados e reduzindo significativamente o tempo e o esforço. O sistema mostrou-se eficaz na captura e análise de ECG, especialmente na detecção de arritmias induzidas por drogas em peixes-zebra do tipo selvagem. Além disso, a capacidade de coletar dados em vários canais facilitou a execução de ensaios clínicos randomizados com modelos de peixe-zebra. O sistema de ECG desenvolvido supera as limitações existentes, mostrando o potencial de acelerar muito a descoberta de medicamentos e pesquisas cardiovasculares envolvendo peixes-zebra.
Introdução
As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte em todo o mundo. De acordo com o Relatório de Atualização da AHA de 2024, cerca de 2552 pessoas morrem todos os dias de DCV nos EUA, e o custo médio direto e indireto da DCV foi estimado em US$ 378,0 bilhões em 2017-20181. A fibrilação atrial (FA) é uma das arritmias cardíacas mais comuns nos EUA2 e está associada a um prognóstico desfavorável, aumentando o risco de acidente vascular cerebral e morte em cenários de DCV e doenças não cardiovasculares, levando a um risco aumentado de desfechos adversos3. Esse tipo de arritmia se distingue por sua atividade elétrica rápida e irregular nos átrios, o que geralmente resulta em um ritmo ventricular rápido e irregular4. Além disso, dados os eventos recentes do COVID-19, houve um aumento no número de estudos e evidências que mostram um aumento do aparecimento de arritmia em relação ao COVID-19, principalmente para bradicardia sinusal5. No lado oposto da FA, a bradicardia sinusal apresenta ritmo cardíaco diminuído e mais lento, com frequência cardíaca inferior a 60 batimentos por minuto (bpm). Esse diagnóstico requer um eletrocardiograma (ECG) mostrando um ritmo sinusal normal a uma frequência inferior a 60 bpm.
O peixe-zebra, Danio rerio, provou ser um modelo ideal para estudos cardiovasculares e de desenvolvimento de medicamentos devido à sua homologia com humanos em morfologia, fisiologia e genética6,7. Apesar de ter apenas duas câmaras discerníveis em comparação com o coração de quatro câmaras em humanos, o peixe-zebra possui uma estrutura contrátil semelhante com um sistema de condução análogo8,9. Portanto, o modelo de peixe-zebra é adequado para pesquisar arritmias cardíacas e explorar a associação entre vias genéticas relacionadas e características eletrofisiológicas por meio da análise de ECG. Em relação ao design do sensor para registro de ECG em peixe-zebra, eletrodos de agulha convencionais são comumente usados10. Outros estudos apresentaram alternativas para agulhas convencionais projetando um tipo diferente de agulha feita de diferentes materiais11, estes incorporaram materiais como filamento de tungstênio, aço inoxidável e fio de prata para avaliar a qualidade dos dados registrados. Juntamente com o kit de ECG portátil, eles procuraram estabelecer uma plataforma universal para laboratórios de pesquisa e educacionais.
O sistema de agulhas também foi implantado em outros estudos11,12,13,14 para a realização de pesquisas sobre efeitos biológicos e/ou induzidos por drogas, nos quais apresentou resultados encorajadores. No entanto, para obter sinais ideais, foi necessário inserir cuidadosamente as agulhas na derme do peixe-zebra. Esse procedimento invasivo pode causar lesões no coração do peixe devido à nitidez das agulhas, podendo alterar a morfologia do sinal13. Além disso, colocar com precisão o eletrodo no coração pequeno sem causar danos para garantir uma captura clara do ECG apresenta uma curva de aprendizado significativa. Consequentemente, vários sistemas de sonda substitutos foram introduzidos, como matrizes de microeletrodos (MEA) e sensores impressos em 3D. Tanto nossa equipe quanto outros pesquisadores utilizaram com sucesso o MEA para aquisição de dados, obtendo dados que oferecem uma boa relação sinal-ruído (SNR) junto com alta resolução espacial e temporal15,16,17. Por exemplo, introduzimos um MEA que envolve o coração do peixe, permitindo a captura de sinais de ECG específicos do local15,16. Em contraste, outra equipe desenvolveu um tipo diferente de MEA baseado em uma placa de circuito impresso flexível (FPCB) feita de filme de poliimida com o objetivo de registrar vários eletroencefalogramas (EEGs) para pesquisa de epilepsia18. Embora os MEAs permitam o registro de vários sinais, eles são limitados pela capacidade de avaliar apenas um peixe por vez devido ao número restrito de canais de eletrodos. Em resposta a essa limitação, apresentamos recentemente um sistema avançado capaz de gravações simultâneas de ECG de vários fish19. Este sistema emprega dois eletrodos, cada um com 125 μm de espessura e feitos de poliimida, com eletrodos pulverizados a ouro posicionados na parte inferior de seu invólucro para facilitar a aquisição de dados. No entanto, a inclusão de uma bomba de circulação de água introduziu ruído, afetando a qualidade da relação sinal-ruído (SNR) dos sinais de ECG. Além disso, foi necessário o uso de ferramentas de coleta de dados volumosas e caras, que exigiam uma conexão com fio a um computador. No mercado, sistemas como o iWORX oferecem portabilidade aprimorada por meio de um amplificador compacto, mas enfrentam problemas não resolvidos: (i) seu tempo de gravação é muito curto (3-5 min) para experimentos que precisam de durações mais longas, como aqueles que envolvem efeitos agudos de drogas; (ii) a necessidade de anestesiar os animais, o que pode estressá-los e distorcer os dados eletrofisiológicos cardíacos inatos; (iii) medições manuais e sequenciais dificultam a pesquisa com um grande número de peixes; e (iv) a necessidade de processamento de dados de ECG off-line e trabalhoso. É importante ressaltar que ainda não surgiram sistemas de alto rendimento que incorporem microeletrônica para analisar fenótipos mutantes. Portanto, a criação de sistemas de alto rendimento que permitem o registro estendido de ECG é crucial para descobrir ligações entre fenótipos arrítmicos e genótipos mutantes, identificando vários fenótipos arrítmicos associados a genótipos mutantes únicos e testando a eficácia de medicamentos cardíacos usando o modelo de peixe-zebra. Consequentemente, introduzimos, em 2022, o protótipo inovador do sistema Zebra II. Este novo sistema está equipado para realizar gravações de ECG estendidas de vários peixes ao mesmo tempo. Para conseguir isso, foi criado um sistema eletrônico interno, utilizando a tecnologia Internet das Coisas (IoT) para transmissão de dados sem fio e permitindo a análise de dados por meio de um aplicativo móvel. A inclusão da tecnologia IoT não apenas reforçou a flexibilidade e a portabilidade do sistema, mas também facilitou colaborações remotas para pesquisas sobre modelos de peixe-zebra. Em um estudo anterior, validamos a eficácia do sistema por meio de testes extensivos, mostrando sua capacidade de 1) adquirir dados de ECG simultaneamente de quatro peixes; 2) realizar registros contínuos de ECG por até 1 h, o que excede significativamente a capacidade dos sistemas existentes que captam apenas alguns minutos; 3) minimizar os efeitos de confusão da anestesia, empregando uma concentração reduzida de 50% de tricaína. Além disso, o sistema demonstrou uma forte capacidade de longas gravações de ECG em vários experimentos, como aqueles envolvendo bloqueio sinoatrial (SA) induzido por sódio, alterações na frequência cardíaca induzidas pela temperatura e arritmias induzidas por drogas em peixes mutantes Tg (SCN5A-D1275N) e selvagens sob condições experimentais controladas. A adoção pelo sistema de múltiplos canais de eletrodos para registro estendido de ECG permite ainda a execução de ensaios clínicos randomizados, permitindo que dois peixes por grupo experimental sejam estudados em condições idênticas20. Neste artigo, apresentamos a versão atualizada do sistema, com um eletrodo de 4 pontos. Esse aprimoramento permite que os usuários capturem leituras de ECG de vários locais no peixe, reduzindo significativamente a chance de obter sinais de ECG de baixa qualidade. Além disso, esta iteração se baseia e refina a maioria das funcionalidades descritas em pesquisas anteriores19. Este sistema de ECG evoluído mostra-se muito promissor para abordar as limitações existentes, facilitando substancialmente a análise de fenótipos arrítmicos e a triagem de drogas em peixe-zebra. A adição inovadora do eletrodo de 4 pontos foi rigorosamente testada por meio de um breve estudo sobre arritmia induzida por drogas em peixes-zebra do tipo selvagem, validando ainda mais sua eficácia.
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Protocolo
Aderir estritamente às diretrizes éticas garante o bem-estar e o manuseio adequado do peixe-zebra envolvido em nossos experimentos. Todas as atividades experimentais foram conduzidas de acordo com os padrões estabelecidos pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Os experimentos e descobertas detalhados aqui foram executados com a aprovação da IACUC sob o protocolo autorizado AUP-21-066.
1. Preparação e armazenamento de soluções-mãe
CUIDADO: Prepare a solução estoque de tricaína em uma hotte, usando equipamento de proteção individual (EPI) adequado.
- Meça 400 mg de pó de tricaína e dissolva-o em 97,9 mL de água deionizada (DI). Coloque um agitador magnético no recipiente e misture gradualmente a solução.
- Ajuste o pH adicionando incrementalmente menos de 17 mL de solução de NaOH. Continue adicionando gotas de NaOH até que o pH atinja uma faixa de 6,8.-7,2.
- Determinar a concentração final da solução de tricaína, levando em conta o NaOH adicionado necessário para ajustar o pH e armazenar.
NOTA: A solução de tricaína é sensível à luz e deve ser armazenada em um recipiente de cor âmbar a 4 ° C quando não estiver em uso. - Meça 258,13 mg de amiodarona e dissolva-o em 1 L de água DI. Insira um agitador magnético no recipiente e mexa por alguns minutos até que a solução esteja completamente dissolvida e livre de qualquer pó. Armazene a solução dentro de uma geladeira a 4°C quando não estiver em uso.
NOTA: A amiodarona deve ser preparada dentro de uma hotte e armazenada dentro de um frigorífico a 4 °C. Use sempre o EPI adequado.
2. Piscicultura
- Mantenha os peixes em tanques individuais ligados a um sistema de circulação de água, mantendo a temperatura entre 28-29°C.
- Garanta o monitoramento contínuo da qualidade da água e siga um ciclo dia-noite de 14 h / 10 h.
- Divida os 40 peixes em quatro grupos, cada um composto por 10 peixes, e abrigue-os em tanques separados.
3. Configurando o dispositivo
NOTA: O procedimento descrito na etapa 3.2 deve ser executado para cada câmara do dispositivo (Figura 1). Embora cada câmara possa ser configurada de forma diferente, para consistência no experimento, é aconselhável manter configurações uniformes em todas as câmaras.
- Conecte o dispositivo a uma fonte de alimentação e inicie a operação pressionando o botão vermelho localizado no painel frontal.
- Navegue pela tela sensível ao toque do dispositivo para escolher a câmara a ser configurada.
- Ajuste a configuração do filtro passa-baixo para 0.1 Hz e a configuração do filtro passa-alto para 500 Hz. Ajuste a configuração de ganho para 10,000.
- Levante a tampa frontal para acessar as quatro câmaras. Antes de iniciar o experimento, mergulhe a esponja de cada câmara (esponja de celulose padrão) em solução de tricaína e, em seguida, esprema o excesso de líquido.
- Gire o conjunto de quatro eletrodos para garantir que a esponja esteja acessível antes de introduzir o peixe.
4. Tratamento com amiodarona
NOTA: Utilize a água dos tanques de peixes (água dos peixes) para preparar soluções diluídas de amiodarona e tricaína. As etapas 4.3 e 4.4 devem ser repetidas para cada grupo separado na etapa 2.3 para cada solução preparada na etapa 4.1.
- Siga as etapas descritas abaixo para diluir a solução estoque de amiodarona.
- Diluir 8,75 ml de solução-mãe em 41,25 ml de água de peixe para atingir uma concentração de 70 μM.
- Diluir 12,5 ml de solução-mãe em 37,5 ml de água de peixe para atingir uma concentração de 100 μM.
- Diluir 25 ml de solução-mãe em 25 ml de água de peixe para atingir uma concentração de 200 μM.
- Prepare a solução anestésica diluindo 4 mL de solução estoque de tricaína em 100 mL de água de peixe, resultando em uma concentração de tricaína de 0,16 mg / mL
- Mergulhe cada peixe individualmente na solução de amiodarona preparada por 5 min. Use temporizadores para monitorar com precisão a duração da imersão.
- Transfira o peixe para uma solução de tricaína por 2-3 min para anestesia. Certifique-se de que o tratamento não cause a morte do peixe. Se um peixe apresentar um comportamento anormal, como perda de cor ou redução significativa no movimento branquial, remova-o da solução imediatamente e coloque-o de volta na água limpa do peixe.
5. Coleta de dados de ECG
NOTA: Siga imediatamente estas instruções após concluir a etapa 4.4. Repita o processo para cada câmara antes de selar o dispositivo. As câmaras são projetadas para acomodar peixes que variam de 4 a 10 mm de largura e 25 a 50 mm de comprimento.
- Retire o peixe da solução de tricaína e coloque-o na esponja, certificando-se de que o lado ventral esteja voltado para cima.
- Posicione o feixe de eletrodos em forma de losango sobre a área do peito do peixe para capturar sinais de ECG de quatro pontos diferentes simultaneamente (Figura 2A,B). Certifique-se de ajustar cada eletrodo com cuidado para que cada pino entre em contato com a pele do peixe.
- Gire cada eletrodo, abaixando o pino até que ele entre em contato com a parte inferior do peixe. Se o pino estiver muito alto, gire o parafuso correspondente no sentido horário para abaixá-lo até que toque no peixe.
- Execute o ajuste descrito acima para os eletrodos em todas as câmaras.
- Feche a tampa das câmaras assim que todos os feixes de eletrodos estiverem posicionados corretamente sobre os peixes nas câmaras operacionais.
- Marque cada câmara para gravação selecionando-a na tela sensível ao toque e, em seguida, inicie a gravação clicando no botão Gravar na tela.
- Clique no botão Parar após 2 minutos e, em seguida, clique no botão Salvar nas janelas de prompt que aparecem na tela após a parada. Salve as informações em um disco ou na nuvem, dependendo das necessidades específicas de pesquisa.
6. Solução de problemas do sistema de posicionamento da matriz de quatro eletrodos
NOTA: Ocasionalmente, um ou vários eletrodos podem falhar em capturar um sinal claro de ECG, necessitando de reposicionamento. Use as etapas a seguir para solucionar problemas do feixe de eletrodos quando necessário.
- Pressione o botão Parar na interface do dispositivo para interromper o processo de gravação e identificar o canal ou canais com sinais inconsistentes.
- Levante a tampa frontal para acessar as câmaras dos eletrodos. Identifique quais câmaras e eletrodos específicos estão causando problemas.
- Gire o parafuso superior no sentido horário para ajustar a proximidade do eletrodo com o peixe. Esta ação abaixará o eletrodo para mais perto do peixe.
- Repita a etapa 6.3 conforme necessário. Se apenas aproximar-se não resolver o problema, gire o eletrodo para um ponto diferente no peixe até que um sinal satisfatório seja alcançado.
7. Extraindo e analisando dados
NOTA: Toda a análise básica de dados apresentada neste artigo usa a técnica Wavelet21 para reduzir vários tipos de ruído e desvio padrão dos batimentos sinusais normais (SDNN) para calcular a variância batimento a batimento da FC em segmentos de um minuto.
- Depois que os dados forem salvos no disco ou na nuvem, recupere-os para análise ou envie-os diretamente para um servidor em nuvem para processamento posterior.
- Navegue até os dados salvos clicando no botão Procurar na tela e selecione os conjuntos de dados a serem usados.
- Selecione o botão Extrair nas opções na tela e conecte uma unidade USB à parte traseira do dispositivo para extrair os dados.
- Siga as instruções do dispositivo para salvar os conjuntos de dados selecionados na unidade externa para recuperação e análise subsequentes.
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Resultados
A capacidade de registrar simultaneamente sinais de ECG de múltiplos peixes distingue significativamente este dispositivo, oferecendo uma vantagem considerável na redução do tempo necessário para pesquisas com medicamentos ou estudos cardíacos em peixes-zebra ou outras espécies semelhantes (Figura 1). O registro de sinais de ECG precisos pode ser desafiador devido às variações anatômicas entre os peixes, especialmente no que diz respeito ao posicionamento dos eletrodos. Tradicionalmente, obt...
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Discussão
As etapas atuais foram modificadas e aprimoradas de acordo com esta nova versão do dispositivo de um estudo anterior feito por nossa equipe20. Aqui, um design assistido por computador (CAD) rotulado do dispositivo também está incluído.
Conforme destacado no guia de solução de problemas do protocolo, o dispositivo exige que o usuário execute certas etapas críticas com diligência e precisão, pois essas etapas afetam crucialmente a qualidade do sinal de ECG. Consistente co...
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Divulgações
Hung Cao e Michael Lau são os fundadores da Sensoriis, Inc. O sistema Zebra II da Sensoriis foi desenvolvido com o apoio do NIH, #R44OD024874 de concessão da Fase II do SBIR. A Universidade da Califórnia, Irvine, revisou e aprovou o relacionamento de Hung Cao com a Sensoriis, Inc. de acordo com suas políticas de conflito de interesses. Os demais autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Somos gratos pelo apoio do NIH SBIR Fase II #R44OD024874 para HC e MPHL Os autores também gostariam de agradecer o apoio financeiro fornecido pelo Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) no México por meio da bolsa intitulada Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloridrato de amiodarona | Sigma-Aldrich | PHR1164-1G | Amiodarona em pó |
| Medidor de pH/mV de bancada | Sper Scientific | 10500308 | |
| Etileno3-Aminobenzoato, Sal de ácido metanossulfônico, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC118002500 | Pó de tricaína |
| Isotemp Agitador de placa quente | Fisher Scientific | SP88854200 | |
| Sistema Zebra II | Sensoriis | N / A | Sistema de Gravação de ECG de Peixe-Zebra Comercial |
| Sistema de ECG de Peixe-Zebra | iWorx | ZS-200 | Sistema de Gravação de ECG de Peixe-Zebra Comercial |
Referências
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Reimpressões e permissões
