Melhorando os resultados dos alunos com uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso de clonagem molecular adaptável

Resumo

Um módulo de clonagem molecular adaptável da Gibson Assembly foi empregado em um formato de experiência de pesquisa de graduação (CURE) baseado em curso para alunos do curso de laboratório de biologia molecular. A avaliação dos resultados de aprendizagem dos alunos mostrou melhor compreensão e confiança na clonagem molecular após a conclusão do CURE, e novos plasmídeos foram clonados para pesquisa de biossíntese de produtos naturais.

Resumo

O avanço contínuo das técnicas de biologia molecular exige que os currículos de biologia molecular sejam regularmente refinados para preparar efetivamente os alunos para entrar no mercado de trabalho com competências modernas. Em particular, o surgimento da Gibson Assembly, uma técnica de clonagem molecular altamente personalizável e adaptável, avançou o cenário da clonagem molecular em vários ambientes de pesquisa. Assim, criamos um módulo de clonagem Gibson Assembly para implantação em um curso de laboratório de biologia molecular na California Polytechnic State University, San Luis Obispo e avaliamos os resultados de aprendizagem dos alunos do módulo. Ao longo de três iterações do curso, os alunos participaram de um projeto independente baseado em experimentos que envolveu a clonagem de três bibliotecas de plasmídeos exclusivas para apoiar projetos de pesquisa em biossíntese de produtos naturais. Os alunos receberam pré e pós-questionários para avaliar sua compreensão da clonagem molecular e sua confiança nos termos e técnicas de biologia molecular. As respostas dos alunos mostraram um aumento significativo tanto no aprendizado de conceitos de clonagem molecular quanto na confiança auto-relatada com termos e técnicas de clonagem molecular. Esta estrutura de módulo pode ser generalizada para ensinar Gibson Assembly para várias aplicações, fornecendo aos instrutores um kit de ferramentas para ensinar uma tecnologia de clonagem adaptável e emergente enquanto avançam em seus projetos de pesquisa.

Introdução

Treinar alunos de graduação em conceitos fundamentais de biologia molecular e técnicas laboratoriais é crucial para seu desenvolvimento científico e profissional, pois essas metodologias são comuns em vários ambientes de pesquisa, incluindo academia e indústria. Como tal, os alunos dos cursos de biologia (concentração de biologia molecular e celular) e bioquímica da California Polytechnic State University, San Luis Obispo (Cal Poly) são obrigados a fazer um curso de laboratório de biologia molecular de divisão superior para aprender e aplicar esses tópicos (CHEM / BIO 475). Um currículo básico para este curso foi desenvolvido anteriormente, no qual os alunos realizam clonagem baseada em topoisomerase (TOPO) para montar um plasmídeo contendo actina que é preparado a partir de um modelo de DNA complementar de levedura (cDNA)¹. Os alunos projetam experimentos com base em perguntas que imitam hipóteses de pesquisa autênticas, aumentando sua familiaridade com as práticas de laboratório e o aprendizado baseado em investigação. O avanço contínuo no campo da biologia molecular exige que os currículos correspondentes se adaptem para preparar os alunos com competências modernas para a força de trabalho. Em particular, o uso de Gibson Assembly tornou-se mais predominante na comunidade científica; embora o método tenha sido originalmente estabelecido para sintetizar cromossomos artificiais², mais de 5.000 publicações no momento deste relatório fizeram referência ao trabalho original de Gibson et al. O Gibson Assembly é único em comparação com as metodologias tradicionais de clonagem: é altamente personalizável e pode facilmente ligar vários fragmentos lineares de DNA sem a necessidade de locais de restrição para produzir as junções. Assim, vimos a oportunidade de reformular o currículo CHEM / BIO 475 para incorporar técnicas modernas de clonagem molecular e melhorar o modelo de curso baseado em investigação.

Foi estabelecido que as experiências de pesquisa dos alunos contribuem para aumentar a compreensão conceitual, o desenvolvimento de habilidades e a persistência na ciência³, mas nem todos os alunos de graduação têm a oportunidade de participar diretamente de um laboratório de pesquisa. Para enfrentar o desafio da capacidade limitada dos alunos em laboratórios de pesquisa, experiências de pesquisa de graduação baseadas em cursos (CUREs) foram desenvolvidas e empregadas para aumentar a acessibilidade à ciência por meio de pesquisas autênticas em sala de aula. Embora os CUREs variem em sua implementação, práticas comuns que abordam os cinco princípios da pesquisa científica foram estabelecidas. Em um CURE bem projetado, os alunos irão 1) usar práticas científicas, 2) colaborar em um projeto de pesquisa, 3) tentar fazer novas descobertas, 4) contribuir para o trabalho relevante fora da sala de aula e 5) reavaliar e revisar hipóteses e métodos em caso de falha experimental⁴. Semelhante às experiências tradicionais de pesquisa dos alunos em um laboratório, os CUREs demonstraram fortalecer a confiança dos alunos na ciência, nas habilidades científicas, na propriedade do projeto e na persistência em ciência, tecnologia, engenharia e matemática (STEM)⁵. Embora CUREs envolvendo clonagem molecular tenham sido relatados anteriormente 6,7,8,9,10,11,12,13, não temos conhecimento de nenhum que enfatize a adaptabilidade da Gibson Assembly para fazer uma biblioteca de plasmídeos de pesquisa autênticos.

Aqui, relatamos uma expansão do atual currículo CHEM / BIO 475 baseado em investigação na California Polytechnic State University, San Luis Obispo, com duas grandes melhorias: experiência prática usando Gibson Assembly e participação dos alunos em um CURE, que forneceu construções de plasmídeo originais para projetos de pesquisa financiados pela National Science Foundation (NSF-1708919 e NSF-2300890). Ao longo de três implementações deste currículo, os alunos contribuíram para dois projetos de pesquisa distintos focados na biossíntese de produtos naturais de moléculas bioativas produzidas por Actinomycetota. Os produtos naturais geralmente contêm farmacoforos com atividades antibióticas, antifúngicas e/ou anticancerígenas, dando a essas pequenas moléculas importância nos esforços de descoberta de medicamentos e potencial de relevância clínica¹⁴. Esta pesquisa requer a criação de bibliotecas de plasmídeos para permitir investigações da função e do potencial de engenharia das enzimas biossintéticas bacterianas. Neste CURE, os alunos projetaram e realizaram experimentos de montagem Gibson para clonar as bibliotecas de plasmídeos exclusivas pertinentes a esses projetos de pesquisa (Figura 1). Além disso, o formato e o design do módulo são distintos porque são facilmente adaptáveis para gerar quaisquer plasmídeos de interesse para outros projetos de pesquisa.

Figura 1: Visão geral do papel da Gibson Assembly em nosso laboratório de pesquisa. Actinomycetota produz produtos naturais de pequenas moléculas com bioatividades clinicamente relevantes usando clusters de genes que codificam enzimas biossintéticas. Em nossa pesquisa, plasmídeos contendo um gene biossintético são montados via Gibson Assembly para investigações a jusante da função da enzima codificada. Ícones da ciência de Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Visão geral do laboratório

O Laboratório de Biologia Molecular é um curso de divisão superior necessário para graduados em bioquímica e biologia com concentração em biologia molecular e celular. Outros alunos que atendam aos pré-requisitos são bem-vindos para fazer o curso como uma eletiva de divisão superior. O curso é co-listado entre o Departamento de Química e Bioquímica e o Departamento de Biologia da Cal Poly. O corpo docente de ambos os departamentos se reveza no ensino do curso a cada semestre (dois trimestres de Biologia, um quarto de Química e Bioquímica).

A turma se reúne no laboratório duas vezes por semana por períodos de 170 minutos e uma vez por semana para uma palestra de 50 minutos. As seções de laboratório contêm no máximo 16 alunos e 2 a 3 seções de laboratório são oferecidas a cada trimestre. O curso dura 10 semanas e o exame final é administrado durante a última reunião da semana 10. O tempo de aula é gasto discutindo a teoria por trás de muitas das técnicas experimentais conduzidas no laboratório, bem como tópicos atuais em biologia molecular que não são abordados no laboratório. O currículo básico do laboratório abrange o processo de clonagem do gene da actina da levedura¹, que leva aproximadamente 7 semanas (13 a 14 reuniões de laboratório). As técnicas incluem micropipetagem, isolamento de RNA de levedura, amplificação de um gene de levedura usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), clonagem TOPO, triagem azul-branca, isolamento de plasmídeo e verificação de inserção por digestão de restrição e PCR, análise in silico de clones e análise de sequência de DNA. O currículo das últimas 3 semanas do curso fica a critério do instrutor, mas envolve os alunos concluindo um "projeto independente" com resultados indefinidos.

Visão geral do experimento

Um foco do nosso grupo de pesquisa são as vias biossintéticas em Actinomycetota. Ao projetar o projeto independente, imaginamos que os alunos criassem plasmídeos por meio da Gibson Assembly para uso em nossos projetos de pesquisa que investigam a biossíntese de produtos naturais. Embora as iterações do módulo do curso avaliadas aqui sejam específicas para plasmídeos que permitem a manipulação de vias biossintéticas, o fluxo de trabalho da Gibson Assembly é extremamente adaptável para outros projetos de clonagem molecular (Figura 2). O fluxo de trabalho foi dividido em três experimentos diferentes (A, B e C) que foram concluídos em dois períodos de aula e seis períodos de laboratório (3 semanas no total) (consulte o Arquivo Suplementar 1 e o Arquivo Suplementar 2). Os experimentos foram precedidos por planilhas para apoiar a preparação do aluno e avaliar a compreensão do aluno (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5). O fluxo de trabalho é apresentado em um formato flexível às necessidades e interesses de um instrutor.

Figura 2: Fluxo de trabalho do módulo Gibson Assembly. O dia 1 e o dia 4 são períodos de aula em que os alunos concluem a análise de sequência in silico e o projeto experimental. Os dias 2 a 3 e 5 a 8 são reuniões de laboratório onde são realizadas as etapas para clonar novos plasmídeos por meio da Gibson Assembly, seguidas de isolamento e triagem. O fluxograma pictórico é agrupado pelos três experimentos que os alunos realizam (A, B e C). Instruções e protocolos mais detalhados podem ser encontrados nos Manuais do Instrutor e do Aluno fornecidos como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2, respectivamente. Ícones da ciência de Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O módulo de projeto independente da Gibson Assembly foi testado pela primeira vez no trimestre da primavera de 2019 no CHEM/BIO 475. Em 2020 e 2021, o curso foi ministrado online devido à pandemia de SARS-CoV-2. Quando as aulas presenciais foram retomadas na primavera de 2022 e 2023, os alunos do curso foram convidados a participar de um estudo avaliando os resultados de aprendizagem de um projeto independente da Gibson Assembly, onde plasmídeos originais e relevantes para a pesquisa seriam clonados. Em 2019, os alunos criaram uma biblioteca de plasmídeos consistindo em de genes do genoma de Micromonospora echinospora ATCC 15837 que foram clonados em pKC1132 (Figura 3). Esta biblioteca de plasmídeos está sendo utilizada em nosso laboratório de pesquisa para inativar genes de interesse em um suposto cluster de genes biossintéticos para o produto natural TLN-05220¹⁵. Para complementar nossos estudos de inativação gênica, os alunos em 2022 clonaram uma pequena biblioteca de genes do suposto cluster de genes TLN-05220 em pUC19 (Figura3); nosso grupo de pesquisa utilizou esses plasmídeos para subclonar genes em vetores de expressão, incluindo pET28b, para superexpressão e purificação de proteínas. Os alunos da coorte de 2023 contribuíram para o trabalho em andamento em um projeto de engenharia biossintética sobre a epoxomicina sintetase¹⁶. Em equipes de 3 a 4, os alunos clonaram domínios de engenharia de módulos de peptídeo sintatética¹⁷ não ribossômico em vários vetores de expressão de proteínas para otimizar a superexpressão e purificação dessas enzimas em nosso laboratório de pesquisa (Figura 3). A redundância foi incorporada ao plano de clonagem para cada coorte. Por exemplo, a coorte de 2019 continha 44 alunos e 15 plasmídeos foram designados para a turma para clonagem. Assim, a clonagem de cada plasmídeo foi tentada duas ou três vezes.

Figura 3: Resumo dos plasmídeos clonados e dos alunos participantes durante as iterações independentes do projeto de 2019, 2022 e 2023. O projeto Gibson Assembly foi implantado três vezes. Em cada oferta, os alunos participantes clonaram uma biblioteca diferente de plasmídeos para serem utilizados em projetos de pesquisa que exploram vias biossintéticas. Projetos em 2019 e 2022 apoiaram nosso trabalho contínuo no produto natural TLN-05220¹⁵ com duas reações de fragmento (um de genes ou gene e um vetor) Gibson Assembly. O projeto de 2023 envolveu a troca de domínio nos módulos 1 e 2 de uma enzima peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) que está envolvida na biossíntese de epoxomicina¹⁶. Os fragmentos hachurados representam dois mutantes diferentes do domínio trocado e as cores sólidas representam domínios que não foram trocados. No total, oito fragmentos de genes diferentes (quatro para o módulo 1 e quatro para o módulo 2) foram gerados com saliências compatíveis para Gibson Assembly. Para cada módulo, duas combinações diferentes de três fragmentos de genes foram montadas com um dos dois vetores diferentes (pBAD33 e pET28, quatro fragmentos totais por conjunto), para o potencial de gerar oito plasmídeos NRPS projetados. Ícones da ciência de Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Visão geral da avaliação

Pelo menos 1 semana antes do início do projeto independente Gibson Assembly, os alunos das coortes de 2022 e 2023 foram convidados a participar de uma investigação de resultados de aprendizagem, projetada de forma semelhante a um estudo realizado em uma pesquisa do curso de laboratório de bioquímica na Cal Poly¹⁸. Os alunos participantes preencheram um pré-questionário de múltipla escolha na reunião de laboratório antes do início do projeto independente e um pós-questionário de múltipla escolha durante a reunião final do laboratório (ou seja, depois de terem concluído o módulo Gibson Assembly). Os pré e pós-questionários consistiram em 28 questões idênticas com duas perguntas adicionais no pós-questionário (30 no total). Dez questões de conteúdo foram escritas para avaliar o conhecimento dos alunos sobre enzimas e mecanismos envolvidos na clonagem molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR], Gibson Assembly, transformação, triagem azul-branco). As sete perguntas a seguir pediram aos alunos que autoavaliassem sua familiaridade com os termos de clonagem molecular (por exemplo, DNA polimerase, exonuclease, ligase). As próximas 10 perguntas permitiram que os alunos autoavaliassem sua capacidade de realizar técnicas de clonagem molecular (por exemplo, análise de sequência de DNA, reações de digestão de restrição, eletroforese em gel de agarose). Os alunos também relataram se se sentiriam confortáveis em seguir uma carreira em biologia molecular com base em seu conhecimento de técnicas de clonagem molecular. Duas perguntas adicionais foram incluídas no pós-questionário para que os alunos autoavaliassem seu compromisso com o aprendizado no curso e se o curso foi uma experiência de aprendizado valiosa (Arquivo Suplementar 6 e Arquivo Suplementar 7). Todos os dados das respostas pré e pós-questionário dos alunos de 2022 e 2023 foram combinados para análise e estão disponíveis na Tabela Suplementar S1.

Protocolo

Os estudos envolvendo participantes humanos foram revisados e aprovados por sujeitos humanos no Conselho de Revisão Institucional de Pesquisa da Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). Os participantes forneceram seu consentimento informado por escrito para participar deste estudo.

O protocolo a seguir descreve a preparação do instrutor (etapas 1.1–1.3), as ações dos alunos para um módulo de ensino de três experimentos que inclui PCR para obter fragmentos lineares (etapas 2.1–2.7), montagem, transformação e seleção de clones de Gibson (etapas 3.1–3.5), isolamento e triagem de plasmídeo (etapas 4.1–4.4) e avaliação dos resultados de aprendizagem (5.1–5.2). A preparação do instrutor descreve um exemplo representativo de projeto de primer e preparação de um mapa de plasmídeo desejado in silico. Todas as seções do protocolo são adaptáveis para outros plasmídeos desejados. Cada experimento do aluno é dividido em duas reuniões de laboratório de 3 h.

1. Preparação do instrutor

1. Projeto de primer de montagem Gibson usando o Benchling Assembly Wizard
   1. Determine a fonte do molde de DNA para a(s) inserção(ões) do gene, como DNA genômico, plasmídeo e DNA sintético.
      NOTA: Para genes que serão amplificados a partir de modelos complexos de DNA genômico, é aconselhável primeiro determinar locais de ligação exclusivos para primers dentro do modelo de DNA genômico que são específicos para o(s) gene(s) de interesse, usando a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST) do National Center for Biotechnology Information (NCBI)²¹, conforme detalhado no Arquivo Suplementar 1. Para modelos simples, como plasmídeos ou DNA sintético, prossiga para a próxima etapa.
   2. Recupere sequências de DNA da(s) inserção(ões) do gene e do vetor (por exemplo, consulte a sequência do gene da policetídeo hidroxilase e a sequência pUC19 fornecidas como arquivos GenBank no Arquivo Suplementar 8). Importe a(s) sequência(s) de inserção desejada(s) e a sequência vetorial desejada para o Benchling, cada uma como um novo arquivo de sequência de DNA. Abra cada sequência importada a ser incluída na reação de montagem de Gibson.
      NOTA: Pode-se importar arquivos de sequência de DNA em vários formatos, incluindo GenBank e FASTA. Também é possível importar uma sequência diretamente de um banco de dados com um número de acesso ou colar uma sequência de nucleotídeos copiada de outro arquivo ou visualizador.
   3. Na parte inferior da tela, localize a ferramenta Assistente de montagem . Clique em Assistente de montagem e selecione Criar nova montagem. Nas opções fornecidas, selecione Gibson e clique em Iniciar para iniciar a montagem.
   4. Na janela de sequência vetorial , selecione todas as bases a serem incluídas na montagem a partir do backbone vetorial. Inicie a seleção na posição do nucleotídeo na extremidade 3' da inserção do gene (por exemplo, posição 657 de pUC19) e selecione todos os nucleotídeos restantes a serem incluídos (por exemplo, através da posição 656 para incluir toda a sequência de pUC19). Uma vez selecionado, clique na guia Backbone na parte inferior da tela| Definir fragmento.
      NOTA: Alterne entre as visualizações Mapa de sequência e Plasmídeo do vetor para selecionar todas as bases desejadas de um modelo circular. Alternativamente, se estiver planejando preparar o fragmento vetorial por meio de digestão de restrição (em vez de PCR) para Gibson Assembly, linearize a sequência de backbone com um local de corte de enzima de restrição (por exemplo, XbaI). Para fazer isso, clique no local de corte, mantenha pressionada a tecla Shift e clique no local de corte novamente. Em seguida, clique em Definir fragmento para definir o backbone. Lembre-se de que os primers específicos do vetor não serão gerados pelo Benchling se o backbone for linearizado com uma enzima de restrição no Assistente de montagem.
   5. Na janela de sequência de inserção , selecione todas as bases da pastilha a serem incluídas na montagem. Uma vez selecionado, clique na guia Inserir na parte inferior da tela | Fragmento de conjunto.
   6. No caso de várias inserções de genes, clique no botão + no lado direito do Assistente de montagem. Na janela Sequência de inserção , selecione todas as bases de pastilhas a serem incluídas na montagem. Uma vez selecionado, clique na guia Inserir na parte inferior da tela | Fragmento de conjunto.
   7. Depois que todos os fragmentos estiverem definidos, renomeie a montagem para o nome de plasmídeo desejado e clique em Montar à direita do Assistente de montagem. Selecione o local da pasta desejada para a Pasta de sequência e a Pasta do Primer. Clique em Criar para montar a sequência de plasmídeo recombinante.
   8. Abra o plasmídeo montado e clique em Histórico de montagem para visualizar um mapa básico de plasmídeo e uma visão geral das sequências das quais ele foi derivado. Certifique-se de que as posições dos nucleotídeos para cada fragmento correspondam ao design desejado.
   9. Na guia Parâmetros de montagem , visualize os nomes dos primers projetados para a montagem. Observe que haverá dois primers projetados para cada inserção (um direto e um reverso), e os nomes dos primers serão derivados dos títulos dos arquivos de sequência de DNA. Certifique-se também de que as temperaturas de fusão do primer e as temperaturas de recozimento sugeridas sejam compatíveis nesta janela (consulte o Arquivo Suplementar 8, Primers Representativos).
      1. Se as temperaturas de fusão do primer ou as temperaturas de recozimento não forem ideais, ajuste manualmente as sequências do primer (por exemplo, removendo nucleotídeos para reduzir a temperatura de fusão) nos arquivos de sequência do primer. Como alternativa, clique em Reabrir e ajuste as configurações do primer clicando no botão Configurações de enzima/primer ao lado do botão Montar no Assistente de montagem. Em seguida, repita a etapa de montagem e reexamine as sequências de primer.
      2. Se uma biblioteca de plasmídeos for clonada com muitos genes diferentes clonados na mesma estrutura vetorial,
      3. Utilize o mesmo par de primers para o vetor em cada caso. Para fazer isso, remova manualmente todos os nucleotídeos dos primers vetoriais que instalariam as saliências específicas da inserção. Esses nucleotídeos seriam encontrados na extremidade 5 ' do primer. Após a remoção, certifique-se de que as temperaturas de fusão do primer e as temperaturas de recozimento sejam compatíveis (consulte o Arquivo Suplementar 8, Primers Representativos).
      4. Certifique-se de que todos os pares de primers de pastilhas tenham temperaturas de fusão e temperaturas de recozimento muito semelhantes.
         NOTA: Isso reduzirá a necessidade de otimização da temperatura de recozimento de cada par e permitirá que todas as reações de PCR dos alunos sejam cicladas ao mesmo tempo usando o mesmo programa de termociclador.
   10. Quando o projeto do primer estiver concluído para os plasmídeos desejados, clique em Finalizar no Assistente de montagem. Encomende os primers de uma empresa de síntese de DNA e recupere amostras dos modelos de DNA para inserção(ões) e vetor.
   11. Teste os pares de primers específicos para inserção e vetor para temperaturas ideais de recozimento usando um experimento de PCR gradiente com os modelos de DNA. Teste as temperaturas de recozimento recomendadas pela bancada ± 3 °C inicialmente.
   12. Uma vez que as temperaturas de recozimento tenham sido determinadas, crie alíquotas de soluções de primer, modelos de DNA e reagentes necessários para reações de PCR para os alunos.
2. Antes dos experimentos, forneça planilhas aos alunos para apoiar a preparação e avaliar a compreensão (Arquivo Suplementar 4, Suplementar 5 e Suplementar 6).
3. Recolha de dados sobre os resultados de aprendizagem
   NOTA: Se estiver interessado em coletar dados de resultados de aprendizagem do módulo Gibson Assembly e publicar os resultados, obtenha aprovação para pesquisas com seres humanos de acordo com as políticas da instituição.
   1. Peça aos alunos que participem de uma investigação de resultados de aprendizagem pelo menos 1 semana antes do início do projeto independente da Gibson Assembly.
   2. Peça aos alunos participantes que preencham o pré-questionário de múltipla escolha (Arquivo Suplementar 6) na reunião de laboratório antes do início do projeto independente.

2. Experiência A: PCR para obtenção de fragmentos lineares

1. Obtenha primers e soluções de DNA modelo para PCR com o instrutor.
2. Pipete reações de 25 μL, incluindo DNA polimerase MasterMix, molde de DNA, primers diretos e reversos e água livre de nuclease de acordo com as instruções do manual do aluno (consulte o Arquivo Suplementar 2).
3. Alterne a reação em um termociclador de acordo com o manual do aluno no Arquivo Suplementar 2. Certifique-se de que a temperatura de recozimento da reação seja apropriada para os primers e que o tempo de extensão seja apropriado para o comprimento do amplicon desejado. Consulte o Arquivo Suplementar 2 e o Arquivo Suplementar 3 para obter instruções detalhadas.
4. Armazene as reações de PCR a 4 ° C ou -20 ° C até o período de laboratório seguinte.
5. Analise 5 μL de cada reação por eletroforese em gel de agarose. Enquanto o gel estiver funcionando, adicione 1 μL de enzima de restrição DpnI a cada reação que utilizou DNA de plasmídeo como molde. Incubar esta mistura durante 1 h a 37 °C.
   NOTA: O DpnI degradará qualquer molde de DNA de plasmídeo circular restante, tornando menos provável a obtenção de falsos positivos na etapa de transformação.
6. Visualize o gel para confirmar que a reação em cadeia da polimerase foi bem-sucedida e a amplificação correta foi alcançada. Purifique todas as reações de PCR bem-sucedidas com um kit de purificação de PCR disponível comercialmente. Meça a concentração (ng/μL) do produto de PCR purificado usando um espectrofotômetro de microvolume para uso em cálculos de montagem Gibson subsequentes.
7. Antes da próxima reunião de classe, projete a receita de reação para o Gibson Assembly (consulte o Arquivo Suplementar 2 e o Arquivo Suplementar 4).

3. Experiência B do aluno: Montagem de Gibson, transformação e seleção de clones

1. Pipete a reação do conjunto Gibson de acordo com a receita projetada. Incubar a reação a 50 °C durante 15 min. Enquanto as reações incubam, prepare-se para a transformação descongelando células de Escherichia coli quimicamente competentes no gelo.
2. Transforme 2 μL do conjunto Gibson em células quimicamente competentes por meio de choque térmico. Pipetar 100 μL das células transformadas em duas placas de seleção e espalhar com esferas esterilizadas. Prepare diluições ^10-4, ^10-5 e ^10-6 das células restantes em ágar Luria-Bertani (LB). Colocar 100 μL de cada diluição seriada em LB (sem seleção) e espalhar com esferas esterilizadas.
   NOTA: Esta etapa permite o cálculo da eficiência da transformação.
3. Incubar as placas durante a noite a 37 °C. Conservar as placas a 4 °C até ao próximo período de aula.
4. Conte as colônias em todas as placas e calcule a eficiência da transformação conforme instruído no Arquivo Suplementar 2. Voltar a riscar uma placa selectiva com quatro colónias de uma das placas selectivas e incubar esta placa a 37 °C durante a noite.
   NOTA: Isso serve como uma cultura de backup de seus clones positivos.
5. Usando um marcador, selecione, circule e rotule quatro colônias distintas na placa de seleção com as iniciais do aluno e um número (por exemplo, ABC1). Recupere uma nova placa de ágar LB contendo antibiótico para seleção, use um marcador para dividir a placa em quadrantes (ou seja, quartos) e, em seguida, use ~ 1/2 de cada colônia para re-streak no quadrante respectivamente marcado e o outro 1/2 para inocular uma cultura líquida de LB de 5 mL para cada uma das quatro colônias selecionadas. Certifique-se de rotular os tubos com a respectiva identidade da colônia (por exemplo, ABC1) e adicione a concentração correta de antibiótico para seleção. Incubar as culturas líquidas numa incubadora agitada a 37 °C durante a noite e a placa de ágar numa incubadora estática a 37 °C; armazenar as culturas líquidas e as placas a 4 °C até ao período de aula seguinte.

4. Experiência do aluno C: Isolamento e triagem de plasmídeos

1. Isole o DNA do plasmídeo das culturas líquidas do Experimento B usando um kit de minipreparação. Medir a concentração do plasmídeo isolado (em ng/μl).
2. Projete um resumo de restrição ou triagem de PCR para analisar os plasmídeos isolados (consulte as instruções detalhadas no Arquivo Suplementar 2 e relate as expectativas no Arquivo Suplementar 5).
3. Pipetar as reações de digestão de restrição ou reações de acordo com as receitas projetadas e incubar em temperaturas e durações projetadas anteriormente.
4. Analise os resultados por eletroforese em gel de agarose.

5. Apreciação

1. Peça aos alunos participantes que preencham o pós-questionário de múltipla escolha (Arquivo Suplementar 7) na reunião de laboratório após a conclusão do módulo Gibson Assembly.
2. Combine todos os dados das respostas pré e pós-questionário para análise.
   1. Examine a significância estatística do aumento na pontuação média de cada questão de conteúdo individual entre os questionários usando testes t pareados bicaudais e o tamanho do efeito d de Cohen.
   2. Avalie o aumento da confiança do aluno para cada termo e técnica individual para determinar a extensão da mudança e sua significância estatística.
   3. Determine o impacto do histórico do aluno e dos fatores acadêmicos na aprendizagem do aluno usando ganho de aprendizagem normalizado (NLG) e testes t não pareados.
   4. Avalie as atitudes dos alunos em relação à experiência do projeto e às carreiras de biologia molecular, avaliando as pontuações médias.

Resultados

Sucesso do aluno na clonagem
Em cada iteração do módulo Gibson Assembly (2019, 2022 e 2023), os alunos foram solicitados a preparar um relatório resumindo suas descobertas. Em 2019, 36 dos 44 alunos (81,8%) relataram que clonaram com sucesso seus plasmídeos com base nos resultados da tela que projetaram para o Experimento C. Um total de 14 em cada 20 alunos (70,0%) relataram sucesso na clonagem de seus construtos atribuídos em 2022, enquanto o projeto baseado em equipe em 2023 teve 12 de 27 alunos (44,4% ou 4 de 8 grupos) relatando sucesso com base em suas análises de triagem. As conclusões dos relatórios dos alunos foram revisadas pelo instrutor ou pelos alunos pesquisadores; As interpretações dos alunos foram corrigidas se fosse constatado que os resultados da triagem não apoiavam suas reivindicações. Uma amostra de cada plasmídeo distinto foi analisada por sequenciamento de Sanger, confirmando as sequências das inserções de plasmídeo para todos os 15 plasmídeos desejados em 2019 e todos os 12 plasmídeos em 2022. Em 2023, o sequenciamento de nanoporos Oxford de plasmídeo completo foi usado para analisar todos os 8 plasmídeos; no entanto, apenas 1 dos 8 plasmídeos correspondeu à sequência desejada.

Avaliação baseada em conteúdo de conceitos de biologia molecular
A seção de conteúdo do questionário compreendia 10 questões de múltipla escolha que testaram a compreensão dos alunos sobre os conceitos de biologia molecular e clonagem molecular. A comparação das pontuações médias de conteúdo pré e pós-questionário para todas as 10 questões de conteúdo revelou um aumento significativo de 63,7% para 80,4% (p < 0,05, teste t pareado bilateral; Figura 4), sugerindo que o projeto independente da Gibson Assembly melhorou a compreensão dos alunos sobre biologia molecular e conceitos de clonagem. Um teste d de Cohen determinou que esse aumento significativo corresponde a um grande tamanho de efeito (d = 0,891), apoiando uma forte diferença entre as pré e pós-respostas dos alunos para perguntas de conteúdo.

Figura 4: Melhoria da compreensão dos alunos sobre biologia molecular e clonagem molecular após o projeto independente. Gráfico de caixa e bigode das respostas dos alunos a perguntas que testam o conteúdo em biologia molecular e clonagem molecular antes e depois da conclusão do projeto independente (tamanho da amostra, n, de 46; Pré e Pós-Questionários da Montagem Gibson no Arquivo Suplementar 6 e no Arquivo Suplementar 7, respectivamente). As médias pré e pós-escores foram analisadas por meio de um teste t pareado bicaudal, que indica um aumento significativo nas respostas corretas dos alunos (p < 0,5). As caixas representam os 50% médios das pontuações (ou seja, percentis 25^a 75⁾ e os bigodes representam as pontuações mínima e máxima (%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, examinamos se o aumento na pontuação média de cada questão de conteúdo individual foi estatisticamente significativo entre os pré e pós-questionários. Análises usando testes t pareados bicaudais mostraram que as respostas dos alunos a perguntas sobre reações de PCR, digestão de restrição de DpnI, enzimas de montagem de Gibson e sequências vetoriais e de inserção de montagem de Gibson tiveram aumentos significativos (p < 0,05) após a conclusão do projeto independente. Essas perguntas baseadas em conteúdo tiveram pontuações pré-questionário relativamente baixas em comparação com a média geral de conteúdo de 63,7%, com as pontuações mais baixas em perguntas sobre resumos DpnI e enzimas Gibson Assembly (34,8% e 47,8%, respectivamente). A média pós-projeto para as questões acima mencionadas aumentou para 71,7% e 89,1%, respectivamente, o que está mais próximo da média geral de conteúdo de 80,4%. Esses dados mostram que, ao final do projeto, a compreensão dos alunos sobre os resumos de DpnI e as enzimas de montagem de Gibson melhorou com um tamanho de efeito maior do que a seção de conteúdo geral do questionário (d = 0,982).

Avaliação atitudinal de termos de biologia molecular e técnicas laboratoriais
As questões atitudinais foram divididas em duas seções no questionário do aluno. A primeira seção fez com que os alunos autoavaliassem seu conhecimento de sete termos de biologia molecular em uma escala de 1 a 4 (1 = "Não tenho ideia do que esse termo significa" a 4 = "Eu sei o que esse termo significa e poderia facilmente explicá-lo a outra pessoa"). A confiança média a prazo aumentou significativamente de 3,52 para 3,87 com um grande tamanho de efeito (p = 5,32 × ^10-15 e d = 1,40, respectivamente; Figura 5A). A segunda seção de atitude perguntou aos alunos se eles concordavam com a afirmação de "Estou confortável em me apresentar ..." onze técnicas de laboratório de biologia molecular em uma escala de 1 a 5 (1 = "Discordo totalmente" a 5 = "Concordo totalmente"). A confiança média dos alunos dessas onze técnicas aumentou significativamente de 3,82 para 4,33 com um grande tamanho de efeito (p = 2,08 × ^10-11 e d = 1,09; Figura 5B).

Figura 5: Aumento da confiança dos alunos em sua compreensão da biologia molecular e dos termos e técnicas de clonagem após o projeto independente. Gráficos de caixa e bigode da confiança do aluno em termos de biologia molecular (A) e (B) técnicas nos pré e pós-questionários (Gibson Assembly Pré e Pós-Questionários no Arquivo Suplementar 6 e no Arquivo Suplementar 7, respectivamente). Para a confiança do termo (painel A), os alunos selecionaram confiança em uma escala de 4 partes (1 - "Não tenho ideia do que esse termo significa" a 4 - "Eu sei o que esse termo significa e poderia facilmente explicá-lo a outra pessoa"; tamanho da amostra n de 45). A confiança da técnica laboratorial (painel B) foi avaliada em uma escala de 5 partes (1-Discordo totalmente a 5-Concordo totalmente; tamanho da amostra n de 42). As pontuações médias pré e pós foram analisadas por meio de testes t pareados bicaudais, o que indica um aumento significativo na confiança do aluno para os conjuntos de dados do termo e da técnica (p < 0,5). A caixa mostra os 50% médios (ou seja, percentis 25^a 75⁾ das respostas com bigodes mostrando classificações de confiança subjetivas mínimas e máximas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliamos o aumento da confiança do aluno para cada termo e técnica individual e determinamos que todos os termos, exceto DNA polimerase e transformação, mostraram um aumento estatisticamente significativo (p < 0,05, teste t pareado bilateral; Tabela 1). Todos os alunos, exceto um, marcaram "Eu sei o que esse termo significa e poderia facilmente explicá-lo a outra pessoa" para o termo DNA Polimerase nos pré e pós-questionários, então não havia espaço para melhorias nesse termo (Tabela 1). Para o período de Transformação, 73,91% dos alunos selecionaram o maior nível de confiança (número 4 na escala) na pré-pesquisa em comparação com 80,4% na pós-pesquisa. Nove das onze técnicas de laboratório avaliadas mostraram um aumento significativo na confiança dos alunos; isso excluiu cálculos de molaridade e eletroforese em gel (Tabela 1). Em média, os alunos relataram altas pontuações pré-questionário para ambas as técnicas (4,71 e 4,57, respectivamente, versus uma média técnica de 3,81), indicando que os alunos já estavam confiantes com esses termos antes do projeto Gibson Assembly. As questões que avaliaram a confiança dos alunos em questões gerais de biologia (por exemplo, DNA polimerase, eletroforese em gel, cálculos de molaridade) geralmente não mostraram mudanças estatisticamente significativas (Tabela 1). No entanto, todas as questões especializadas de Gibson Assembly mostraram aumentos significativos com os maiores tamanhos de efeito (d > 1,6) com a técnica 'Gibson Assembly' mostrando a maior mudança na confiança do aluno (Tabela 1 e Figura 6).

Tipo de conteúdo	Termo/Técnica	Resposta média do questionário		Significância estatística		Tamanho do efeito (d)
		Pré	Postar	valor de p	Sim/Não
Bioquímica Geral	Termo DNA Polimerase	3.98	3.98	indefinido	Não	0
	Técnica de cálculos de molaridade	4.71	4.77	4.45E-01	Não	0.130
	Técnica de eletroforese em gel	4.57	4.68	1.68E-01	Não	0.254
Clonagem Molecular	Técnica de design de primers	3.05	3.57	7.23E-04	Sim	0.536
	Técnica de clonagem in silico	3.61	4.07	5.75E-04	Sim	0.533
	Termo de triagem azul-branco	3.59	4.34	4.10E-06	Sim	0.655
	Termo de triagem de PCR	3.78	4.31	1.02E-06	Sim	0.936
	Termo de Montagem Gibson	2.87	3.78	7.41E-13	Sim	1.69
	Técnica de montagem Gibson	2.59	4.20	1.14E-15	Sim	1.61

Tabela 1: Aumentos significativos em relação às questões atitudinais focadas na clonagem molecular, mas não na bioquímica geral. A média do pré e pós-questionário (Gibson Assembly Pré e Pós-Questionários no Arquivo Suplementar 6 e no Arquivo Suplementar 7, respectivamente) para questões de termo e técnica selecionadas. Testes t pareados bicaudais foram usados para avaliar a significância (se p < 0,05, sim; se p ≥ 0,05, não). Para o termo DNA polimerase, as respostas dos alunos foram idênticas entre o pré e o pós-questionário, portanto, p é indefinido. O tamanho do efeito de comparação das respostas dos alunos para cada pré e pós-pergunta foi determinado usando os valores d de Cohen (d ≥ 0,8 é considerado um efeito grande). Quanto maior o tamanho do efeito, maior a probabilidade de que as pré e pós-respostas sejam distintas dentro do conjunto amostral. O tamanho da amostra n é 45 e 42 para questões de termo e técnicas, respectivamente. Abreviatura: AVG = média.

Figura 6: Aumentos para questões de atitude sobre a Gibson Assembly. O número de respostas dos alunos relatou confiança no termo (A) e (B) da Gibson Assembly nos pré e pós-questionários. As respostas de confiança do termo estavam em uma escala de 4 partes (1 - "Não tenho ideia do que esse termo significa" a 4 - "Eu sei o que esse termo significa e poderia facilmente explicá-lo a outra pessoa"). As respostas de confiança da técnica de laboratório variaram de 1-Discordo totalmente a 5-Concordo totalmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, avaliamos se os fatores de histórico do aluno afetam o quanto um aluno aprendeu com o projeto independente. As lacunas de percepção de desempenho¹⁹ e desempenho²⁰ demonstraram persistir em cursos de graduação STEM devido ao gênero; assim, usamos ganho de aprendizagem normalizado (NLG) e testes t não pareados para determinar se uma lacuna de gênero semelhante foi observada nesses projetos independentes. Com base nesses testes estatísticos, não descobrimos que o gênero do aluno teve impacto nos resultados de aprendizagem dos alunos. Também verificamos se fatores acadêmicos, como especialização, GPA, notas em trabalhos anteriores do curso e a nota final em BIO / CHEM 475, tinham uma ligação significativa com os resultados de aprendizagem dos alunos do projeto independente. Enquanto os alunos que se formaram em bioquímica (Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2) tiveram GPAs e notas finais do curso mais altos e cada um individualmente mostrou NLG médio mais alto, os testes t não pareados não mostraram significância estatística entre esses fatores de fundo individuais e os resultados de aprendizagem. Testes t não pareados também foram usados para avaliar as diferenças no NLG entre as coortes de 2022 e 2023. Descobriu-se que a coorte de 2023 teve um ganho de aprendizado significativamente maior do que a coorte de 2022 para as questões de conteúdo (Tabela Suplementar S3). Isso indica que, apesar da menor taxa de sucesso de clonagem da coorte de 2023, eles obtiveram uma maior compreensão da biologia molecular e dos conceitos de clonagem molecular do que a coorte de 2022. Embora as razões para essa diferença não sejam claras, esses dados mostram que o sucesso da clonagem não é necessário para uma educação eficaz com este módulo.

Além de avaliar o domínio das técnicas de laboratório dos alunos, avaliamos suas atitudes em relação à experiência do projeto e às carreiras em biologia molecular. Uma pergunta, apresentada nas avaliações pré e pós-projeto, avaliou seu nível de conforto em seguir carreiras envolvendo técnicas de biologia molecular. Os resultados revelam que o projeto melhorou significativamente o conforto dos alunos nas carreiras de biologia molecular (p = 8,46 × ^10-5), com a pontuação média aumentando de 3,60 para 4,09 em nossa escala de 1 a 5. Além disso, o questionário pós-projeto incluiu perguntas sobre a dedicação dos alunos em maximizar sua experiência de aprendizagem e sua avaliação do valor do projeto. Os entrevistados classificaram seu compromisso em uma média de 4,48 e consideraram o projeto uma oportunidade de aprendizado altamente valiosa, com uma pontuação média de avaliação de 4,73. Em conjunto, essas descobertas ressaltam o valor do projeto independente no crescimento acadêmico dos alunos, bem como o entusiasmo e a confiança nos empreendimentos de biologia molecular.

Tabela Suplementar S1: Dados brutos anonimizados. Todas as respostas e especializações dos alunos dos pré e pós-questionários que foram coletados durante as iterações de 2022 e 2023 do módulo Gibson Assembly CURE. Consulte o Arquivo Suplementar 6 e o Arquivo Suplementar 7 para ver as perguntas pré e pós correspondentes, respectivamente. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar S2: Diferenças no ganho de aprendizagem normalizado por principal para cada seção do questionário. Os testes t não pareados determinaram que nenhum tipo de pergunta mostrou diferenças significativas no ganho de aprendizagem normalizado (NLG) por maior (p < 0,05). Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar S3: Diferença no ganho de aprendizagem normalizado por coorte para cada seção do questionário. Os testes t não pareados mostraram que a coorte de 2023 tem um ganho de aprendizagem normalizado (NLG) significativamente maior para questões de conteúdo em comparação com a coorte de 2022 (p < 0,05). Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Manual do Instrutor para o Módulo CURE de Montagem Gibson. Um guia para instrutores implementarem o Módulo CURE da Gibson Assembly. Instruções passo a passo são fornecidas para os instrutores se prepararem para o curso, projetando e selecionando os Gibson Assembly Primers com base em seu modelo de interesse. Os tópicos e atividades que os instrutores devem cobrir durante cada palestra e período de laboratório para os Experimentos A–C são descritos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Manual do Aluno para o Módulo CURE de Montagem Gibson. Um manual para fornecer aos alunos, incluindo informações básicas relevantes sobre a Montagem Gibson e protocolos passo a passo para cada Experimento (A-C). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Planilhas de Planejamento do Experimento A (Individual e Equipe). Planilhas individuais e em equipe para os alunos entenderem e se prepararem para a amplificação por PCR para fragmento(s) de montagem de Gibson. Apenas uma dessas planilhas deve ser atribuída pelo instrutor com base na estrutura do projeto independente (individual ou em equipe). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Planilha de Planejamento do Experimento B. Planilha do aluno para auxiliar nos cálculos necessários para a configuração da reação da Montagem Gibson. O número de fragmentos na planilha pode ser ajustado com base no projeto de clonagem para os plasmídeos de interesse. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Planilha de Planejamento do Experimento C. Planilha do aluno para auxiliar no projeto de um resumo de restrição ou experimento de PCR para rastrear o plasmídeo de interesse. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 6: Pré-Questionário de Montagem Gibson. Questionário de vinte e oito perguntas dado aos alunos antes do início do Módulo Gibson Assembly CURE. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 7: Pós-Questionário de Montagem Gibson. Questionário de trinta perguntas dado aos alunos após a conclusão do Módulo Gibson Assembly CURE. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 8: Pasta Zip contendo arquivos de sequência GenBank (.gb) de um gene de policetídeo hidroxilase, vetor pUC19 e plasmídeo montado em Gibson e Tabela de primers representativos. Consulte esses arquivos para obter um projeto de primer exemplar no Assistente de montagem de bancada e concluir as planilhas de planejamento experimental. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, propomos um projeto de laboratório de sala de aula de graduação ajustável que ensina aos alunos a clonagem molecular por meio da Gibson Assembly em um ambiente de pesquisa baseado em curso. No total, 28 novos plasmídeos foram clonados por alunos de graduação em sala de aula. O sucesso individual relatado pelos alunos variou de 44,4% a 81,8% em três coortes, e o sucesso geral da clonagem foi de 80% (28 do total de 35 plasmídeos atribuídos foram clonados com sucesso). O menor sucesso da clonagem em 2023 provavelmente se deveu a dois fatores compostos. Primeiro, tubos de amostras de DNA modelo foram rotulados com nomes intimamente relacionados; é possível que tenha havido confusões dos modelos de DNA preparados por alunos pesquisadores, levando à combinação de fragmentos lineares não compatíveis durante a reação de montagem de Gibson realizada por alunos no laboratório de ensino. Em iterações futuras deste projeto, o DNA modelo deve ser primeiro sequenciado ou rastreado com um resumo de restrição para confirmar a identidade correta antes de ser fornecido aos alunos. Em segundo lugar, a iteração de 2023 deste projeto consistiu em montagens de quatro fragmentos (um vetor e três inserções), em oposição às montagens de dois fragmentos nos anos anteriores (um vetor e uma inserção). Isso também pode ter diminuído o sucesso da clonagem para este projeto, pois mais fragmentos na Gibson Assembly podem diminuir a eficiência da reação²². Em iterações futuras deste projeto, mais redundância pode ser incorporada fazendo com que mais grupos clonem o mesmo plasmídeo ou com grupos configurando várias reações de montagem Gibson em várias proporções de inserção para vetor para aumentar a probabilidade de ligação e transformação de plasmídeo bem-sucedidas. Além disso, incluir sobreposições mais longas entre fragmentos e aumentar o tempo de incubação da reação de montagem de Gibson pode aumentar o sucesso em montagens com 4–6 fragmentos²³.

Além de clonar novos plasmídeos, os resultados da pesquisa pré e pós-projeto indicam que os alunos melhoraram sua compreensão dos conceitos de biologia molecular e clonagem molecular, com o maior tamanho de efeito para questões relacionadas à clonagem da Gibson Assembly. Além disso, a confiança dos alunos auto-relatados em termos de biologia molecular e técnicas de laboratório melhorou significativamente após a conclusão do projeto para a maioria dos avaliados. A montagem de Gibson é uma técnica de clonagem molecular importante e versátil usada em pesquisas acadêmicas e na indústria de biotecnologia². Ao ensinar esses conceitos e habilidades práticas em um curso de laboratório, todos os alunos de graduação têm oportunidades iguais de se formar com competência em pesquisa e habilidades contratáveis ao entrarem no mercado de trabalho ou na educação continuada.

O currículo da Gibson Assembly descrito inclui os cinco componentes de um CURE⁴ bem-sucedido. Os alunos usaram práticas científicas projetando seus próprios protocolos, incluindo metas e expectativas com base nos tamanhos dos amplicons de PCR e cortes de resumo de restrição (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5). O projeto independente promove a colaboração dos alunos, dividindo a preparação de cada fragmento necessário entre os membros de um grupo e, finalmente, utilizando os fragmentos de cada membro do grupo em uma reação de ligação (Planilha de Planejamento do Experimento A (Baseada em Equipe) no Arquivo Suplementar 3). Os plasmídeos que esses projetos independentes pretendiam clonar são novos plasmídeos de expressão com relevância para projetos de pesquisa fora da sala de aula, potencialmente fornecendo dados para pesquisas publicáveis. Semelhante a uma experiência de pesquisa mais tradicional, as taxas de sucesso da clonagem no curso CURE não foram de 100%. Os alunos foram solicitados a avaliar variáveis que podem ter produzido resultados negativos e propor hipóteses explicando por que o plasmídeo não foi clonado com sucesso, o que serve como uma autêntica experiência de aprendizado para os alunos em relação aos resultados da pesquisa.

Nesta iteração do Gibson Assembly CURE, os alunos clonaram plasmídeos pertinentes à pesquisa de produtos naturais de Actinomycetota; no entanto, o fluxo de trabalho foi projetado para ser altamente adaptável a outros projetos também. Os protocolos apresentados aqui são generalizados, permitindo que os alunos clonem plasmídeos que podem ser usados para uma infinidade de propósitos de pesquisa em seis reuniões de laboratório e duas palestras. A estrutura permite que os alunos clonem novos plasmídeos individualmente ou que os alunos trabalhem juntos para clonar um único plasmídeo a partir de >2 fragmentos lineares em uma abordagem baseada em equipe. No geral, essa abordagem pode ser adaptada para atender a uma ampla gama de projetos de pesquisa que podem exigir a utilização variável do Gibson Assembly.

Este estudo avaliou os ganhos de aprendizagem dos alunos por meio de uma abordagem baseada em CURE para o ensino de Gibson Assembly, mas informações adicionais podem ser obtidas por meio da expansão do estudo. Embora o formato pré e pós-questionário tenha permitido a avaliação dos resultados de aprendizagem devido ao projeto independente, não foi realizada nenhuma comparação com o ensino baseado em palestras da Gibson Assembly. Uma comparação do CURE baseado em experimentos com uma atividade de laboratório baseada em palestras ou mais tradicional, onde os resultados experimentais já são projetados para os alunos, forneceria mais informações se os resultados de aprendizagem aprimorados da Gibson Assembly fossem específicos para o modelo de curso CURE. Por fim, enquanto algumas questões de conteúdo relacionadas à Gibson Assembly mostraram melhorias significativas na compreensão, outras não. Questões relacionadas às sobreposições homólogas usadas na Gibson Assembly, como elas são instaladas e como elas se recombinam em uma reação de clonagem da Gibson Assembly não melhoraram. Isso sugere que uma explicação adicional ou uma avaliação adicional do aprendizado sobre esses tópicos pode melhorar a compreensão do aluno em futuras implementações desse currículo.

A estrutura de projeto independente da Gibson Assembly continua a ser implementada na Cal Poly. Em futuras iterações do curso, este projeto será modificado para permitir maior independência do aluno, geração de hipóteses e design experimental. Uma próxima mudança curricular na Cal Poly apresenta a oportunidade de alongar o projeto independente para incluir o design de primers liderado por alunos, seleção de backbone vetorial, análise de sequência e / ou testes downstream de plasmídeos, como para expressão de proteínas. Além disso, o projeto independente pode ser personalizado para ensinar outras técnicas relevantes de biologia molecular, como mutagênese dirigida ao local ou edição de genes, dependendo das necessidades dos projetos de pesquisa em andamento. Alterar as técnicas que os alunos utilizam no projeto independente pode fornecer mais discernimento sobre quais tópicos são apropriados para o formato CURE e quais são difíceis de implementar.

Em conjunto, este relatório detalha um módulo de ensino adaptável da Gibson Assembly que implementa um CURE para melhorar a compreensão do aluno sobre uma metodologia de clonagem emergente e aumentar a competência no processo científico. O projeto independente melhorou os resultados de aprendizagem dos alunos e a confiança na maioria dos termos e técnicas de biologia molecular avaliados. Incentivamos o uso e a adaptação deste módulo não apenas para criar novos plasmídeos de pesquisa, mas também para melhorar a acessibilidade e a confiança dos alunos nas técnicas de pesquisa, preparando melhor os alunos de graduação para futuras carreiras em STEM. Idealmente, este trabalho inspirará melhorias nos currículos de biologia molecular e incentivará a adaptabilidade do curso STEM à medida que as metodologias de pesquisa científica continuam a evoluir.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Trifosfato de desoxirribonucleotídeo (dNTPs, 10  mM)	Fisher Scientific	FERR0191	Componente MasterMix caseiro'
Ditiotreitol (DTT)	Componente MasterMix da Fisher Scientific	FERR0861	Homemade'
DpnI	New England Biolabs	R0176S	1000 unidades
Incubadora Microbiológica Fisherbrand Isotemp	Fisher Scientific	15-103-0513
FisherBrand Isotemp Banho de Água Fisher	Scientific	S28124
GelRed Ácido Nucleico Gel Stain	Biotium	NC9594719	10,000X
GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit	Thermo Scientific	FERK0831	100 Preps
GeneRuler 1 kb Escada de DNA	Fisher Scientific	FERSM0314	100 aplicações
LB Caldo, Miller	Fisher BioReagents	BP9723-500	500 g
Cloreto de magnésio hexahidratado	Fisher Scientific	BP214-500	Componente MasterMix caseiro'
Mastercycler nexus X2 Gradient Thermocycler	Eppendorf	6337000027
Centrífuga Microfuge 16	Beckman Coulter	A46474
Bactéria Micromonospora echinospora Coleção	de Cultura Tipo Americano	ATCC 15837
Forno Microondas	General Electric
Biologia Molecular Grau Agarose Fisher	BioReagents	BP160-100	100 g
Nanodrop One Microvolume Espectrofotômetro	Thermo Scientific	13-400-518
NEB 5-alfa Competente E. coli	New England Biolabs	C2987H	20 x 0,05 mL
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621S	10 reações
New Brunswick Innova 40 Agitador Orbital de Bancada	New Brunswick	M1299-0090
Água Livre de Nuclease	Fisher BioReagents	BP248450	50 mL
PEG-8000	Fisher Scientific	BP233-100	Componente MasterMix caseiro
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530	Componente MasterMix caseiro
Balança portátil	Ohaus	SKX123
pUC19 vetor	New England Biolabs	N3041S
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs	M0492S	100 reações
T5 Exonuclease	Epicentro	T5E4111K	Componente MasterMix caseiro Taq
DNA Ligase	New England Biolabs	M0208	Componente MasterMix caseiro
Tris-HCl	Fisher Scientific	AAA1137918	Componente MasterMade Caseiro
TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)	Thermo Kit
Miniprep de Plasmídeo Zyppy Scientific	Zymo Research	D4019	100 Preps
β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+)	New England Biolabs	B9007S	Componente MasterMix' caseiro