Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Resumo

Relatamos um ensaio de conjunto híbrido e molécula única para obter imagens diretas e quantificar o movimento de helicase Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) totalmente reconstituída e marcada com fluorescência em moléculas de DNA lineares mantidas no lugar em uma armadilha óptica.

Resumo

Os eucariotos têm uma helicase replicativa conhecida como CMG, que organiza e aciona centralmente o replissoma e lidera o caminho na frente dos garfos de replicação. Obter uma compreensão mecanicista profunda da dinâmica do CMG é fundamental para elucidar como as células realizam a enorme tarefa de replicar com eficiência e precisão todo o seu genoma uma vez por ciclo celular. As técnicas de molécula única são exclusivamente adequadas para quantificar a dinâmica do CMG devido à sua resolução temporal e espacial incomparável. No entanto, estudos de molécula única do movimento do CMG até agora se basearam no CMG pré-formado purificado das células como um complexo, o que impede o estudo das etapas que levam à sua ativação. Aqui, descrevemos um conjunto híbrido e um ensaio de molécula única que permitiu a aquisição de imagens no nível de molécula única do movimento do CMG marcado com fluorescência após reconstituir totalmente sua montagem e ativação a partir de 36 diferentes polipeptídeos purificados de S. cerevisiae . Este ensaio baseia-se na dupla funcionalização das extremidades de um substrato de DNA linear com duas porções de fixação ortogonais e pode ser adaptado para estudar mecanismos de processamento de DNA igualmente complexos no nível de molécula única.

Introdução

A replicação do DNA em eucariotos é realizada por um complexo proteico dinâmico conhecido como replissoma¹. Um componente-chave deste complexo é a helicase replicativa eucariótica Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG), que aciona e organiza centralmente o replisoma, liderando o caminho na frente dos garfos de replicação ^1,2. Obter uma compreensão quantitativa profunda da dinâmica do CMG é, portanto, fundamental para entender a dinâmica do replisoma. Tal compreensão pode ser adquirida com técnicas de molécula única, que são exclusivamente adequadas para estudar motores moleculares, como o CMG, devido à sua resolução espacial e temporal incomparável, e podem nos fornecer uma compreensão quantitativa incomparável de sua função, estocasticidade e dinâmica 2,3,4,5,6,7,8,9.

In vivo, o CMG é carregado e ativado de forma separada temporalmente para garantir que a replicação ocorra apenas uma vez por ciclo celular ^1,10,11. Primeiro, na fase G1 do ciclo celular, um conjunto de proteínas conhecidas como fatores de carga carrega o primeiro componente do CMG, o complexo hexamérica Mcm2-7, no dsDNA 12,13,14,15,16 na forma de hexâmeros duplos com uma configuração frente a frente 15,17,18. No caso específico da levedura, esse processo inicial ocorre em sequências específicas de DNA conhecidas como origens de replicação¹. Embora Mcm2-7 seja o núcleo motor da helicase replicativa, ele é por si só incapaz de desenrolar o DNA¹⁹ sem os dois fatores ativadores de helicase Cdc45 e GINS, que precisam ser recrutados para o Mcm2-7 carregado para dar origem ao CMG totalmente ativo 11,19,20,21. O processo de ativação da helicase ocorre na fase S do ciclo celular e começa com a fosforilação seletiva de hexâmeros duplos Mcm2-7 pela quinase regulada pelo ciclo celular DDK 22,23,24. Esses eventos de fosforilação facilitam o recrutamento de Cdc45 e GINS para os hexâmeros duplos Mcm2-7 10,22,23,24,25,26 por um segundo conjunto de proteínas conhecidas como fatores de disparo 10,11,26 . A ligação de Cdc45 e GINS dá origem a duas helicases irmãs CMG, que inicialmente encerram ambas as fitas do DNA parental e ainda estão localizadas em uma configuração frente a frente^11,27. Na etapa final de ativação, o fator de disparo Mcm10 catalisa a extrusão dependente de hidrólise de ATP de uma fita de DNA de cada CMG¹¹ irmão. Após a extrusão da fita, as helicases irmãs CMG contornam e se separam umas das outras translocando ao longo do ssDNA de maneira dependente da hidrólise do ATP 11,20,21,28, desenrolando o DNA excluindo estericamente a fita de não translocação ²⁹. Todo esse processo foi totalmente reconstituído in vitro a partir de um conjunto mínimo de 36 polipeptídeos purificados de S. cerevisiae ^10,11.

Apesar da regulação in vivo requintada da montagem e ativação do CMG descrita acima, os estudos de movimento de molécula única reconstituídos in vitro do CMG 2,30,31,32,33,34 até agora se basearam no CMG pré-ativado purificado como um complexo de células^20,21, faltando todas as etapas anteriores à sua ativação e a natureza bidirecional de seu movimento. Essa abordagem de CMG pré-ativada tem sido o padrão-ouro no campo de molécula única, em parte devido à complexidade bioquímica da reação de montagem de CMG totalmente reconstituída^10,11. Essa reação bioquímica tem sido um desafio para traduzir do nível bioquímico em massa para o nível de molécula única por vários motivos. Primeiro, para maximizar a eficiência da reação, os fatores de carga e disparo necessários para a montagem e ativação do CMG são necessários em concentrações na faixa de 10-200 nM 10,11,27. Essas faixas de concentração correspondem ao limite superior do que a maioria das técnicas de molécula única pode tolerar, especialmente quando se usa componentes marcados com fluorescência³⁵. Finalmente, o CMG evoluiu para cruzar milhares de pares de bases em uma célula 36,37,38,39. Portanto, para estudar seu movimento em uma escala espacial biologicamente relevante, são necessários substratos de DNA longos (normalmente de comprimentos da ordem de dezenas de quilobases) ^{30 , 31 , 34 , 40 , 41 , 42} . O emprego de substratos de DNA tão longos apresenta o desafio adicional de que quanto mais longo for o substrato de DNA, mais locais de ligação não específicos potenciais para proteínas e agregados de proteínas ele possui. No caso do CMG, o último ponto é particularmente importante, pois vários dos fatores de carga e disparo envolvidos na montagem e ativação do CMG contêm regiões intrinsecamente desordenadas⁴³ e são propensos à agregação.

Aqui, relatamos um ensaio de conjunto híbrido e molécula única que permitiu a observação e quantificação do movimento do CMG após a reconstituição completa de sua montagem e ativação a partir de 36 polipeptídeos purificados de S. cerevisiae ²⁸. Este ensaio baseia-se na dupla funcionalização de ambas as extremidades de um substrato de DNA com duas porções de ligação ortogonal: destiobiotina e digoxigenina² (Figura 1A). A primeira porção, a destiobiotina, é usada para ligar reversivelmente o substrato de DNA às esferas magnéticas revestidas de estreptavidina⁴⁴ ( Figura 1B ). Em seguida, o CMG marcado com fluorescência é montado e ativado no DNA ligado ao grânulo, e um rack magnético é usado para purificar e lavar os complexos magnéticos resultantes de DNA ligado ao grânulo: CMG (Figura 1C). Ao fazer isso, o excesso de proteína que de outra forma se agregaria no substrato de DNA é removido; isso fornece complexos DNA:CMG virtualmente livres de agregação. Os complexos intactos são então eluídos dos grânulos magnéticos pela adição de um excesso molar de biotina livre, que pode superar a interação destiobiotina-estreptavidina (Figura 1D). DNA individual: Os complexos CMG são então ligados entre dois grânulos de poliestireno opticamente presos revestidos com anticorpo anti-digoxigenina (anti-Dig); para esta etapa, a segunda porção no DNA, digoxigenina, é usada, pois pode se ligar ao anti-Dig mesmo em uma solução tampão contendo um excesso de biotina livre ( Figura 1E ). Uma vez que o complexo DNA: CMG é mantido no lugar na armadilha óptica, o movimento do CMG marcado com fluorescência é visualizado com um laser de varredura confocal (Figura 1F). Prevemos que este ensaio pode ser facilmente adaptado para o estudo no nível de molécula única de interações DNA:proteína igualmente complexas.

Protocolo

1. Síntese de substrato de DNA linear duplamente funcionalizado e ligação a esferas magnéticas

1. Dupla funcionalização do substrato de DNA com porções de destiobiotina e digoxigenina
   1. Linearizar 20 μg de plasmídeo pGL50-ARS1 de 23,6 kb (contendo uma origem natural de replicação ARS1, clonada internamente e disponível mediante solicitação) com 200 unidades de enzima de restrição AflII por 16 h a 37 °C em um volume final de 200 μL de 1x tampão (acetato de potássio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, acetato de magnésio 10 mM, 100 μg/ml BSA, pH 7,9).
      NOTA: Esta etapa pode ser reduzida para 4 h sem reduzir o rendimento, se for mais conveniente.
   2. Inative o AflII incubando a reação a 65 °C durante 20 min. Embotar as saliências de 4 nucleotídeos TTAA resultantes suplementando a reação de linearização de 200 μL com 60 unidades de fragmento de Klenow (3 'a 5' exo-) polimerase, 17 μL de tampão 10x (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM D-Destiobiotina-7-dATP, 33 μM Digoxigenina-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, e água ultrapura até um volume final de 370 μM. Incubar a reação a 37 °C por 30 min.
      NOTA: Nesta etapa, o Fragmento de Klenow embota as saliências em ambas as extremidades do DNA linearizado, incorporando dois nucleotídeos D-Destiobiotina-7-dATP e dois nucleotídeos Digoxigenina-11-dUTP em cada extremidade.
   3. Complemente a reação com EDTA 10 mM e inative o fragmento de Klenow incubando a reação a 75 ° C por 20 min. Traga o volume de reação para 400 μL com água ultrapura.
   4. Pegue quatro colunas de centrifugação S-400, agite-as por pelo menos 30 s para ressuspender a resina e, em seguida, centrifugue-as por 1 min a 735 x g para remover o tampão de armazenamento. Transfira as colunas para tubos limpos de 1,5 mL.
   5. Adicione imediatamente 100 μL da solução de DNA a cada coluna e centrifugue-os por 2 min a 735 x g. O DNA está agora no fluxo e as colunas podem ser descartadas.
   6. Agrupar o fluxo das quatro colunas, medir o volume com uma pipeta e medir a concentração de ADN com um espectrofotómetro. Isso será usado para calcular a quantidade de DNA ligada às contas.
2. Ligação de DNA linear duplamente funcionalizado a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina
   1. Grânulos magnéticos revestidos de estreptavidina Vortex M-280 por 30 s para ressuspendê-los.
   2. Transfira 4 mg de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina M-280 ressuspensas para um tubo limpo de 1,5 mL. Coloque o tubo em um rack magnético, aguarde 1 min para que as contas sejam coletadas e remova o buffer de armazenamento.
   3. Adicione 1 mL de 1x tampão A (5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA e 1 M NaCl) aos grânulos e ressuspenda por vórtice por 5 s. Incube as esferas em temperatura ambiente por 5 min.
      NOTA: Todos os tampões devem ser filtrados estéreis. Faça um grande volume de 2x buffer A, 1x buffer B (veja abaixo) e 1x buffer C (veja abaixo) com antecedência para economizar tempo (recomendado). Esses buffers são os recomendados pelo fabricante dos grânulos magnéticos e podem ser armazenados a - 20°C.
   4. Coloque o tubo em um suporte magnético, aguarde 1 min para que as contas sejam coletadas e remova o tampão A.
   5. Ressuspenda os grânulos em 400 μL de tampão 2x A pipetagem e, em seguida, adicione 400 μL de solução de DNA funcionalizada (observe que isso dilui o tampão 2x A para uma concentração final de 1x, o que é ideal para a ligação do DNA aos grânulos). Misture delicadamente pipetando.
   6. Incubar a mistura de grânulos / DNA durante a noite a 4 ° C com rotação de ponta a ponta para permitir que o DNA funcionalizado se ligue aos grânulos.
   7. Use o rack magnético para remover o sobrenadante (não descarte antes de medir seu volume com uma pipeta e a concentração de DNA não ligado com um espectrofotômetro) e lave os grânulos 2x com 500 μL de tampão B (10 mM HEPES-KOH pH 7,6, 1 mM EDTA e 1 M KOAc) para remover o DNA não especificamente ligado. Lave as esferas 2x com 500 μL de tampão C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 e 1 mM EDTA), que é o tampão de armazenamento recomendado pelo fabricante.
      1. Calcule a quantidade total de DNA ligado às esferas magnéticas comparando a quantidade total de DNA adicionada às esferas com a quantidade de DNA restante no sobrenadante. O rendimento deve estar na faixa de 2,3-2,9 mg de DNA (~ 150-190 fmol) por mg de esferas magnéticas. Se forem obtidos rendimentos mais baixos, verifique se as colunas S400 não estão secas antes de usá-las. Monitore constantemente a integridade do DNA por eletroforese em gel para garantir que o substrato inicial do DNA do plasmídeo não seja degradado.
   8. Ressuspenda os grânulos em 300 μL de tampão C e armazene a 4 °C. Para evitar cortes, faça 4 alíquotas descartáveis de 1 mg de esferas magnéticas e não armazene o DNA por mais de 2 semanas.

2. Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para obter imagens e quantificar o movimento de CMG totalmente reconstituído com pinças ópticas de feixe duplo correlativas e microscopia confocal

1. Montagem de conjunto e ativação de CMG marcado com fluorescência em DNA ligado a esferas magnéticas (Figura 1C).
   NOTA: As reações de montagem e ativação do CMG foram realizadas em duas etapas: carregamento e fosforilação de Mcm2-7 e montagem e ativação do CMG. A menos que especificado de outra forma, todas as etapas de troca de buffer foram conduzidas com a ajuda de um rack magnético, permitindo que os grânulos fossem coletados pelo ímã por 1 min e, em seguida, removendo o sobrenadante. Todas as incubações foram conduzidas em um bloco de calor com temperatura controlada com tampa para evitar o fotobranqueamento de proteínas fluorescentes. Se não houver tampa disponível, os tubos devem ser cobertos com papel alumínio. A purificação e marcação fluorescente de todas as proteínas empregadas neste protocolo foram realizadas conforme descrito anteriormente^10,11,28.
   1. Carregamento e fosforilação de Mcm2-7
      1. Pegue 1 mg de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina ligadas ao DNA e remova o tampão de armazenamento (tampão C).
      2. Lave os grânulos com 200 μL de tampão de carga (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM K glutamato, 10 mM MgOAc, 0,02% de substituto NP40, 10% de glicerol, 2 mM DTT, 100 μg/mL de BSA e 5 mM de ATP).
      3. Remova o buffer de carregamento e ressuspenda os grânulos em 75 μL de buffer de carregamento. Misture delicadamente pipetando.
      4. Adicione ORC a uma concentração final de 37,5 nM ao DNA ligado ao grânulo e incube a reação por 5 min a 30 ° C com agitação de 800 rpm.
      5. Adicionar Cdc6 a uma concentração final de 50 nM e incubar a reação durante 5 min a 30 °C com agitação de 800 rpm.
      6. Adicione Mcm2-7 / Cdt1 (ou marcado com fluorescência Mcm2-7^{JF646-Halo-Mcm3} / Cdt1) a uma concentração final de 100 nM e incube a reação por 20 min a 30 ° C com agitação de 800 rpm.
      7. Adicionar DDK a uma concentração final de 100 nM e incubar a reacção durante 30 min a 30 °C com agitação de 800 rpm.
      8. Remova o sobrenadante e lave o DNA ligado ao grânulo (que agora contém hexâmeros Mcm2-7 fosforilados) com 200 μL de tampão de lavagem com alto teor de sal (HSW) (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02% NP40 substituto, 10% glicerol, 1 mM DTT e 400 μg/mL BSA). Misture pipetando, garantindo que as esferas sejam totalmente ressuspensas no tampão e que nenhum aglomerado seja visível.
      9. Remova o tampão HSW e lave os grânulos uma vez com 200 μL de tampão CMG (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM K glutamato, 10 mM MgOAc, 0,02% de substituto NP40, 10% de glicerol, 1 mM de DTT e 400 μg/mL de BSA).
   2. Montagem e ativação de CMG marcado com fluorescência
      1. Remova o tampão CMG e ressuspenda os grânulos ligados ao DNA em 50 μL de tampão CMG suplementado com 5 mM ATP.
      2. Adicione 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45^LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 e 10 nM Mcm10 ao DNA ligado ao grânulo. Para esta etapa, misture todas as proteínas em um tubo imediatamente antes de adicioná-las ao DNA e coloque-o no gelo. Adicione o DNA ressuspenso ligado a esferas à mistura de proteínas. Incubar a reação por 15 min a 30 °C com agitação de 800 rpm.
      3. Lave os grânulos 3x com 200 μL de tampão HSW. Lave os grânulos uma vez com 200 μL de tampão CMG.
   3. Eluição de complexos DNA:CMG intactos de esferas magnéticas (Figura 1D)
      1. Remova o tampão CMG e elua os complexos DNA:CMG dos grânulos magnéticos, ressuspendendo os grânulos magnéticos ligados ao DNA contendo CMG em 200 μL de tampão de eluição (tampão CMG suplementado com 10 mM de biotina). Incubar à temperatura ambiente durante 1 h com agitação de 800 rpm.
      2. Coloque o tubo em um rack magnético e deixe as contas serem coletadas por 5 min. Colete cuidadosamente o sobrenadante (que agora contém os complexos DNA:CMG eluídos) sem interromper as esferas sedimentadas e transfira-o para um novo tubo.
      3. Para garantir que não restam grânulos na solução (uma vez que os grânulos magnéticos deixados na solução podem interferir com a parte de aprisionamento óptico do ensaio), coloque novamente o sobrenadante recolhido num suporte magnético e permita que os grânulos restantes sejam recolhidos durante mais 5 minutos. Recolha cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo.
      4. Adicione 1400 μL de tampão CMG aos 200 μL de sobrenadante. A amostra agora está pronta para imagens de molécula única.
2. Imagem de molécula única de CMG totalmente reconstituída com pinças ópticas de feixe duplo correlativas e microscopia confocal (Figura 1E-G).
   NOTA: A parte de molécula única do ensaio é conduzida em uma configuração comercial que combina pinças ópticas de feixe duplo com microscopia confocal e microfluídica^45,46 (Figura 1E-G), mas também pode ser conduzido em uma configuração construída em casa. A configuração comercial usada aqui é equipada com uma célula de fluxo microfluídico com cinco entradas (chamadas de canais 1-5, respectivamente) e uma saída (Figura 1E). Nas etapas abaixo, todos os nomes de botões e/ou painéis são específicos para o software fornecido com esta configuração comercial.
   1. Use as cinco entradas na configuração comercial da seguinte forma: Injete os canais 1-3 da esquerda e use-os para captura de esferas (Canal 1), ligação do complexo DNA-proteína (Canal 2) e verificação da presença de CMG (Canal 3). Use os canais 4 e 5 como reservatórios de proteína e locais de troca de tampão. Antes de cada experimento, passivar a célula de fluxo microfluídico por pelo menos 30 min com 1 mg/mL de albumina de soro bovino, seguida de 0,5% de Pluronic F-127 dissolvido em água ultrapura.
      1. Certifique-se de que o conteúdo de cada canal em cada experimento seja o descrito (Figura 1E):
         Canal 1: Grânulos de poliestireno revestidos com antidigoxigenina (2,06 μm de diâmetro) diluídos 1:50 em PBS;
         Canal 2: DNA: complexos CMG eluídos de esferas magnéticas;
         Canal 3: Tampão de imagem (tampão CMG suplementado com 2 mM de 1,3,5,7 ciclooctatetraeno, 2 mM de 4-nitrobenzilalcool e 2 mM de Trolox);
         Canais 4 e 5: Tampão de imagem complementado com RPA de 25 nM, Mcm10 de 10 nM e ATP de 5 mM, ATPγS de 5 mM ou nenhum nucleotídeo.
   2. Antes do experimento, ajuste a potência do laser de aprisionamento para obter uma rigidez de 0,3 pN/nm em ambos os purgadores^33,46 clicando no botão Recalibrar no painel Power Controls do software. Defina o tamanho do pixel confocal para 50 x 50 nm, o tamanho da imagem para 160 x 18 pixels, o tempo de iluminação por pixel para 0,2 ms e a taxa de quadros para 5 s no painel Digitalização de imagem do software. Defina o controle de temperatura para 30 °C no painel Temperatura.
      NOTA: Além disso, recomendamos definir a velocidade máxima do estágio (usado para se mover entre os canais) para 0.2 mm/s para minimizar a dissociação do CMG do DNA pela força de arrasto.
   3. Flua todas as soluções para a célula de fluxo a uma pressão constante de 0,5 bar na porta de injeção (que pode ser configurada no painel Barra de pressão do software). Em seguida, desligue o fluxo nos canais 4 e 5. Depois de fluir inicialmente todas as soluções, reduza a pressão para 0,2 bar.
   4. Mova os lasers de captura para o Canal 1 até que uma conta seja capturada em cada armadilha óptica. Mova as contas presas para o Canal 2 movendo o joystick enquanto pressiona o gatilho. Em seguida, pesque um complexo DNA:CMG movendo o cordão direito para perto e para longe do cordão esquerdo usando o joystick sem pressionar o gatilho, até que uma corda de DNA seja presa (o que é conhecido monitorando a curva de extensão de força do DNA⁴⁷ preso no painel FD Viewer do software).
      1. Para amarração de DNA, certifique-se de inserir o comprimento do DNA e o valor correto da temperatura no painel Modelo de referência, que plotará automaticamente um modelo teórico de cadeia extensível semelhante a um verme da construção do DNA no painel FD Viewer. Se uma única molécula de DNA estiver presa entre as duas contas, o comportamento de extensão de força do DNA deve corresponder ao modelo de cadeia semelhante a um verme extensível plotado. Certifique-se de que este seja o caso monitorando a curva experimental de força-extensão, que o software irá traçar automaticamente sobre a teórica.
         NOTA: Desvios do modelo teórico podem indicar a presença de múltiplas moléculas de DNA ligadas entre as esferas e/ou a presença de agregados de proteínas ligados ao DNA e compactando-o. Para evitar a dissociação mediada por força de proteínas do DNA, não exceda uma tensão de 10 pN durante este teste inicial.
   5. Mova as contas para o Canal 3 e pare imediatamente o fluxo em todos os canais. Faça uma varredura de teste de um quadro no Canal 3 para confirmar a presença de CMG, iluminando com um laser de 561 nm a uma potência de 4 μW, conforme medido na objetiva. Ajuste as potências do laser de imagem no painel Lasers de excitação. Se presente, o CMG aparecerá como pontos bidimensionais limitados por difração, conforme mostrado na Figura 1G e na Figura 2A.
      1. Se nenhum DNA puder ser capturado, verifique se há bolhas no canal 2, o que pode diminuir o fluxo no canal 2 (em comparação com os canais 1 e 3). Se houver bolhas, aumente a pressão no canal 2 para 1 bar para tentar liberar as bolhas.
   6. Se o CMG estiver presente, mova a corda de DNA para o canal 4 ou 5 para obter imagens; Caso contrário, ligue o fluxo novamente, descarte os grânulos e volte para a etapa 2.2.4.
   7. Nos canais 4 ou 5, ajuste a distância entre os grânulos para atingir uma tensão inicial de 2 pN na corda de DNA. Para isso, insira 2 pN no painel Forçar Espectroscopia e clique no botão Ativar para iniciar um grampo de força. Quando a tensão inicial atingir 2 pN, desative o grampo de força antes da imagem clicando no botão Ativar no painel Espectroscopia de Força.
   8. Imagem CMG^Cdc45-LD555 a cada 5 s com um laser de 561 nm a uma potência de 4 μW, conforme medido na objetiva (Figura 1F). Para isso, clique no botão Iniciar digitalização no painel Digitalização de imagem. Nessas varreduras, o CMG será exibido como pontos bidimensionais limitados por difração, como o exemplo na Figura 1G.
      1. Se o CMG for observado, mas não parecer se mover antes do branqueamento, teste todas as proteínas usadas para a atividade da nuclease, pois cortes no DNA farão com que o CMG se dissocie do DNA⁴¹, reduzindo severamente sua processividade aparente.
         NOTA: Uma potência de laser de 4 μW deve fornecer resultados consistentes se estiver usando o microscópio comercial usado aqui. Se estiver usando uma configuração de construção doméstica, recomendamos estimar a potência ideal do laser empiricamente. Uma potência de laser ideal deve fornecer sinal suficiente do fluoróforo para localizá-lo com a precisão desejada e uma vida útil do fluoróforo próxima ao intervalo de tempo desejado do experimento.
         NOTA: Embora esta publicação se concentre no ensaio de conjunto híbrido e molécula única, publicamos anteriormente uma descrição abrangente da análise dos dados gerados com este ensaio⁴⁸.

Resultados

Quando realizado corretamente, o protocolo descrito aqui deve produzir complexos DNA:CMG virtualmente livres de agregados. Uma reação livre de agregação não deve obstruir nenhum dos canais na célula de fluxo microfluídico e deve ser possível esticar as moléculas de DNA aprisionadas até uma extensão de ponta a ponta dentro de 10% de seu comprimento de contorno sem quebrar o DNA. Por outro lado, se houver agregação na reação, as moléculas de DNA às vezes podem ser compactadas pelos agregados, muitas vezes causando quebra de DNA se esticadas. Uma boa maneira de reconhecer agregados de proteínas é observando as varreduras 2D do DNA. Em uma reação livre de agregação, o CMG aparece como pontos discretos e simétricos limitados por difração que aglomeram esparsamente o DNA, como os das varreduras mostradas na Figura 2A. Pelo contrário, os agregados são menos discretos, às vezes bolhas assimétricas que ocupam um comprimento maior do DNA, como as das varreduras mostradas na Figura 2B. Além disso, se o ensaio for executado com sucesso e a alta pureza das proteínas purificadas for alcançada, o movimento de longo alcance do CMG na presença de ATP será visto, conforme observado no quimógrafo mostrado na Figura 2C.

Figura 1: Descrição pictórica do conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem e quantificação do movimento de CMG totalmente reconstituído. (A) Um DNA linear de 23,6 kb contendo uma origem de replicação ARS1 de ocorrência natural é duplamente funcionalizado em ambas as extremidades com porções de destiobionina e digoxigenina. (B) O DNA duplamente funcionalizado está ligado a esferas magnéticas revestidas de estreptavidina por meio de suas porções de destiobiotina. (C) O CMG é montado e ativado passo a passo no DNA ligado a esferas magnéticas com diferentes etapas de lavagem incluídas para remover o excesso de proteína não ligada e agregados de proteínas. (D) DNA intacto: Os complexos CMG são então eluídos dos grânulos magnéticos pela adição de um excesso de biotina livre, que supera a interação destiobiotina-estreptavidina. (E) DNA individual: Os complexos CMG são ligados entre dois grânulos de poliestireno opticamente presos revestidos com anti-digoxigenina com a ajuda de uma célula de fluxo microfluídico. Observe que a interação Dig-anti-Dig é ortogonal às interações biotina-avidina, portanto, não é afetada pela presença de biotina livre. (F) Uma vez mantidos no lugar pelas pinças ópticas, os complexos DNA: CMG são transferidos para diferentes condições de tampão, onde o plano do DNA é então escaneado com um laser de varredura confocal para obter imagens do movimento do CMG ao longo do DNA ao longo do tempo. (G) O painel superior mostra um diagrama de um complexo DNA: CMG mantido no lugar entre dois grânulos de poliestireno revestidos com anti-Dig opticamente presos sendo escaneados por um laser de varredura confocal. O painel inferior mostra um exemplo de varredura 2D de CMG ligado a um DNA mantido no lugar com uma armadilha óptica. O DNA não é rotulado nesses experimentos, mas pode ser pensado como uma linha horizontal que atravessa o meio da imagem. Este número foi modificado de²⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de dados de um experimento bem-sucedido e malsucedido. (A) Exemplo de varreduras 2D de um DNA contendo CMG em uma amostra livre de agregação. Em ambas as varreduras, o CMG mostra pontos simétricos e discretos limitados por difração esparsamente distribuídos ao longo do DNA. (B) Exemplo de varreduras 2D de um DNA contendo CMG em uma amostra contendo agregados. Em ambas as varreduras, o CMG forma bolhas menos simétricas que aglomeram o DNA. (C) Quimógrafo mostrando a posição no DNA de pontos limitados por difração de CMG ao longo do tempo na presença de ATP, mostrando o movimento de longo alcance dos complexos CMG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Etapas críticas e verificações importantes da qualidade do reagente
As etapas críticas e as verificações de qualidade do reagente biológico no ensaio são destacadas aqui. Primeiro, a pureza das proteínas usadas é importante porque a degradação do DNA causada até mesmo por pequenos contaminantes de nuclease nas amostras de proteínas afetará adversamente os dados. Isso ocorre porque apenas moléculas de DNA intactas (ou parcialmente cortadas) podem ser presas nas pinças ópticas de feixe duplo. Mais importante, cortes no DNA farão com que o CMG se dissocie⁴¹, complicando a observação do movimento de longo alcance do CMG. Recomendamos fortemente testar cada proteína purificada quanto à atividade da nuclease, bem como monitorar constantemente a integridade do substrato do plasmídeo inicial para garantir que o corte seja reduzido ao mínimo. O segundo passo importante é a remoção cuidadosa das esferas magnéticas após a eluição dos complexos DNA:CMG. A remoção do sobrenadante nesta etapa deve ser realizada lentamente para não perturbar os grânulos coletados. Se os grânulos magnéticos forem deixados na amostra voada para as pinças ópticas, eles geralmente atingirão os grânulos de poliestireno presos opticamente, fazendo com que escapem da armadilha óptica e complicando a aquisição de dados. Finalmente, os complexos DNA:CMG devem ser manuseados com cuidado nas pinças ópticas. Para isso, recomendamos não aumentar a tensão do DNA acima de 10 pN, pois a aplicação de força pode dissociar o CMG do DNA. Além disso, o movimento entre os canais na célula de fluxo microfluídico deve ser feito o mais lentamente possível (~ 0,2 mm / s) para evitar que as forças de arrasto resultantes dissociem o CMG do DNA.

Modificações do método
Existem várias etapas do ensaio que podem ser modificadas. Por exemplo, mostramos que o tempo de eluição pode ser reduzido de 60 min para 30 min sem afetar significativamente o rendimento da eluição. Além disso, recomendamos suplementar o tampão de eluição com uma concentração baixa (abaixo de 1 mM) de ATP ou ATPγS para evitar que o CMG se difunda nas extremidades do DNA, bem como para estabilizar geralmente o CMG²⁸. Além disso, embora as composições de tampão e as concentrações de proteínas que relatamos aqui sejam baseadas naquelas empregadas em trabalhos bioquímicos e de molécula única de conjunto anteriores^11,18, o ensaio que descrevemos é totalmente compatível com outros protocolos para montar CMG^26,27. Portanto, qualquer avanço bioquímico relatado para aumentar a eficiência da montagem ou ativação do CMG pode e deve ser implementado na maior parte do ensaio para aumentar o rendimento. Finalmente, aumentar o tempo entre os quadros aumenta o tempo total em que o CMG pode ser visualizado, facilitando a observação do movimento do CMG de longo alcance antes do branqueamento do fluoróforo.

Limitações do método
O método híbrido que descrevemos é limitado, pois só é possível obter imagens do CMG após sua ativação em massa. Mais trabalho será necessário para observar a ativação do CMG em tempo real. Outra limitação importante é que, embora esperemos que o CMG seja montado em pares 17,26,27, o número total de complexos CMG por DNA que observamos é principalmente um²⁸, sugerindo que o CMG, ou pelo menos o Cdc45, está se dissociando do DNA durante o manuseio dos complexos sensíveis DNA:CMG. A redução do número de etapas de manuseio antes da imagem de molécula única, bem como o desenvolvimento de melhores estratégias de passivação para a tubulação de plástico e o vidro da célula de fluxo microfluídico, estão prontos para aumentar esse rendimento.

Significado do método
Estudos de movimento de molécula única de CMG até agora empregaram CMG pré-ativado purificado como um complexo de células. Embora relativamente mais simples, essa abordagem de CMG pré-ativada é limitada, pois perde qualquer uma das etapas que levam à ativação do CMG, bem como a natureza bidirecional do CMG e do movimento do replisoma. Por outro lado, a reconstituição completa da montagem e ativação do CMG tem o potencial de estudar quaisquer etapas de pré-ativação, bem como estudar o movimento do CMG de maneira bidirecional. No entanto, essa abordagem é mais difícil de traduzir do nível bioquímico em massa para o nível de molécula única, pois envolve muito mais fatores e etapas de proteína purificada. O ensaio que descrevemos aqui ajudou a superar esses desafios, permitindo-nos visualizar o movimento do CMG totalmente reconstituído no nível de uma única molécula, permitindo-nos acessar algumas dinâmicas de pré-ativação anteriormente perdidas²⁸. Além disso, embora vejamos principalmente um CMG por DNA, fomos capazes de observar várias instâncias de dois complexos CMG movendo-se em direções opostas, e pudemos até capturar a separação inicial de CMGs irmãos um do outro²⁸, fornecendo alguns insights sobre o estabelecimento da replicação bidirecional.

Outra vantagem deste ensaio em comparação com o movimento CMG anterior reside na natureza totalmente de fita dupla do substrato de DNA que empregamos (Figura 1A). Em trabalhos anteriores de CMG pré-ativados, a maneira mais comum de ligar o CMG ao substrato de DNA é através de um retalho de ssDNA 3'. Isso resulta em uma construção de DNA que não pode ser facilmente restringida por torção e, portanto, proíbe o estudo do papel do superenrolamento na progressão do replisoma. Por outro lado, a nova abordagem que descrevemos aqui pode ter o potencial de ser adaptada para estudar o papel do torque nesse processo, já que o substrato de DNA usado é completamente de fita dupla.

Aplicações mais amplas do método
O ensaio híbrido descrito abrirá o caminho para a reconstituição completa de um replissoma eucariótico completo, permitindo que nós e outros observemos e quantifiquemos a dinâmica importante que permite que o replissoma tenha sucesso em todas as suas diferentes tarefas. Replicação de DNA à parte, o ensaio que relatamos representa um avanço importante na tradução de uma reação bioquímica complicada do bioquímico em massa para o nível de molécula única. Prevemos que este ensaio pode ser facilmente modificado para estudar interações DNA:proteína igualmente complexas envolvidas em diferentes mecanismos de processamento de DNA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AflII	NEB	R0520L
Contas de poliestireno revestidas com anti-digoxigenina	Solução de ATP Spheroteck	DIGP-20-2
	Thermo Fisher	R0441
ATPγ S	Roche	11162306001
BSA	NEB	B9000S
C-Trap	Lumicks
CutSmart Buffer	NEB	B6004S	Fornecido com AflII
dCTP	Promega	U122B
D-Destiobiotina-7-dATP	Jena Bioscience	NU-835-Desthiobio
dGTP	Thermo Fisher	10218014
Digoxigenina-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin contas magnéticas	Invitrogen	11205D
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)	NEB	M0212L
Microspin S-400 HR	GE Healthcare	GE27-5140-01
NEBuffer2	NEB	B7002S	Fornecido com Fragmento Klenow
Nonidet  P 40 Substituto	Sigma	74385
Pluronic F-127	Sigma	P2443