Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpos usando um kit de bioensaio ADCC. Este método oferece uma ferramenta valiosa para elucidar o mecanismo ADCC e avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos na imunoterapia contra o câncer.
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Artigo de método
Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O método de citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células (ADCC) representa uma ferramenta importante para avaliar a eficácia de anticorpos terapêuticos na imunoterapia contra o câncer. Avaliar a atividade do ADCC em células cancerígenas é essencial para o desenvolvimento e otimização de tratamentos baseados em anticorpos. Aqui, propomos uma abordagem metodológica de utilização de um kit de bioensaio ADCC para avaliação quantitativa da reação ADCC usando células de câncer de tireoide como células efetoras. O protocolo envolve a co-cultura de células efetoras com células-alvo cancerígenas em diferentes proporções na presença de um anticorpo terapêutico. O kit de bioensaio ADCC usado neste experimento inclui as células efetoras geneticamente modificadas que expressam um gene repórter de luciferase sob o controle de elementos de resposta do Fator Nuclear de Células T Ativadas (NFAT). Após a ligação do antígeno de superfície nas células-alvo com os anticorpos e células efetoras, as células efetoras liberam luciferase, permitindo a quantificação da citotoxicidade por meio da medição do sinal de luminescência. Em contraste com os ensaios convencionais de ADCC, este método provou a ligação do antígeno alvo com anticorpos e células efetoras, que podem produzir resultados confiáveis em um curto período.
Introdução
A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo importante pelo qual os anticorpos exercem efeitos de morte celular mediados imunologicamente 1,2,3. As células imunes são ativadas pela ligação ao anticorpo terapêutico, que interage com os antígenos de superfície das células-alvo para liberar granzimas, a perforina, levando à morte da célula-alvo. Essas células imunes incluem células natural killer (NK) e neutrófilos 2,3,4,5,6,7. O ensaio ADCC tornou-se uma importante ferramenta para avaliar a eficácia do anticorpo terapêutico 8,9.
No ensaio ADCC convencional, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou células assassinas naturais são usadas como células efetoras para monitorar a eficácia de um anticorpo terapêutico, quantificando a taxa de morte celular do alvo. Nosso método usa um kit de bioensaio ADCC que inclui células efetoras geneticamente modificadas que expressam um gene repórter de luciferase sob o controle de elementos de resposta do Fator Nuclear de Células T Ativadas (NFAT). Em seguida, quantificamos a ligação do antígeno de superfície nas células-alvo com o anticorpo e as células efetoras. Este método é baseado na reação ADCC que ocorre em um curto período sem a necessidade de células PBMC humanas. As etapas experimentais incluem a co-cultura de células efetoras com células-alvo na presença de anticorpos terapêuticos.
Durante a incubação, o anticorpo terapêutico se liga ao antígeno alvo na superfície das células-alvo, o que leva à ligação das células efetoras e do fragmento Fc de um anticorpo. Isso ativa o elemento de resposta NFAT e libera sinais de luminescência para a avaliação quantitativa da reação ADCC.
Antes de realizar o experimento, a expressão do antígeno-alvo nas células-alvo deve ser confirmada por citometria de fluxo ou western blotting. As células-alvo são cultivadas e passadas para placas de 96 poços por 24 horas antes do experimento. Diferentes concentrações de um anticorpo terapêutico são adicionadas junto com diferentes contagens de células efetoras para atingir a proporção calculada de células efetoras para células-alvo.
As principais etapas deste método incluem (1) preparação de células-alvo e células efetoras, (2) proporções de células efetoras para células-alvo, (3) preparação de diferentes concentrações do anticorpo e (4) duração variável da incubação. Após a incubação, os sinais de luminescência são medidos usando um luminômetro, fornecendo uma leitura quantitativa da atividade do ADCC. Comparado a outros métodos de medição do ADCC, este método é relativamente simples de operar e os resultados são precisos.
O bioensaio repórter do ADCC indica a ligação do antígeno alvo, anticorpo terapêutico e células imunes na ativação da via ADCC. Essa ligação ativa a transcrição gênica através da via NFAT nas células efetoras projetadas pelas células Jurkat com o receptor FcγRIIIa de expressão estável, a variante V158 (alta afinidade). O elemento de resposta NFAT medeia a expressão da luciferase nas células efetoras10,11. A atividade biológica do anticorpo no mecanismo de ação (MOA) do ADCC é quantificada através do sinal de luciferase produzido a partir da via NFAT. O sinal da luciferase nas células efetoras - células Jurket que expressam o receptor FcγRIIIa - é quantificado usando um leitor de luminescência (Figura 1). A relação sinal-ruído do ensaio é alta.
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Protocolo
1. Detecção da expressão de EGFR e VEGFR em células-alvo
NOTA: Use western blotting para detectar a expressão do antígeno alvo nas células-alvo.
- Preparação da amostra
- Cultive as células (linhagens celulares de câncer de tireoide humano BHT-101 e SW-1736) em frascos T75 usando meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina).
- Colha as células quando estiverem 80% confluentes, removendo os meios de cultura e lavando as células com PBS. Adicione 5 mL de PBS e descarte as células usando um raspador de células para remover as células do frasco de cultura. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
- Conte as células com um contador de células.
- Alíquota 5 × 106 de células BHT-101 e SW-1736 em tubos cônicos de 15 mL.
- Gire as células a 135 × g por 5 min em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante PBS.
- Lisar o pellet celular adicionando 100 μL de tampão de lise RIPA contendo inibidores de protease-fosfatase por 5 min em gelo. Transfira o lisado para um tubo de 2 mL, centrifugue a 15.000 × g por 15 min e transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL.
- Meça a concentração de proteína do lisado celular usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
- Alíquota de 70 μg de proteína do lisado celular de cada amostra, adicione 2x tampão de amostra Laemmli suplementado com 10% de 2-mercaptoetanol e ferva as amostras a 100 ° C por 5 min para desnaturação das amostras.
- Eletroforese em gel e transferência de membrana
- Prepare o gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS) a 8% usando água destilada (4.7 mL), acrilamida a 30% (2.7 mL), tampão Tris 1.5 M, pH 8.8 (2.5 mL), dodecil sulfato de sódio a 10% (0.1 mL), persulfato de amônio a 10% (100 μL) e TEMED (10 μL).
- Execute 70 μg das amostras desnaturadas no gel de poliacrilamida SDS a 8% a 80 V por 20 min e a 120 V por 100 min.
- Transfira a proteína do gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) a 100 V por 90 min.
- Após a transferência, bloqueie a membrana com leite desnatado a 7% diluído em tampão TBS-T (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) por 1 h.
- Incubação de anticorpos
- Incube a membrana bloqueada com anticorpos monoclonais anti-receptor do fator de crescimento epidérmico de camundongo (EGFR) e anti-receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) de coelho (diluídos a 1:1.000 em leite desnatado a 7%) durante a noite a 4 ° C.
- Após a incubação, lave bem a membrana com tampão Tween salino tamponada com Tris (TBS-T) (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) por 7 min e repita 4x.
- Incube a membrana com o anticorpo secundário conjugado com HRP (diluído a 1:4.000 em leite desnatado a 7% (TBS-T)) por 1 h.
- Após a incubação, lave bem a membrana com tampão TBS-T por 7 min e repita 4 vezes.
- Detecção de proteínas
- Incube a membrana em substrato de HRP quimioluminescente preparado misturando 1 mL de solução de peróxido de substrato HRP com 1 mL de reagente de luminol de substrato HRP (ambos os reagentes são do kit de substrato quimioluminescente) por 2 min.
- Visualize a membrana usando um sistema de imagem.
2. Preparação das células-alvo
- Cultive as células T alvo, células BHT-101 e SW-1736 exponencialmente até 80% confluentes em meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina) em frascos T-75.
- Depois de remover a mídia, lave as células uma vez com PBS. Incube as células com 1 ml de tampão de dissociação celular não enzimático por 5 min para desalojar as células aderentes. Adicione PBS para interromper a reação do tampão de dissociação celular não enzimático. Gire as células a 135 × g por 5 min e adicione 5 mL de PBS.
NOTA: Aqui, usamos um tampão de dissociação celular não enzimático para preservar a integridade da proteína da superfície da membrana. - Conte as células e semeie-as em 15.000 células/poços em microplacas de poliestireno branco de 96 poços com fundo plano e transparente.
3. Preparação de concentrações variáveis do anticorpo terapêutico
- Para seguir este protocolo, use Cetuximab (anticorpo quimérico anti-EGFR) para ligar o EGFR e use Bevacizumab (anticorpo anti VEGF-A humanizado) como controle negativo.
- Prepare o tampão de bioensaio ADCC adicionando 1,4 mL de soro de baixa IgG em 33,6 mL de RPMI-1640 (fornecido no kit).
- Use o tampão de bioensaio ADCC para a diluição de anticorpos. Prepare 400 μL de cada anticorpo em três concentrações diferentes: 30 μg/mL, 3 μg/mL e 0,3 μg/mL (concentração 3x) para obter a concentração final de 10 μg/mL, 1 μg/mL e 0,1 μg/mL para cobertura de amplo espectro para detectar a dose ideal.
NOTA: As concentrações finais de anticorpos são baseadas em 25 μL de células-alvo cultivadas, 25 μL de células efetoras e 25 μL de anticorpo em cada poço de uma placa de 96 poços.
4. Preparação de células efetoras
- Conservar as células efetoras a -80 °C antes de utilizar.
- Pré-aqueça o tampão de bioensaio ADCC em banho-maria a 37 °C por pelo menos 30 minutos antes de usar.
- Descongele as células efetoras de bioensaio ADCC de armazenamento a frio a -80 °C, colocando-as em banho-maria a 37 °C (aproximadamente 2-3 min). Balance suavemente e inspecione visualmente o frasco, mas não o inverta durante o processo de descongelamento.
- Transfira 630ul de células efetoras para um tubo de 15 mL contendo 3,6 mL de tampão de ensaio ADCC. Misture bem invertendo suavemente o tubo 2x.
5. Incubação de células efetoras com anticorpos e células-alvo
- Após a incubação durante a noite, remova o meio das células-alvo (15.000 células cancerígenas por poço) e adicione 25 μL do tampão de bioensaio ADCC e 25 μL de cetuximabe (antagonista do EGFR) e bevacizumabe (antagonista do VEGF) para obter a concentração final de 0,1 μg/mL, 1 μg/mL ou 10 μg/mL das células-alvo em cada poço de acordo com a Figura 2.
- Adicione 75.000 células efetoras em 25 μL de tampão de bioensaio ADCC por poço na microplaca de 96 poços contendo células-alvo. Os poços rotulados como Sem mAb atuam como nenhum controle de anticorpos (Figura 2).
- Adicione o tampão de bioensaio ADCC aos poços rotulados como AB (tampão de bioensaio ADCC) para controle em branco.
- Incubar a placa durante 6 h.
6. Leitura quantitativa da atividade do ADCC
- Prepare o reagente do ensaio de luciferase 4 h antes da medição, adicionando tampão de ensaio de luciferase ao substrato de ensaio de luciferase (liofilizado).
- Após 6 h de incubação das células-alvo, anticorpos e células efetoras, adicione 75 μL do reagente do ensaio de luciferase a cada poço e incube por 30 min.
- Após o período de incubação, meça o sinal de luminescência em cada poço usando um luminômetro, fornecendo uma leitura quantitativa da atividade do ADCC.
- Para análise de dados, calcule a indução de dobra da seguinte maneira:
Indução de dobra = RLU (induzido por anticorpos - fundo) / RLU (sem controle de anticorpos - fundo).
Onde RLU são unidades de luminescência relativa; Os anticorpos induzidos são os poços B3 a B8 e C3 a C8; Sem controle de anticorpos = B2 e C2; Background = RLU médio do poço A2 a A5 (Figura 2).
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Resultados
A expressão de EGFR e VEGFR nas células-alvo BHT-101 e SW-1736 foi detectada usando western blotting. A expressão de EGFR foi detectada em células BHT-101 e SW-1736, mas não a expressão de VEGFR (Figura 3).
Usando o kit de bioensaio ADCC, detectamos a reação ADCC do anticorpo anti-EGFR, cetuximabe, usando linhagens celulares positivas para EGFR, BHT-101 e SW-1736, como células-alvo. O bevacizumabe, um inativador do VEGF, foi usado como anticorpo de controle negati...
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Discussão
Aqui, apresentamos o método de bioensaio ADCC para avaliar a reação ADCC de um anticorpo terapêutico. O método é direto e emprega um formato simples de "adicionar-misturar-ler" para medição.
Antes de fazer o experimento, a expressão do antígeno-alvo nas células-alvo deve ser confirmada por citometria de fluxo ou western blotting. A citometria de fluxo será uma ferramenta melhor para detectar o antígeno de superfície. No entanto, o uso da citometria de fluxo p...
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Divulgações
Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Somos gratos ao Prof. Zeng (IMCB, A*STAR) por apoiar este trabalho. Este estudo foi apoiado pela Fundação da Juventude da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC) (82202231) e pelo Projeto de Ciência e Tecnologia Médica e de Saúde da Província de Zhejiang, China (2021KY110,2024KY824).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5% Tripsina-EDTA | Gibco | 15400-054 | Diluir 10x em PBS para fazer 0,05% de Tripsina |
| 1x Tris Buffer Salino (TBS) | 1ª BASE | BUF-3030-1X1L | Para lavagem de membrana em western blotting |
| 1,5 M Tris Buffer, pH 8,8 | 1ª BASE | BUF-1419-1L-pH8.8 | Para preparação de gel SDS |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma Aldrich | M7522-100ML | Para preparação de amostras de western blotting |
| 30% de solução de acrilamida/Bis | Bio-Rad | #1610158 | Para preparação de gel SDS |
| 4x Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610747 | Para preparação de amostras de |
| microplaca de poliestireno branco de 96 poços de western blotting com fundo plano transparente | Corning | Incorporated 3610 | Para ensaio ADCC |
| Células efetoras de bioensaio ADCC (0,65 mL) | Promega | G7011 | Inclui no kit principal de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 1 frasco |
| Kit de núcleo de bioensaio repórter ADCC | Promega | G7010 | Mencionado como kit de bioensaio ADCC para ensaio ADCC neste experimento |
| Persulfato de amônio | Sigma Aldrich | A3678-25G | Para preparação de gel SDS |
| Bevacizumabe (anticorpo anti-VEGF humanizado) | MVASI-Use | como anticorpo de controle negativo no ensaio | |
| ADCCBHT-101 | Leibniz Institute DSMZ | ACC279 | Linha celular de câncer de tireoide papilar anaplásico humano |
| Tampão de ensaio de luciferase Bio-Glo | Promega | G7941 | Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x substrato |
| ensaio de luciferase Bio-Glo de 10 mL (liofilizado) | Promega | G7941 | Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 1 frasco |
| Raspador de células | GenFollower | GD00235 | Para remover a célula do frasco de cultura |
| Cetuximab (anticorpo anti-EGFR quimérico) | ERBITUX-Uso | como anticorpo terapêutico no ensaio ADCC | |
| Substrato de HRP quimioluminescente | Merck Millipore | WBKLS0500 | Para detecção de proteínas em western blotting |
| Água destilada | Gibco | 15230-162 | Para preparação de gel SDS |
| Soro bovino fetal (FBS) | Gibco | 10270-106 | Suplemento de meios de cultura |
| Sistema | de imagem iBright CL1500Thermo Scientific | 2462621100038 | western blotting |
| , 200 mM | Gibco | 25030-081 | Suplemento de meio de cultura Soro |
| de baixa IgG | Promega | G7110 | Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 4 mL |
| Megafuge | 8R Thermo Scientific | 42876589 | Centrífuga |
| Anticorpos monoclonais anti-EGFR de camundongo | BD Biosciences | 610016 | Anticorpo primário em western blotting |
| Anticorpos monoclonais anti-VEGFR de camundongo | BD Biosciences | 571194 | Anticorpo primário em |
| tampão de dissociação celular não enzimática | Sigma Aldrich | C5789-100ML | Para colheita de células do frasco T75 |
| Penicilina-estreptomicina | PAN Biotech | P06-07100 | Antibacteriano para meios de cultura |
| Tamponamento fosfato Salino (PBS), pH 7,2, Estéril filtrado | 1ª BASE | CUS-2048-1x1L | Use como solução de lavagem para células |
| Pierce Kit de ensaio BCA | Thermo Scientific | 23225 | Para medir a concentração de proteínas |
| Inibidor de protease e fosfatase | Thermo Scientific | A32959 | Para digestão de proteínas na preparação de amostras para western blotting |
| PVDF membrana (Immobilin-P) | Merck Millipore | IPVH00010 | Para transferência de proteínas em western blotting |
| Coelho anti-rato IgG, Fcγ Anticorpo secundário conjugado com HRP | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | Anticorpo secundário em Western blotting |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio | Capricorn Scientific | RPMI-XA | Meios de cultura de células |
| RPMI-1640 | Promega | G7080 | Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 36 mL |
| Leite em pó desnatado | Merck Millipore | 70166-500G | Para bloqueio de membrana em western blotting |
| Dodecil Sulfato de Sódio | 1ª BASE | BIO-2050-500g | Para preparação de gel |
| SDS SW-1736 | Cytion | 300453 | Linha celular de câncer de células escamosas da tireóide humana |
| Frascos de cultura T75 SPL | Lifesciences | 70075 | Frasco de cultura de células |
| Tecan Multimode Reader modelo Spark 10M | Tecan | 1607000294 | para quantificação de luminicência |
| TEMED | Bio-Rad | #1610801 | Para preparação de gel SDS |
| Tween-20 | Promega | H5151 | Para lavagem de membrana em western blotting |
| Analisador de viabilidade de células Vi XR | Beckman Coulter | AL15072 | Contador de células |
Referências
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Reimpressões e permissões
