Isolamento, caracterização e análise proteômica de vesículas extracelulares derivadas de plasma para descoberta de biomarcadores cardiovasculares

Summary

Este artigo descreve uma metodologia para o isolamento, caracterização e quantificação de vesículas extracelulares derivadas de plasma humano (EV) e apresenta um fluxo de trabalho para análise sem marcação do proteoma EV usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).

Abstract

As vesículas extracelulares (EV) são nanopartículas não replicáveis, derivadas de células, fechadas em bicamadas lipídicas. Atualmente, os EV ganham atenção na pesquisa cardiovascular devido ao seu papel na regulação da comunicação intercelular, potencialmente servindo como biomarcadores valiosos para doenças cardiovasculares. No entanto, o proteoma EV e seu potencial como biomarcador no diagnóstico cardiovascular permanecem pouco compreendidos. Este protocolo apresenta um método padronizado para o isolamento e quantificação de EV derivadas de plasma e a análise de sua carga proteica usando amostras de plasma de pacientes que se apresentam à Unidade de Dor Torácica de um grande hospital universitário. Após a flebotomia de rotina, os EV são isolados do plasma por ultracentrifugação diferencial. O enriquecimento de proteínas marcadoras específicas de EV em isolados de EV é visualizado por immunoblotting, e a distribuição de tamanho médio e as concentrações plasmáticas de EV são quantificadas por análise de rastreamento de nanopartículas. Finalmente, cromatografia líquida de ultra-desempenho-espectrometria de massa em tandem é empregada para análise livre de marcação do proteoma EV. Este protocolo, portanto, fornece uma abordagem abrangente para estudar e usar EV derivados de plasma como potenciais portadores de informações biológicas críticas, bem como para explorar seu potencial como novos biomarcadores.

Introduction

As vesículas extracelulares (VE), por nomenclatura não uniformemente definida, são nanopartículas envoltas por uma bicamada lipídica e liberadas por vários tipos celulares, sem a capacidade de se replicar¹. Este grupo diversificado inclui exossomos, uma subpopulação de EV de origem endossômica, tipicamente variando de aproximadamente 40 nm a 160 nm de diâmetro². Detectáveis em vários fluidos corporais³, os EVs facilitam a comunicação intercelular transferindo várias biomoléculas ativas, como proteínas, mRNA, microRNA e lipídios. Assim, as EV fornecem informações sobre sua célula de origem por meio de marcadores de superfície específicos da célula e biomoléculas, com suas propriedades fortemente influenciadas pela condição da célula-mãe e seu ambiente⁴. Essas características levaram a um interesse crescente no papel potencial das VE como biomarcadores, particularmente no contexto de doenças cardiovasculares.

Numerosos estudos in vitro e in vivo demonstraram que o estresse hipóxico miocárdico leva a um aumento da liberação de EV ^5,6,7. A pesquisa contemporânea sobre carga EV tem se concentrado amplamente no microRNA ligado a EV, que tem o potencial de servir como um biomarcador no diagnóstico de várias doenças cardiovasculares ^8,9,10. Em contraste, as evidências sobre o proteoma EV circulante permanecem relativamente escassas, com ainda menos estudos investigando EV plasmático em pacientes cardiovasculares. Em dois estudos abrangentes sobre VE derivada do plasma de pacientes que sofrem infarto do miocárdio, os autores identificaram um perfil específico de proteoma de VE induzido por isquemia com potencial relevância diagnóstica ^6,11.

O processamento metodológico da VE tem se mostrado historicamente desafiador e, atualmente, não há recomendação definitiva para a abordagem ideal para isolamento, caracterização e quantificação de VE Os métodos comumente usados para isolamento de EV incluem ultracentrifugação diferencial, centrifugação com gradiente de densidade e métodos de filtração, como cromatografia de exclusão de tamanho¹. De acordo com as diretrizes de consenso atuais, a caracterização de isolados de EV deve incluir evidências de pelo menos três marcadores típicos de proteínas de superfície de EV, como tetraspaninas ou anexinas, combinados com uma modalidade de imagem¹. Para examinar a carga EV no nível da proteína, métodos baseados em anticorpos, como Western blot ou ELISA, são utilizados com mais frequência.

Dados os desafios metodológicos associados ao isolamento e processamento de EV circulante, este protocolo apresenta um caminho abrangente desde o recrutamento de pacientes e coleta de amostras até o subsequente isolamento, caracterização e quantificação de EV de isolados de EV plasmáticos. Além disso, este estudo mostra um fluxo de trabalho para o isolamento imediato de EV derivado de plasma de pacientes que se apresentam ao departamento de emergência (Unidade de Dor Torácica) em um centro de atendimento terciário no sudoeste da Alemanha, seguido pela análise sem rótulo do proteoma EV plasmático específico da doença usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). O objetivo é facilitar uma análise de alto rendimento para identificar proteínas ligadas a EV diferencialmente enriquecidas em uma grande coorte de pacientes com diversas doenças cardiovasculares isquêmicas, congênitas ou (auto)imunes no diagnóstico inicial e durante a progressão e/ou resolução da doença. Essa abordagem de triagem proteômica busca identificar padrões de enriquecimento de proteínas específicas para EV associados a vias distintas de doenças, com o objetivo final de descobrir novos biomarcadores de proteínas ligados a EV para aprimorar o diagnóstico atual e o monitoramento terapêutico em doenças cardiovasculares.

Protocol

Para este protocolo, foi recrutada uma coorte exemplar de pacientes, composta por três pacientes controles saudáveis sem sinais de doença cardiovascular aparente ou subjacente e dois pacientes com infarto do miocárdio não elevado do segmento ST (IAMSSST). A aprovação prévia foi concedida pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Heidelberg (aprovação do IRB #S-351/2015), e o consentimento por escrito foi obtido de todos os pacientes antes do recrutamento. Os pacientes foram recrutados na Unidade de Dor Torácica do Departamento de Cardiologia do Hospital Universitário de Heidelberg com base na apresentação clínica inicial, histórico médico e resultados de testes diagnósticos.

Os critérios de inclusão para pacientes controles saudáveis incluíram apresentação clínica atípica ou inespecífica, níveis de biomarcadores cardíacos dentro dos limites normais, sem histórico de doença cardiovascular e achados normais em qualquer teste diagnóstico adicional. Os critérios de exclusão incluíram história de malignidade ou terapia citostática nos últimos cinco anos, hemodiálise, síndromes de hiperlipidemia familiar e qualquer história de doença cardiovascular. O IAMSSST foi diagnosticado de acordo com as diretrizes atuais¹², com estenose coronariana hemodinamicamente relevante confirmada por cineangiocoronariografia. Para cada paciente, até 36 mL de sangue foram coletados da veia antecubital para tubos de coleta suplementados com citrato por meio de flebotomia padrão¹³, e amostras de sangue foram imediatamente transportadas a 4 ° C para processamento posterior. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento EV usando centrifugação diferencial

NOTA: Um protocolo de centrifugação diferencial foi empregado para isolar EV de amostras de plasma humano. Dois ciclos de ultracentrifugação (UC) com força centrífuga crescente foram conduzidos para maximizar a pureza do pellet EV resultante.

1. Isolamento de plasma
   1. Comece a processar amostras de sangue total, resfriadas a 4 °C, dentro de 120 minutos após a coleta para garantir a integridade do EV plasmático. Use tubos de coleta de sangue suplementados com citrato (citrato 0,106 mol / L) para evitar a coagulação.
   2. Dilua 9 mL de sangue total citrato 1:1 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada para reduzir a viscosidade. Adicione 5 mL de meio gradiente de densidade (1,077 g/mL) para separação durante a centrifugação.
   3. Centrifugar a 600 × g durante 25-30 min a 4 °C. Pipetar cuidadosamente a fracção de plasma do topo de cada coluna para tubos de centrifugação especializados. Prossiga para as próximas etapas ou congele a -80 °C.
2. Remoção de detritos celulares e corpos apoptóticos
   1. Centrifugar o plasma a 20.000 × g durante 15 min a 4 °C utilizando uma ultracentrífuga com rotor de ângulo fixo, sem travar. Uma pelota visível de detritos celulares e corpos apoptóticos deve se formar no fundo do tubo.
3. Isolamento EV
   1. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Ultracentrífuga a 100.000 × g por 2 h a 4 °C, sem frenagem, para isolar EV, que formará um pellet visível na parede do tubo.
   2. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta eletrónica, deixando cerca de 1 ml de plasma empobrecido em EV. Mude para uma pipeta de 1000 μL para o plasma restante, pipetando lentamente para evitar perturbar o pellet EV. Incline o tubo gradualmente durante a pipetagem para garantir que nenhum plasma permaneça no tubo.
4. Preparação para análise a jusante
   1. Ressuspenda o pellet EV isolado de acordo com os requisitos de análise a jusante: para rastreamento de nanopartículas, ressuspenda o pellet EV de 9 mL de sangue total em 200 μL de PBS; para LC-MS/MS, ressuspender EV isolado de 36 mL de sangue total em 50 μL de tampão RIPA 1x com inibidor de protease/fosfatase a 1%
   2. Transfira o pellet EV ressuspenso para um tubo de 1,5-2 mL. Conservar a -80 °C até uma análise mais aprofundada ou proceder conforme necessário.

2. Análise de rastreamento de nanopartículas

NOTA: A quantificação da distribuição média do tamanho EV em amostras de plasma humano foi realizada usando a Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA), um método de detecção baseado em laser que analisa o movimento browniano das nanopartículas.

1. Diluições de trabalho para NTA
   1. Dilua a solução estoque EV (pellet EV ressuspenso em 200 μL PBS) com PBS gelado nas proporções de 1:10, 1:50, 1:100 e 1:200. Crie várias diluições de trabalho para determinar a diluição mais adequada para atingir uma contagem final de 10-100 nanopartículas por quadro durante o rastreamento de nanopartículas.
2. Executando o NTA
   1. Ligue o instrumento NTA e inicie o software aplicável no computador conectado. Coloque a câmara dentro do caixão de laser e clique em Iniciar câmera para ativá-la.
   2. Retire 1 ml de PBS para uma seringa. Conecte a seringa no tubo frontal e lave completamente o sistema de tubulação, garantindo que nenhum ar permaneça na câmara. Monitore a câmera para detectar bolhas de ar ou partículas contaminantes.
   3. Retirar a diluição de trabalho EV preparada numa seringa de 1 ml e injectá-la na câmara.
   4. Ajuste o Ganho de tela para corresponder ao brilho do monitor nas guias Capturar e Processar. Modifique o nível da câmera para diferenciar as nanopartículas claramente na tela.
   5. Defina um Limite de detecção adequado na guia Processo para ajustar a sensibilidade para diferenciar partículas do ruído de fundo. Mantenha esse valor constante para todas as medições no mesmo experimento.
   6. Foque a câmera usando a roda em cada lado do instrumento até que as nanopartículas apareçam nítidas na tela.
   7. Defina uma temperatura constante (idealmente 22 °C) para todas as medições nas configurações de hardware , pois o movimento browniano depende da temperatura.
   8. Clique no botão Executar para iniciar a medição. Insira o ID da amostra e o solvente na janela pop-up.
   9. Grave um mínimo de três vídeos de 30 s para cada execução de amostra. Avance a amostra entre as medições para capturar uma amostra representativa da solução de nanopartículas. Se uma bomba de seringa estiver disponível, ajuste-a a uma velocidade constante e registre continuamente.
   10. Após a gravação, o software calcula automaticamente a concentração e a distribuição de tamanho das nanopartículas. Clique em Alterar para inserir o fator de diluição usado para a amostra e, em seguida, salve os resultados clicando em Exportar.
3. Análise de dados
   1. Analise os resultados usando os arquivos de saída em um programa de software estatístico.

Análise sem marcação do proteoma EV usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS)

NOTA: A análise do proteoma EV sem marcação foi conduzida usando a separação inicial de proteínas por meio de eletroforese em gel de proteínas EV após lise de membrana. Após a digestão da proteína em gel com tripsina, os peptídeos foram analisados usando LC-MS/MS, com espectros individuais comparados com um banco de dados de proteoma humano. Notavelmente, se uma análise não direcionada de lisados EV for desejada, recomenda-se a proteômica shotgun sem seleção prévia de uma faixa de peso molecular específica, tornando desnecessárias as etapas 3.1.1-3.1.7 deste protocolo.

1. Digestão de tripsina em gel
   1. Prepare uma solução de EV ressuspensa em 1x tampão RIPA adicionando tampão de carga Laemmli de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Ferva as amostras a 95 °C durante 5 min.
   2. Carregue as amostras de EV, complementadas com tampão de carga, juntamente com uma escada de proteína em géis Bis-Tris a 4% -12% para eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) ¹⁴. Pinte o gel com Coomassie Blue por 1-4 h para visualizar as bandas de proteína. Remova a coloração do gel com água incubando durante a noite.
   3. Extirpar as bandas coradas com Coomassie de regiões de gel contendo proteínas de interesse usando uma lâmina de bisturi.
   4. Lave as peças de gel com 60 μL de tampão de bicarbonato de trietilamônio 1:1 (v/v) 50 mM (TEAB) e acetonitrila (ACN), pH 8,5, por 10 min. Encolha os pedaços de gel três vezes por 10 min cada em 60 μL de ACN. Lave novamente com 60 μL 50 mM TEAB, pH 8,5.
   5. Reduza as proteínas com 10 mM de ditiotreitol (DTT) em 100 mM de TEAB a 57 °C por 30 min e desidrate os pedaços de gel.
   6. Alquilar as proteínas com 10 mM de iodoacetamida (IAA) em 100 mM de TEAB a 25 °C durante 20 min no escuro.
   7. Lave as peças de gel com 60 μL de TEAB 100 mM e encolha-as duas vezes por 10 min cada em 60 μL de ACN.
   8. Adicionar 50 mM de solução de tripsina TEAB, concentrada em conformidade, às peças de gel seco. Incubar durante 4 h a 37 °C. Extinguir a reação adicionando 20 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%.
   9. Extraia os peptídeos resultantes incubando com 30 μL de 1:1 (v/v) 0,1% de TFA e ACN por 30 min. Desidrate os géis com 20 μL de ACN por 20 min e, em seguida, lave novamente com 30 μL de TEAB 100 mM por 20 min.
   10. Encolha o gel duas vezes com 20 μL de ACN por 20 min cada.
   11. Concentrar o sobrenadante recolhido de cada etapa de extracção numa centrifugadora a vácuo e dissolver a amostra em 15 μL de TFA a 0,1%.
2. Análise LC-MS/MS
   1. Realize a análise de nanofluxo LC-MS/MS usando um espectrômetro de massa de cromatografia líquida de alta resolução acoplado a um analisador de armadilha de íons eletrostáticos.
   2. Use 0,1% de ácido fórmico (FA) / 1% de ACN como solvente A e 0,1% de FA / 89,9% de ACN como solvente B.
   3. Separe os peptídeos em um gradiente linear de 25 minutos: comece com 3% de solvente B, aumente B para 23% em 21 minutos, depois para 38% em 4 minutos e prossiga com uma lavagem a 95% B.
   4. Operar o espectrômetro de massa no modo de aquisição dependente de dados, alternando automaticamente entre MS e MS2. Adquira espectros MS (m / z 400-1600) com uma resolução de 60.000 em m / z 400, gerando espectros MS2 para até 15 precursores usando uma energia de colisão normalizada de 27 e uma largura de isolamento de 1,4 m / z.
3. Pesquisa no banco de dados de proteínas
   1. Pesquise os espectros MS/MS no banco de dados de proteínas Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, junho de 2020) e um banco de dados de contaminantes personalizado (parte do MaxQuant, MPI Martinsried^15,16) usando o Proteome Discoverer 2.5 com Sequest HT.
   2. Defina as configurações do programa da seguinte forma: defina a tolerância de massa do íon do fragmento para 0,02 Da e a tolerância da massa do íon pai para 5 ppm. Especifique a tripsina como a enzima usada para a digestão e defina a carbamidometil como uma modificação fixa para a cisteína, com oxidação (metionina) e desamidação (asparagina, glutamina) como modificações variáveis. Inclua acetilação, perda de metionina e sua combinação como modificações variáveis do terminal da proteína.
   3. Quantifique os peptídeos usando o modo quantificador de íons precursores, empregando o método Top N Average (n = 3) para o cálculo da abundância de proteínas¹⁷.

Results

As EV foram isoladas de amostras de plasma (n = 3) de pacientes sem doença cardiovascular evidente, bem como de pacientes com infarto do miocárdio sem supradesnivelamento do segmento ST (IAMSSST; n = 2), usando o protocolo de ultracentrifugação diferencial estabelecido. A separação adequada do EV plasmático foi confirmada por immunoblotting das proteínas enriquecidas com EV TSG-101, anexina 5 (Anx5) e CD9 em isolados EV em comparação com o plasma depletado de EV dos mesmos pacientes (Figura 1A

Discussion

Este protocolo fornece uma metodologia do mundo real, passo a passo, pronta para uso para a separação e caracterização de EV plasmática, bem como uma introdução a uma análise de proteoma não rotulada adequada para integração na prática clínica de rotina. Uma descrição detalhada e a adesão estrita a uma metodologia unificada para isolamento de EV a partir de amostras de plasma são importantes para garantir a reprodutibilidade dos resultados obtidos. A literatura atual indica que as condiç...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample bufffer	Bio-rad	1610747
10x RIPA-Buffer	Abcam	ab156034
26.3 mL Frasco de policarbonato com conjunto de tampa para ultracentrifugação	Centrífuga de bancada Beckman Coulter	355654
5810R	Eppendorf	5811000015
Acetonitrila (ACN)	Biosolve	0001204101BS
Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43816-10ML
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Ácido fórmico 99% ULC / MS 100	Biosolve	0006914143BS
Histopaque - 1077	Sigma-Aldrich	10771
Iodoacetamida (IAA)	Sigma-Aldrich	I6125-5G
Espectrômetro de Massa Orbitrap Q Exactive HF	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS buffer de corrida	Thermo Fisher	B0001
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	Software NS300
Nanosight NTA 3.2	Malvern Panalytical
NuPAGE 4  bis 12 %, géis de proteína Bis-Tris	Invitrogen	NP0323
Optima XPN-80 ultracentrífuga de chão	Beckman Coulter	521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26619
Protease/Fosfatase Inhibitor Cocktail (100X)	Cell Signaling Technology	5872S
Marcador de proteína	Thermo Fisher	26616
Proteome Discoverer 2.5	Thermo Fisher
Q Exactive Plus Espectrômetro de Massa Híbrido Quadrupole-Orbitrap	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Coomasssie de mancha rápida	Serva	35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µ m 1 g	Dr. Maisch	r119.aq.0001
SDS-PAGE gel comercial	Thermo Fisher	NW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%	Sarstedt	02.1067.001
Concentrador de velocidade a vácuo	Savant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, junho de 2020) banco de dados de proteínas	UniProt	https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Tampão de bicarbonato de trietilamônio (TEAB)	Sigma-Aldrich	T7408
Ácido trifluoroacético (TFA) para HPLC >99%, 100 mL	Sigma-Aldrich	302031-100ML
Tripsina MS-Grade	Thermo Fisher	90058
Tipo 50.2 Ti Rotor de ângulo fixo	Beckman Coulter	337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Water	Biosolve	0023214102BS