Este protocolo é projetado para investigar a extensão dos danos ao DNA que ocorrem durante a replicação do DNA. Em condições neutras, a indução de quebras de DNA pode ser prontamente avaliada em um curto período de tempo. Além disso, o protocolo é adaptável a outros tipos de células e vários reagentes de estresse de replicação.
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Artigo de método
Detecção de quebras de DNA em células humanas em divisão por ensaio de cometa neutro
Neste artigo
Resumo
Resumo
A replicação do DNA é constantemente desafiada por uma ampla variedade de estressores endógenos e exógenos que podem danificar o DNA. Tais lesões encontradas durante a duplicação do genoma podem paralisar os replissomos e converter garfos de replicação em quebras de fita dupla. Se não forem reparadas, essas quebras tóxicas de DNA podem desencadear rearranjos cromossômicos, levando a uma maior instabilidade do genoma e a uma maior probabilidade de transformação celular. Além disso, as células cancerígenas exibem estresse de replicação persistente, tornando o direcionamento das vulnerabilidades do garfo de replicação em células tumorais uma estratégia atraente para a quimioterapia. Uma técnica altamente versátil e poderosa para estudar quebras de DNA durante a replicação é o ensaio do cometa. Esta técnica de eletroforese em gel detecta de forma confiável a indução e o reparo de quebras de DNA no nível de uma única célula. Aqui, é descrito um protocolo que permite aos investigadores medir a extensão do dano ao DNA em células humanas em divisão mitótica usando agentes de travamento de garfo em vários tipos de células. Acoplar isso com a pontuação automatizada do cometa facilita a análise rápida e aumenta a confiabilidade no estudo da indução de quebras de DNA.
Introdução
O ensaio cometa é um método de eletroforese em gel usado para detectar quebras de DNA no nível de uma única célula. Ele se baseia no princípio de que as quebras de DNA abertas migram sob condições eletroforéticas, enquanto o DNA intacto permanece em grande parte estático. O DNA quebrado migra porque as quebras resultam no relaxamento do DNA superenrolado, causando sua realocação espacial gradual em direção ao ânodo na câmara eletroforética, o que resulta em uma aparência semelhante a um cometa observada por imunofluorescência 1,2. A extensão do dano ao DNA é então medida quantificando a quantidade de DNA quebr....
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Protocolo
Este protocolo (Figura 1) utiliza principalmente linhagens de células cancerígenas U2OS aderentes, mas é adaptável a uma ampla variedade de células aderentes e em suspensão cultivadas em cultura de tecidos. As soluções e tampões usados neste estudo estão detalhados na Tabela 1. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de materiais
- Antes do dia do experimento, coloque a garrafa fornecida com agarose de baixo ponto de fusão (1% de agarose de baixo ponto de fusão em PBS) em banho-maria por 5 a 10 minutos para garanti....
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Resultados
Análise da indução de quebra por reagentes de tensão de replicação
As células U2OS foram tratadas com DMSO, 4 de mM de hidroxiureia (HU) ou 100 nM de CPT por 4 h e analisadas quanto ao acúmulo de quebra pelo ensaio NC (Figura 6A). Enquanto o CPT induz quebras durante a fase S, bloqueando a topoisomerase-113, a depleção induzida por HU de pools de nucleotídeos interrompe os garfos de replicação que são progressivamente convertidos em DSBs
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Discussão
Este protocolo descreve um ensaio NC para avaliar quebras de DNA em células humanas submetidas a replicação ativa. O protocolo é relativamente simples de executar e os pesquisadores podem adaptá-lo prontamente a condições de pH alto para análises alcalinas8. Ele inclui duas etapas críticas, conforme descrito nas etapas 3.7 e 4.5. Na etapa 3.7, é essencial espalhar a agarose derretida com células uniformemente pelo poço para evitar que os cometas se sobreponham durante a análise. Certifique-se de q.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório Dungrawala por suas contribuições e comentários. Este trabalho foi financiado por R35GM137800 de bolsas do NIH para HD.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | |
| Camptotecina | Selleckchem | S1288 | |
| Cometa LMAgarose (LMA) | R& D systems | 4250-050-02 | |
| Sistema de eletroforese CometAssay II | R& D systems | 4250-050-ES | Inclui tanque de eletroforese, tampa de segurança, cabos, bandejas deslizantes de 2/20 poços e sobreposição de bandeja deslizante |
| Software | CometScore TriTek | de código aberto | |
| CometSlide | R& D systems | 4250-050-03 | |
| DMEM, alta glicose | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | FisherSci | D128-4 | |
| Soro fetal bovino Keyence | BZ-X810 | ||
| - Premium | Bio-Techne | S11150 | |
| Gibco Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | Gibco | 25300054 | |
| GraphPad Prism 10.0 | GraphPad | ||
| HEK293T células | ATCC | CRL-11268 | |
| Células hTERT-RPE-1 | ATCC | CRL-4000 | |
| Hydroxyurea | Millipore Sigma | H8627 | |
| Inibidor de PARP Olaparib | Selleckchem | S8096 | |
| PowerPac | FisherSci | FB300Q | |
| Placa de Cultura de Tecidos Estéril Tratada com Superfície | FisherSci | FB012927 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x) | FisherSci | S7567 | |
| Células U2OS | ATCC | HTB-96 | |
| UVP Incubadora de hibridização HB-1000 | FisherSci | UVP95003001 |
Referências
- Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E.
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Reimpressões e permissões
