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Artigo de método

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

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DOI:

10.3791/67125

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13 de dezembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Resumo

Organoides vasculares derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) recapitulam a diversidade do tipo de célula e a arquitetura complexa das redes vasculares humanas. Este modelo tridimensional (3D) possui um potencial substancial para modelagem de patologia vascular e triagem de drogas in vitro . Apesar dos avanços recentes, um desafio técnico importante permanece na geração reprodutível de organoides com qualidade consistente, o que é crucial para ensaios e aplicações a jusante. Aqui, é apresentado um protocolo modificado que melhora a homogeneidade e a reprodutibilidade da geração de organoides vasculares. O protocolo modificado incorpora o uso de micropoços e o coquetel CEPT (croman 1, emricasan, poliaminas e o inibidor integrado de resposta ao estresse, trans-ISRIB) para melhorar a formação do corpo embrióide e a sobrevivência celular. Organoides vasculares maduros e diferenciados gerados usando este protocolo são caracterizados por microscopia de imunofluorescência 3D de montagem total para analisar sua morfologia e vasculatura complexa. Este protocolo permite a produção de organoides vasculares de alta qualidade de maneira escalável, potencialmente facilitando seu uso em aplicações de modelagem de doenças e triagem de medicamentos.

Introdução

Modelos microfisiológicos in vitro, incluindo sistemas organoides e de tecido em chip, surgiram na última década 1,2,3. Esses sistemas tridimensionais (3D) derivados de células humanas abordam as limitações da cultura de células bidimensionais (2D) convencionais e modelos animais, como a falta de muitos componentes no microambiente fisiológico e diferenças genéticas entre as espécies, respectivamente. Eles fornecem mais informações fisiológicas e são mais adequados para modelagem de doenças e triagem de medicamentos do que os modelos convencionais. Entre os modelos microfisiológicos, organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) provaram recapitular as características arquitetônicas dos tecidos humanos nativos de forma eficaz e foram desenvolvidos para imitar diferentes órgãos humanos, incluindo o cérebro 4,5, rim6, fígado 7,8 e retina9. Aqui, nos concentramos particularmente na geração de organoides vasculares a partir de hiPSCs e delineamos um protocolo simplificado que visa minimizar as variações entre diferentes amostras e lotes de organoides, melhorando assim a reprodutibilidade geral.

A vasculatura desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase fisiológica em todos os órgãos humanos. A formação da vasculatura envolve os processos de vasculogênese e angiogênese, orquestrados por meio das interações entre células endoteliais e murais (por exemplo, pericitos e células musculares lisas vasculares) e influenciados por vários estímulos10. Penninger, Wimmer e colegas desenvolveram o primeiro método de geração de organoides vasculares11,12 que imita esses dois processos. Com os organoides gerados a partir desse método, seu grupo12 e nós13,14 demonstraram o potencial dos organoides vasculares para modelar disfunções vasculares em doenças. Por exemplo, em nossos trabalhos recentes 13,14, fenótipos distintos foram observados, como brotamento de vasos e variações na composição de células murais, entre organoides vasculares que imitam doenças e suas contrapartes do tipo selvagem. Esses exemplos destacam que o modelo organoide vascular pode servir como uma plataforma para triagem de drogas, imitando disfunções vasculares relacionadas à doença.

Construído com base nos trabalhos iniciais de geração de organoides vasculares11,12, é apresentado um protocolo revisado que inclui o uso de micropoços para facilitar a formação de corpos embrióides homogêneos (EB), um fator crítico para minimizar as variações frequentemente observadas dentro do mesmo lote de geração de organoides. Além disso, o coquetel CEPT, uma combinação de cromano 1, emricasan, poliaminas e o inibidor integrado da resposta ao estresse (trans-ISRIB)15, é empregado para melhorar a viabilidade de hiPSCs e células diferenciadas durante o processo de formação de EB. Essa modificação é principalmente para reduzir as variações entre diferentes amostras e lotes de organoides. Organoides vasculares uniformes podem ser produzidos com este protocolo de aproximadamente duas semanas, onde a vasculogênese é induzida para ajudar o endotélio a se organizar em redes tubulares primitivas no Dia 1, seguida pela indução da angiogênese no Dia 5 para desenvolver redes vasculares complexas em organoides. No dia 12-15, os organoides gerados devem mostrar redes vasculares maduras compostas por endotélio e células murais.

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Protocolo

A Figura 1 apresenta uma visão geral das etapas envolvidas neste protocolo. Informações detalhadas sobre os reagentes e materiais utilizados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais. Recomenda-se que todos os meios sejam pré-aquecidos a 37 °C antes do uso, salvo indicação em contrário. Todos os materiais e suprimentos de cultura de células devem ser autoclavados ou estéreis, e o manuseio das células deve ser feito em um gabinete de biossegurança. Além disso, o valor do pH da mistura de colágeno I deve ser cuidadosamente ajustado para pH 7,3 para evitar possíveis problemas de solidificação.

1. Manutenção humana do iPSC

  1. Descongele o extrato da matriz da membrana basal no gelo, agite suavemente o frasco para misturar a solução e faça alíquotas de 0,5 mL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta P1000 e pontas pré-refrigeradas. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 1 ano.
  2. Descongelar uma alíquota de extracto de matriz (0,5 ml) no gelo. Misture com 49,5 mL de meio DMEM/F12 pré-resfriado em um tubo de 50 mL. Distribua a mistura para cada poço (1,5 mL / poço) em placas de 6 poços e, em seguida, agite suavemente a placa para garantir que a solução líquida cubra todo o poço. Sele as placas com filme de parafina e guarde-as a 4 °C por até 1 semana.
  3. Prepare o meio de expansão hiPSC conforme descrito na Tabela 1. Fazer alíquotas do meio completo (40 ml/tubo) e conservar a -20 °C até 1 ano.
  4. Colocar uma placa pré-revestida na incubadora a 37 °C durante 1 h antes da cultura hiPSC.
  5. Pré-aqueça o meio de expansão hiPSC (40 ml) a 37 °C e prepare o meio de semeadura hiPSC conforme descrito na Tabela 2.
  6. Transfira a placa revestida da incubadora a 37 °C para o gabinete de biossegurança. Substitua o meio na placa revestida por meio de semeadura hiPSC (1 mL / poço).
  7. Descongele um frasco criopreservado de hiPSCs do tanque criogênico em banho-maria a 37 °C por 1 min.
  8. Transfira as células para um tubo de 15 mL e, em seguida, adicione 5 mL de meio DMEM / F12, seguido de centrifugação a 100 x g por 3 min em temperatura ambiente para coletar as células.
  9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 1,5 ml de meio de semeadura hiPSC. Ressuspenda suavemente as células no tubo de 15 mL.
  10. Alíquota de 10 μl da suspensão celular e misturar com 10 μl de solução de azul de tripano. Transferir a mistura de 10 μL para a lâmina do hemacitómetro e cobri-la com uma lamínula.
  11. Monte a corrediça no suporte e insira-a no contador de células automatizado. Aguarde até que o instrumento encontre o foco ou ajuste manualmente o foco pressionando o botão de foco +/- na tela. Depois, use a configuração padrão e pressione o botão Capturar . Utilizar a leitura da densidade celular VIVA como a concentração da suspensão hiPSC preparada a partir do passo 1.9.
  12. Semeie 2 × 105 células em cada poço e certifique-se de que as células sejam distribuídas uniformemente no poço.
  13. Cultive as células a 37 ° C com 5% de CO2 e substitua o meio por meio de expansão hiPSC (1,5 mL / poço) após 24 h.
  14. Troque o meio diariamente até que as células atinjam uma confluência de 80%. Verifique a morfologia celular e o tamanho da colônia rotineiramente para garantir que não haja diferenciação espontânea. Descarte a cultura e reinicie com um novo lote de hiPSCs se for observada diferenciação espontânea extensa (>5%).

2. Formação EB (Dia 0)

  1. No Dia 0, prepare e pré-aqueça o meio DMEM/F12, o meio de semeadura hiPSC e a solução de descolamento celular a 37 °C por 20-30 min.
  2. Remova o meio de cultura da placa de 6 poços e adicione a solução de descolamento de células pré-aquecida (1,5 mL / poço). Incubar a placa a 37 °C durante 5-7 min.
  3. Transfira a placa para o gabinete de biossegurança, bata na placa para separar as colônias de hiPSC e quebre os agregados.
  4. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL. Adicione 4,5 mL de meio DMEM/F12. Pipete suavemente a mistura para cima e para baixo usando uma pipeta sorológica de 10 mL cinco vezes para dissociar as células em uma suspensão unicelular. Evite gerar bolhas.
  5. Centrifugue a 100 x g por 3 min em temperatura ambiente para coletar as células.
  6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células com 1 mL de meio de semeadura hiPSC usando uma pipeta P1000.
  7. Misture 10 μL de suspensão celular com 10 μL de solução de azul de tripano para contagem de células. Transferir 10 μL da mistura para a lâmina do hemacitómetro e cobri-la com uma lamínula. Monte a corrediça no suporte e insira-a no contador de células automatizado. Depois que o instrumento encontrar o foco, pressione o botão Capturar e use a leitura da densidade celular LIVE para determinar a concentração da suspensão hiPSC.
  8. Semeie as células na placa de micropoços de fundo redondo de fixação ultrabaixa com uma densidade de 2,7 × 105 células/poço para produzir 500-1.000 células por EB.
  9. Adicione 2 mL de meio de semeadura hiPSC a cada poço e misture a solução suavemente para distribuir as células uniformemente.
  10. Cultivar as células a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 h.

3. Diferenciação vascular (dia 1 - 5)

  1. No Dia 1, prepare o meio de indução do mesoderma (MIM) conforme descrito na Tabela 3 e na Tabela 4 e pré-aqueça a 37 ° C por 20 min. O meio MIM deve ser feito na hora.
  2. Use uma pipeta P200 para aspirar cuidadosamente o meio da placa de micropoços sem perturbar os EBs na parte inferior.
  3. Adicione 2,5 mL de MIM lentamente usando uma pipeta P200. Cultive os EBs em MIM a 37 °C com 5% de CO2 por 2 dias.
  4. No Dia 3, substitua suavemente o meio por 2,5 mL pré-aquecidos e recém-produzidos do meio de diferenciação vascular 1 (VDM1, Tabela 5) sem perturbar os EBs na parte inferior do micropoço. Cultive as células a 37 °C com 5% de CO2 por mais 2 dias.

4. Incorporação de hidrogel (dia 5)

  1. Prepare a mistura de colágeno I conforme descrito na Tabela 6. Coloque um tubo de 50 mL no gelo e adicione a solução de colágeno I, H2O, 10× meio DMEM/F12, bicarbonato de sódio e HEPES posteriormente. Misture bem agitando o tubo suavemente. Adicione a solução de NaOH 1 M gota a gota enquanto agita a solução misturada para ajustar o valor do pH para 7.3 e verifique o valor do pH da mistura com um medidor de pH.
    NOTA: Todas as soluções devem ser pré-resfriadas em gelo antes do uso. Realize o procedimento no gelo no gabinete de biossegurança o tempo todo. A adição da solução de NaOH é crítica, e é necessária uma dispersão rápida para fazer uma solução homogênea para evitar a cura local do colágeno I. O volume de NaOH pode variar de acordo com o número de lote da solução de colágeno I usada. Não pipete vigorosamente para misturar, pois a tensão de cisalhamento pode causar pré-cura indesejada.
  2. Prepare a mistura de matriz de membrana basal de colágeno I conforme descrito na Tabela 7. Adicione 1,25 mL de matriz de membrana basal à mistura de 5 mL de colágeno I preparada a partir da etapa 4.1. Misture a solução suavemente agitando o tubo.
  3. Coloque um prato de 12 poços no gelo por 2 min.
  4. Adicione a mistura de matriz de membrana basal de colágeno I lentamente à placa de 12 poços (1,5 mL / poço) usando as pontas de furo largo. Certifique-se de que a mistura seja distribuída uniformemente.
  5. Coloque a placa na incubadora a 37 °C por 2 h para solidificar a primeira camada de hidrogel.
  6. Mantenha a mistura restante da matriz da membrana basal de colágeno I no gelo para uso posterior.
  7. Transfira ~ 60 agregados de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e resfrie o tubo em gelo por 5 min. Remova cuidadosamente o meio com uma ponta de pipeta P200.
    NOTA: Inicie esta etapa 1.5h após a Etapa 4.5.
  8. Gota a gota, adicione 1,5 mL de mistura de membrana basal de colágeno I aos agregados e misture-os suavemente usando pontas de pipeta P200 de diâmetro largo.
  9. Transfira a placa com a primeira camada de hidrogel da incubadora (etapa 4.5) para o gabinete de biossegurança.
  10. Adicione 1,5 mL da suspensão agregada à camada curada. Agite suavemente a placa para distribuir os agregados uniformemente. Evite gerar bolhas.
  11. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO2 durante mais 2 h.
  12. Preparar o meio de diferenciação vascular 2 (VDM2; Tabela 8) e pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C por 20 min antes do uso.
  13. Adicione 2 mL de VDM2 a cada poço e cultive as células a 37 ° C com 5% de CO2.
  14. Troque o meio a cada 3 dias com VDM2 pré-aquecido e recém-feito.
    NOTA: (Opcional) Os organoides vasculares podem ser liberados da mistura de gel removendo o gel com uma agulha de seringa. Os organoides vasculares recuperados do gel podem ser mantidos individualmente em uma placa de 96 poços com VDM2 (200 μL/poço). Troque o meio a cada 2-3 dias.

5. 3D Ensaio de imunofluorescência

  1. Os organoides vasculares devem amadurecer aproximadamente no dia 13. Para organoides embutidos no hidrogel, aspire o meio cuidadosamente e lave com 2 mL de PBS três vezes (10 min de cada vez). Para organoides recuperados do gel (após a Etapa 4.14), colete de 6 a 10 organoides em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, aspire o meio e lave com 2 mL de PBS três vezes (10 min cada).
  2. Adicione 2 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% à amostra e incube a 4 °C durante a noite com selagem por filme de parafina.
  3. Remova a solução de PFA e lave a amostra com 2 mL de PBS quatro vezes (15 min de cada vez).
  4. Adicione 2 mL de tampão de bloqueio (Tabela 9) e incube em temperatura ambiente por 2 h.
  5. Remova o tampão de bloqueio e adicione 1,5 mL de anticorpos primários (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre anticorpos; os anticorpos devem ser diluídos no tampão de bloqueio). Incubar a amostra com anticorpos primários a 4 °C durante 2 dias com agitação suave.
    NOTA: Recomenda-se que o anticorpo primário (CD31, PDGFRβ e ERG1) seja diluído no tampão de bloqueio na proporção de 1:400 (consulte a Tabela de Materiais para obter mais informações).
  6. Remova a solução primária de anticorpos e lave com 2 mL de PBST por 1 h seis vezes.
  7. Adicione 2 mL de anticorpos secundários (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre anticorpos; os anticorpos devem ser diluídos em PBST) à amostra. Envolva a placa com papel alumínio e incube a 4 °C durante 2 dias agitando suavemente.
    NOTA: Recomenda-se que o anticorpo secundário seja diluído em PBST na proporção de 1:1000 (consulte a Tabela de Materiais para obter mais informações). Mantenha a placa longe da luz durante a incubação e lave a partir desta etapa depois.
  8. Remova a solução de anticorpo secundário e lave com 2 mL de TBST seis vezes (1 h de cada vez). Adicione DAPI (1 μg/mL) no tampão de lavagem usado para a última etapa de lavagem se for necessária coloração dos núcleos.
  9. Para esses organoides embebidos em gel, corte o gel em 4 pedaços e transfira-os cuidadosamente para tubos de microcentrífuga de 2 mL com uma espátula. Para os organoides recuperados, remova o tampão de lavagem.
  10. Use lenços para absorver a solução restante sem tocar no gel ou nos organoides.
  11. Adicione 2 mL de reagente de limpeza de tecido solúvel em água (Índice de Refração = 1,49) a cada tubo. Incubar as amostras com reagente de limpeza à temperatura ambiente no escuro até que os organoides fiquem claros (geralmente durante a noite). Não agite as amostras.
  12. Transfira os organoides com o reagente de limpeza cuidadosamente para o centro do prato com fundo de vidro usando uma espátula.
  13. Cubra os organoides ou a peça de gel com uma lamínula de 24 mm × 24 mm.
  14. Empurre a lamínula suavemente para baixo até que fique plana e coloque as amostras no fundo de vidro.
  15. Remova o reagente de limpeza redundante no prato e sele a lamínula com esmalte.
  16. Para imagens 3D, use um microscópio confocal com objetiva de 10×. Use a varredura de bloco e a varredura de pilha Z para obter imagens de organoides de montagem inteira.

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Resultados

A Figura 1A apresenta o esquema deste protocolo, incluindo os principais componentes usados em cada estágio. A diferenciação iniciou-se com a formação de EB, seguida pela indução do mesoderma e especificação da linhagem vascular (Figura 1B-D). Os agregados cresceram maiores e menos esféricos ao longo do tempo. Os organoides começaram a mostrar arestas no dia 5. Depois de incorporadas na mistura de matriz de membrana basal de col...

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Discussão

O protocolo descrito inclui duas modificações principais para a geração homogênea e reprodutível de organoides vasculares de alta qualidade. A primeira modificação é o uso de uma placa de micropoços para permitir um melhor controle da uniformidade do EB. Como ponto de partida da diferenciação vascular, o tamanho dos EBs é crítico, pois regula o destino das células-tronco e a eficácia da diferenciação em diferentes linhagens. Variações no tamanho do EB geralmente levam a organoides hetero...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer o apoio técnico do Recurso Compartilhado de Microscopia Confocal e Especializada do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center da Universidade de Columbia, financiado em parte pelo NIH Center Grant (P30CA013696). Este trabalho é apoiado pelo NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). A Figura 1A foi criada usando BioRender.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-Mercaptoetanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152reconstitui com 0,25 mL de glicerol a 50%,  armazene a -20 ° C por até 1 ano, razão de diluição para uso: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147reconstitui com 0,25 mL de glicerol a 50%, armazene a -20° C por até 1 ano, taxa de diluição para uso: suplemento de B27 1:1000
menos vitamina A (50x)Gibco12587010descongelar a 4 ° C, alíquota e armazene a -20 & C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento
BMP4ProSpecCYT-081reconstituir com ddH2O estéril a uma concentração de 100 ng/µ L, alíquota e armazene a -20 ° Anticorpo C
CD31abcamab28364taxa de diluição: 1:400
CentrífugaEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10faça a solução estoque a 12 mM com DMSO e armazene a -20 ° C por até 1 ano.
Chroman 1Tocris7163/10faz a solução estoque em 100 µ M com DMSO e armazene a -20 ° C por até 1 ano.
Colágeno I Corning40236
NikonAXRMP/Ti2
Placas de Elplasia Corning ContadorCorning4441
Countess II FLThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAXGibco10565018
DMEM/F-12, póGibco12500062faça 10x solução estoque com ddH2O biograu e esterilize-a com um 0,2 µ m. Armazene a 4 ° C.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGfazer a solução estoque a 1 mM com DMSO e armazenar a -20 &graus; C por até 1 ano.
anticorpo ERGCell Singali Technology97249: 1:400
Soro Fetal Bovino - PremiumAtlanta BiologicalsS11150descongela a 4 ° C  e alíquota, loja em  -20 & graus; C por até cinco anos, ou armazene a 4 & C por até um mês
FGF2ProSpecCYT557reconstituir com ddH2O estéril a uma concentração de 100 ng/µ L, alíquota e armazene a -20 ° C
Fluorodish Cell Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099reconstituir com DMSO a uma concentração de 12 mM, alíquota e armazenar a -20 ° C
Gentamicina (50 mg/mL)SuplementoGibco 15710064
GlutaMAX (100x)Gibco35050061
Heparina, 100 kUMilliporeSigma375095100KUreconstituir com ddH2O estéril na concentração de 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
IncubadoraThermo Scientific13998123
Substituição de Soro KnockoutGibco10828028descongelar a 4 ° C, alíquota e loja em -20° C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230descongelar a 4 ° C, alíquota e loja a -80° C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (NEAA, 100x)Gibco11140050
Molecular Biology Grade WaterCorning46000CV
mTeSR plus kitSTEMCELL Technologies1001130descongelar a 4 ° C, alíquota e loja em -20° C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento
suplemento N2 (100x)Gibco17502048descongelar a 4 ° C, alíquota e loja em -20° C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento
Solução de NaOH (1 M)Cytiva  HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121reconstituir com 10 mL de ddH2O estéril, armazenar a 4 ° C por até duas semanas
paraformaldeído, 20%Microscopia Eletrônica Sciences15713Sdiluído com
PBS PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ anticorpoR& RelaçãoAF385: suplemento de poliamina 1:400
(1000x)Reagente de limpeza Sigma-AldrichP8483
Rapiclear, 1,49SUNJIN LABRC149001
Bicarbonato de sódio (7,5%)Gibco25080094
Desoxicolato de sódio monohidratadoThermofisherJ6228822dissolver com ddH2O para solução estoque a 1% (peso / v)
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10faça a solução estoque a 1 mM com DMSO e armazene a -20° C por até 1 ano.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0,4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116reconstituir com ddH2O estéril a uma concentração de 100 ng/µ L, alíquota e loja a -20° O
Microscópio Confocal de células automatizado Razão de diluição do de diluição D

Referências

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