Este estudo apresenta um ensaio FRET raciométrico simples e fácil de usar para a detecção e avaliação quantitativa da atividade da DNase e demonstra sua aplicação na análise de uma nuclease fraca.
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Artigo de método
Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O presente protocolo descreve um ensaio raciométrico simples e sensível de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) para a detecção e avaliação quantitativa da atividade da DNase. As medições ratiométricas de FRET fazem uso da proporção de sinais de emissão de doadores e aceitadores. O ensaio detecta quebras de DNA de fita simples usando uma oligossonda FRET de 38 meros em forma de grampo e marcada duplamente, empregada como um sensor de clivagem de DNA em tempo real. A principal aplicação da abordagem descrita é a avaliação quantitativa dos efeitos das condições de reação, como pH, temperatura e composição do tampão, na atividade da DNase. Devido à sua capacidade de detectar até mesmo clivagem de DNA menor e lenta, o ensaio é particularmente adequado para investigar a atividade nucleolítica fraca que requer longos períodos de observação e para estudar os efeitos do pH na atividade da DNase. Essas vantagens específicas deste protocolo FRET raciométrico são ilustradas por sua aplicação à detecção e análise da atividade DNase do inibidor de elastase leucocitária (LEI).
Introdução
A abordagem de fluorescência raciométrica é um método analítico que usa proporções de sinais de fluorescência em vez de depender apenas da intensidade de um único sinal 1,2. A vantagem de usar as proporções é que elas fornecem calibração interna e compensam muitos fatores aleatórios, como variações nas concentrações de amostras e sondas, parâmetros do instrumento, etc. Isso aumenta a precisão e a sensibilidade das sondas fluorescentes.
No contexto específico das sondas de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), o termo "raciométrico" refere-se ao fato de que a medição é baseada na razão de dois sinais de emissão do par de fluoróforos doadores e aceptores de FRET. Para quantificar a atividade do analito alvo, as sondas FRET raciométricas usam a razão das intensidades de emissão do aceptor/doador (ou, em alguns casos, a relação doador/aceitador invertida). A razão está diretamente relacionada à eficiência do FRET. Ele fornece um mecanismo de autonormalização que minimiza o ruído de fundo e leva em conta as variações nas condições de iluminação e na concentração da sonda3.
Aplicações interessantes recentes do método raciométrico incluem seu uso em biossensores eletroquímicos raciométricos para a detecção de DNA tumoral circulante (ctDNA) 4 , 5 , em bio-nanomáquinas movidas a movimento browniano para detecção de FRET da fase fagocítica da apoptose6 e para marcação expressa de FRET e análise da depuração fagocítica7. A abordagem raciométrica FRET descrita neste trabalho é útil para a avaliação quantitativa da atividade da DNase. As medições do ensaio são baseadas nas proporções das emissões do par FRET. Devido à sua capacidade de detectar até mesmo clivagem de DNA menor e lenta, o ensaio é particularmente adequado para a investigação de atividade nucleolítica fraca que requer períodos de observação mais longos e para experimentos em diferentes níveis de pH.
Aqui, algumas vantagens específicas do ensaio raciométrico FRET são ilustradas por sua aplicação para estudar a atividade da DNase de um inibidor fraco da nuclease-leucócitos elastase (LEI). O relatório inclui um protocolo detalhado com instruções passo a passo e uma descrição da análise de dados raciométricos.
Descrição da sonda FRET raciométrica
A sonda FRET raciométrica é um oligo de DNA de 38 meros auto-complementar que transporta o par FRET doador-aceitador de FAM-TAM (Fluoresceína-Tetrametilrodamina). Sua sequência é 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'. O 38-mer auto-hibridizante assume uma conformação em forma de grampo, compreendendo dois grampos de cabelo conectados de 23 e 15 nucleotídeos, que posicionam seus dois fluoróforos a 23,8 Å um do outro. Isso é significativamente mais próximo do que o raio de Förster para este par, R0 = 55 Å8. Tal posicionamento corresponde a uma eficiência muito alta de transferência de energia do doador para o aceptor7: EFRET = 0,993477. Como resultado, quando iluminada no comprimento de onda de excitação FAM (488 nm), a sonda FRET emite fluorescência no comprimento de onda de emissão do aceptor TAM (580 nm), enquanto a emissão FAM (525 nm) é suprimida.
A Figura 1A mostra a estrutura secundária da sonda prevista pela UNAF, com pequenos loops em ambos os ápices do gancho de cabelo devido ao impedimento estérico da curvatura apertada. O esquema de detecção de quebra de DNA pela sonda FRET é apresentado na Figura 1B. Isso mostra que a quebra da oligossonda por uma DNase separa seu par FRET. Essa separação produz mudanças drásticas nos espectros de emissão de ambos os fluoróforos na sonda. A Figura 1C apresenta os espectros de emissão da sonda antes e depois de sua clivagem e demonstra que a divisão do par FRET após a clivagem da sonda DNase II aumenta a emissão do doador a 525 nm (ID 525 nm) e simultaneamente diminui a emissão do aceptor a 580 nm (IA 580 nm). A Figura 1D mostra as razões PAGE gel e FRET correspondentes aos espectros de emissão. A clivagem da sonda DNase II produziu duas bandas largas correspondentes a fragmentos FAM de 12-16 mer (verde) e TAM de 20-24 mer (vermelho), indicando cortes aleatórios do 38-mer em ambos os lados do T23 nas proximidades da área de conexão entre os grampos de cabelo.
Figura 1: Estrutura e operação da sonda FRET raciométrica. (A) Estrutura secundária prevista da sonda FRET gerada pela UNAFold. (B) Representação esquemática da sonda FRET em funcionamento. A sonda FRET raciométrica é um oligonucleotídeo de 38 mer em forma de grampo marcado com um doador FRET (FAM) e um aceptor (TAM) a uma distância FRET efetiva de 23,8 Å, garantindo >99% de eficiência FRET. A clivagem da oligossonda por uma DNase separa o par FRET, abolindo o FRET. (C) Espectros de emissão da sonda FRET antes e depois da clivagem mediada por DNase II. Antes da clivagem, a emissão de FAM é suprimida e a emissão de TAM é proeminente. A clivagem mediada por DNase separa FAM e TAM, restaurando a emissão de FAM (pico de 525 nm) e abolindo a emissão de TAM (queda de 580 nm). λ excitação = 488 nm. (D) Avaliação raciométrica e eletroforética da sonda FRET antes e depois da clivagem da DNase II. Painel superior: Razões FRET (RD / A = ID 525 nm / IA 580 nm), representando uma medida quantitativa do estado da sonda. Vermelho: não cortado; verde: DNase II-clivada. Painel inferior: Gel PAGE desnaturante correspondente aos dados fluorométricos. A clivagem da DNase II produz fragmentos marcados com FAM (12-16 nt, verde) e fragmentos marcados com TAM (20-24 nt, vermelho), indicando clivagem perto da conexão entre grampos de cabelo, flanqueando T23. O controle não clivado mostra fluorescência amarela. Escada: Oligonucleotídeos marcados com FAM e TAM correspondentes aos segmentos 5 'e 3' da sonda de 38 meros, com marcadores fluorescentes em suas posições originais. Condições de reação: tampão acetato de sódio 10 mM (pH 5,2), sonda FRET de 1 pmol/μL, DNase II 0,0033 U/μL, 24 h a 37 °C. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; λ excitação = 488 nm. UNAFold condições: sonda FRET de 1 μM, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Embora as mudanças nos espectros de emissão de teste individuais sejam óbvias, as comparações quantitativas entre um grande número de espectros de emissão requerem um parâmetro quantitativo mais fácil de usar e compacto. Este papel é desempenhado pelo rácio FRET. O método de fluorescência apresentado pertence a um grupo de abordagens raciométricas que dependem das razões diretas (dois canais) de emissões de fluorescência dos membros do par FRET para suas avaliações quantitativas 2,9.
A abordagem utiliza a razão de emissões doadores/aceitadores (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), que está relacionada à eficiência do FRET e caracteriza quantitativamente a condição do 38-mer (quebrado ou intacto). A relação ID / IA fornece um mecanismo de autonormalização que inerentemente explica variações em fatores como concentração da sonda, intensidade de excitação e fotobranqueamento3. A abordagem é adequada apenas para sondas FRET que têm doador e aceitador ligados na mesma sonda, onde sua proporção é conhecida e constante. Por esse motivo, a abordagem não precisa considerar a excitação direta da diafonia do aceitador ou do doador2. A estequiometria fixa doador-aceitador da sonda garante que as taxas de emissão doador/aceitador não sejam afetadas por essas variações e reflitam diretamente a condição da sonda. Como resultado, a proporção de emissões doador-aceitador fornece um parâmetro quantitativo de clivagem de DNA com normalização de sinal embutida 2,3.
O ensaio emprega a razão ID / IA ( em vez da relação IA /I D oposta) porque essa proporção descreve a cessação da FRET após a clivagem da sonda e, portanto, muda na mesma direção que o aumento da atividade da DNase com o aumento da clivagem. Isso é ilustrado pela Figura 1D, que mostra a razão FRET da sonda raciométrica e sua eletroforese PAGE antes e depois de sua clivagem por DNase II, ambas correspondendo aos espectros da Figura 1C. Para demonstrar a conveniência, a economia de tempo e a facilidade de uso do ensaio FRET raciométrico, ele foi aplicado para descobrir e estudar a atividade da DNase de um inibidor fraco da nuclease-leucócitos elastase (LEI).
LEI de nuclease fraca
O inibidor de protease LEI é naturalmente metaestável, ou seja, topologicamente desequilibrado. Esse recurso é essencial para seu mecanismo inibitório. Quando sua protease alvo cliva a alça de sítio reativo LEI (RSL), a molécula inibidora de protease sofre uma mudança conformacional drástica, esticando mecanicamente a protease em uma forma inativa10,11. Notavelmente, isso também quebra e distende a própria molécula de LEI e desmascara um sítio DNase críptico que é coberto por sua dobra nativa, convertendo assim o LEI em uma endonuclease ativa L-DNase II (DNase II derivada de LEI)11,12. O sítio DNase críptico também pode ser exposto pela desnaturação e quebra do LEI causada por sua incubação noturna em pH 2 em ácido sulfúrico10,13. A utilização deste ensaio FRET para estudar o LEI demonstrou que os tratamentos de desnaturação química agressivos e a clivagem enzimática direcionada não são estritamente necessários para desmascarar a atividade nucleolítica latente do LEI.
A aplicação e o protocolo apresentados da abordagem RACIOMÉTRICA FRET descrevem a descoberta de uma atividade fraca de DNase inerentemente presente em LEI normal e não desnaturado. A descoberta da capacidade nucleolítica intrínseca do LEI não clivado e sua análise foi possível devido à adequação do ensaio para longos períodos de observação em diferentes níveis de pH ácido.
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Protocolo
Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica
O método é adequado para a detecção e análise das propriedades nucleolíticas de uma proteína solúvel. Para examinar a dependência do pH da DNase investigada, o procedimento avalia simultaneamente a atividade da DNase em uma faixa de valores de pH. A técnica pode ser usada para estudar atividades de nuclease fraca e lenta. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de componentes da mistura de incubação para o sistema de avaliação fluorométrica
- Preparar as soluções-tampão nos intervalos de pH desejados. Para a faixa de pH de 6,8 a 8,0, use Tris-HCl ou tampões de fosfato. Use o tampão Tris-HCl para condições fisiológicas de pH (pH 7,2 a 8,0) devido à sua estabilidade e interferência mínima na atividade enzimática.
NOTA: Os tampões de fosfato são apropriados para esta faixa de pH, mas são menos adequados para valores de pH mais altos (>7,5) devido às suas limitações de capacidade tampão.
Para uma faixa de pH de 4,2 a 7,2, use tampões de acetato ou citrato. O tampão de acetato é eficaz para condições de pH mais baixo, até pH 4,2.
NOTA: O tampão citrato é utilizável em valores de pH ligeiramente mais altos (pH 5,6 a 7,2) e oferece boa capacidade de tampão. Esses tampões são adequados para estudar a atividade da DNase em condições ácidas a neutras. O estudo apresentado da atividade nucleolítica do LEI utilizou tampões de acetato de sódio de 10 mM com pH variando de 4,8 a 6,5. - Diluir a amostra de proteínas até uma concentração adequada em cada solução tampão. Quando a atividade na amostra for completamente desconhecida, prepare uma série de diluições da proteína. A diluição ideal depende da força da atividade da DNase e deve ser determinada experimentalmente testando várias concentrações de proteínas.
NOTA: O estudo apresentado da atividade nucleolítica ultrafraca do LEI o utilizou na concentração de 1 μM.- Sempre verifique o pH da solução final ao usar tampões altamente concentrados, porque o pH dos tampões concentrados pode mudar com a diluição.
- Preparar a solução de sonda RACIO em água isenta de nuclease. Use concentrações de sonda FRET próximas a 1 μM (1 pmol/μL). Evite usar concentrações de sonda muito altas.
Aqueça e resfrie rapidamente a solução da sonda antes da aplicação para garantir a dissociação completa de pares de bases indesejáveis.
NOTA: O estudo apresentado da atividade nucleolítica do LEI usou uma concentração de 1 μM (1 pmol/μL) da sonda FRET em água livre de nuclease.
2. Indução da reação DNase usando a sonda FRET raciométrica como substrato
- Prepare três poços em uma placa de 96 poços para cada condição de pH a ser testada. Inclua três poços adicionais, cada um para os controles positivos e negativos.
- Em cada alvéolo para a série de pH, combinar o seguinte:
70 μL de água livre de nuclease
10 μL de tampão 10X (tampão de sua escolha)
10 μL de amostra com proteína
10 μL de solução de sonda raciométrica (concentração de estoque de 10 pmol/μL)
NOTA: O estudo apresentado da atividade nucleolítica do LEI em pH ácido utilizou o seguinte Tampão 10X: 100 mM Acetato de Na pH 5,2 - Em cada poço de controlo positivo, combinar o seguinte:
79 μL de água livre de nuclease
10 μL de tampão 10X DNase II (acetato de 100 mM Na pH 5,2)
0,33 μL de DNase II (estoque de 1 U/μL)
10 μL de solução de sonda raciométrica (concentração de estoque de 10 pmol/μL)
NOTA: Para estudos em pH ácido, use DNase II como controle positivo. Ao avaliar a atividade da DNase perto de pH 7 (especificamente pH 6,5-8), mude para DNase I e seu tampão associado (por exemplo, 10 mM Tris-HCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, pH 7,6) em vez de DNase II e tampão acetato. - Em cada poço de controle negativo, adicione água livre de nuclease no lugar da amostra de proteína.
- Em cada alvéolo para a série de pH, combinar o seguinte:
- Induzir a reação DNase adicionando as soluções da sonda às misturas de reação contendo proteína DNase em diferentes valores de pH.
NOTA: Misture bem todas as amostras, evitando a formação de bolhas. Para amostras DNase ativas, inicie todas as reações o mais próximo possível da simultânea. Para atividades ultrafracas, como a do LEI, o tempo estrito é menos crítico.
NOTA: Para garantir tempos de incubação consistentes, especialmente ao lidar com nucleases ativas, escalone a adição de amostras com base no tempo necessário para cada medição. Por exemplo, se cada medição levar 10 s, adicione a segunda amostra 10 s após a primeira.
3. Incubação
- Incube a DNase estudada com a sonda FRET raciométrica a 37 ° C em banho-maria ou incubadora com temperatura regulada por vários períodos de tempo. Use vários pontos de tempo com intervalos regulares de amostragem para avaliar com precisão as taxas de renovação enzimática e minimizar os artefatos. O estudo apresentado da atividade nucleolítica ultrafraca do LEI usou incubações de 24 h para registrar a reação nucleolítica lenta.
NOTA: Determine o tempo ideal de incubação nos experimentos preliminares, pois depende da força da DNase estudada. Uma nuclease ativa exigiria um tempo muito curto para completar a clivagem da sonda, então comece com uma incubação de 15 a 30 minutos. Se a amostra estiver muito concentrada e a reação for muito rápida, a concentração de proteína deve ser reduzida. Se a proteína da amostra for muito fraca, o tempo de incubação pode aumentar conforme necessário.
4. Normalização do sinal para as mesmas condições de pH
- Pare todas as reações de incubação adicionando 100 μL de Tris-HCL 250 mM (pH 8,0). Esta etapa também equaliza o pH em todas as amostras.
NOTA: A etapa de equalização do pH é importante ao comparar reações iniciadas em diferentes condições de pH. O procedimento garante a separação completa dos fragmentos da sonda, maximizando seu sinal baseado em FRET. Além disso, a emissão de fluoróforo FAM da sonda é reduzida em pH ácido e é ideal em pH 8,0. Para amostras com maior força iônica do que as usadas neste estudo, uma solução de equalização de pH mais concentrada (>250 mM) e mais alta (>8,0) pode ser necessária para obter um ajuste efetivo do pH.
NOTA: O pH alcalino interrompe efetivamente a atividade de nucleases ácidas, como o LEI, conforme demonstrado no estudo atual. Para nucleases neutras ou alcalinas, métodos de inativação específicos apropriados devem ser identificados e aplicados antes da avaliação do sinal.
5. Detecção de sinal fluorométrico e cálculo de razões FRET
- Imediatamente após a etapa de equalização do pH, use um espectrofluorômetro para registrar os espectros de emissão dos fluoróforos doadores e aceptores. Realize medições diretamente na placa de 96 poços, excitando o fluoróforo doador a 488 nm e detectando simultaneamente emissões a 525 nm (doador) e 580 nm (sinal aceitador derivado do FRET).
- Use as intensidades de fluorescência registradas para avaliar a atividade da DNase em cada amostra. Aplicar métodos estatísticos apropriados para analisar os dados e avaliar a significância.
NOTA: Calcule a razão FRET usando a fórmula: RFRET = Emissão doadora a 525 nm/Emissão do aceitador a 580 nm. Neste ensaio, a clivagem do DNA interrompe o FRET separando os fluoróforos, resultando em um aumento da emissão do doador e uma diminuição da emissão do aceptor. Essa mudança aumenta a razão FRET (RFRET), que serve como um indicador da atividade da DNase.
6. Verificação da clivagem baseada em PAGE
- Verifique a clivagem da sonda FRET realizando eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (PAGE)14. A sonda FRET e seus produtos de clivagem são marcados com fluorescência e visíveis sem coloração adicional.
NOTA: No estudo representativo, a clivagem mediada por LEI da sonda FRET de 38 mer foi confirmada pela desnaturação do PAGE (ver Figura 2). A análise revelou que o LEI produziu fragmentos marcados com FAM de 6-8 mer e fragmentos marcados com TAM de 15-16 meros, consistentes com clivagem perto de ambos os ápices em grampo. Esse padrão diferiu do perfil de fragmento gerado pelo DNase II.- Carregue 15 μL de cada amostra em um gel PAGE desnaturante a 20%.
- Execute o gel por 1 h a 100 V.
- Adquira imagens de gel usando um sistema de documentação equipado com uma câmera colorida de alta resolução.
NOTA: As imagens do estudo representativo foram capturadas usando uma câmera digital SLR.
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Resultados
Este estudo representativo destaca as vantagens específicas da abordagem RACIOMÉTRICA FRET para investigar reações enzimáticas lentas que requerem longos períodos de observação. Em particular, o aplicativo demonstra a detecção e análise da atividade DNase inerente do LEI usando um sistema FRET raciométrico. Os resultados deste estudo são apresentados na Figura 2.
Usando essa abordagem, demonstramos ...
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Discussão
Este estudo demonstra a aplicação de FRET raciométrico para a detecção e avaliação da atividade da DNase usando uma nuclease fraca - inibidor de elastase leucocitária (LEI). A abordagem fornece um método conveniente e quantitativo para avaliar as propriedades da DNase de proteínas e biomoléculas. Seu protocolo é direto e seu procedimento de análise de dados é direto e simples. O ensaio usa uma sonda FRET de 38 meros que tolera longas incubações em vários pH ácidos. Essa propriedade, como...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela bolsa R01 GM148812 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais, NIH; por subsídios R21 CA255979 do Instituto Nacional do Câncer, NIH; e concede R21 AG073887 e R21 AG071978 ambos do National Institute on Aging, NIH (todos VV
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 96 poços | Falcão | 353219 | |
| Sonda de DNA FRET | IDT DNA | 5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM – Fluoresceína-dT; TAM – Tetrametilrodamina-dT. | |
| DNase II | Sigma Aldrich | D8764 | |
| Câmera digital SLR EVOLT | Olimpo | E500 | |
| Aparelho de eletroforese em gel com fonte de alimentação | Bio-Rad | ||
| LEI | Novoproteína | CJ01 | |
| Sistema de imagem em gel LiCOR | LiCOR | ||
| Água livre de nuclease | Invitrogen | 10977015 | |
| Gel PAGE pré-moldado | Invitrogen | EC68852 | |
| Solução tampão de acetato de sódio pH 5,2 | Sigma Aldrich | S2899-100ML | |
| Espectrofluorômetro | Tecano | Saffire 2 |
Referências
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Reimpressões e permissões
