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Artigo de método

Revelando o transporte e os efeitos xenobióticos em mitocôndrias isoladas: insights de ensaios respirométricos e enzimáticos

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DOI:

10.3791/67146

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7 de março de 2025

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta uma metodologia para estudar os efeitos xenobióticos na função mitocondrial por meio de ensaios respirométricos e enzimáticos. Ele examina a modulação da cadeia de transporte de elétrons em várias espécies, oferecendo insights para o desenvolvimento de biopesticidas direcionados contra doenças transmitidas por insetos vetores.

Resumo

As mitocôndrias são frequentemente chamadas de usinas de energia da célula devido ao seu papel crucial na produção de energia por meio da cadeia de transporte de elétrons (ETC). No entanto, seu significado vai muito além da produção de energia. A desregulação da bioenergética mitocondrial pode desencadear cascatas intracelulares que afetam a saúde e a função celular. Dada a sua importância fisiológica, há um interesse crescente em explorar o potencial farmacológico da função mitocondrial para o desenvolvimento de novas terapias e bioprodutos. A modulação da bioenergética mitocondrial pode fornecer abordagens inovadoras para enfrentar desafios como distúrbios neurodegenerativos, doenças metabólicas e câncer, bem como desenvolver bioprodutos para o controle de pragas e doenças transmitidas por vetores.

Este trabalho apresenta um método para avaliar os efeitos dos xenobióticos na cadeia de transporte de elétrons (ETC) usando vários substratos, incluindo glutamato e NADH para o complexo I, succinato para o complexo II e citocromo c (oxidado e reduzido) para os complexos III e IV. Esta metodologia permite que a ativação ou inibição do transporte de elétrons através de complexos mitocondriais seja avaliada usando um respirômetro e espectrofotômetro. As mitocôndrias podem ser provenientes de mitocôndrias isoladas, células fragmentadas ou tecido homogeneizado de várias espécies.

Em laboratório, a função mitocondrial foi analisada em ratos Aedes aegypti e Wistar, mas esse método também é aplicável a outras espécies, como Rhipicephalus microplus e Rhodnius prolixus. Essa abordagem fornece a base para teorizar sobre a existência de proteínas desacopladoras e preferências de substrato oxidável específicas da espécie influenciadas por suas demandas energéticas únicas. Descobertas recentes oferecem informações valiosas sobre estratégias inovadoras de design de bioinseticidas que visam a função mitocondrial, com potencial significativo para controlar efetivamente doenças transmitidas por vetores e infestações de pragas.

Introdução

As mitocôndrias sempre foram chamadas de usina de energia das células devido à sua geração de energia química durante o processo de fosforilação oxidativa 1,2. Além de suas principais funções metabólicas centrais, as mitocôndrias também estão implicadas em muitos outros processos celulares, desde níveis de regulação intracelular de Ca2+, processos inflamatórios e produção de espécies reativas de oxigênio até processos de indução de morte celular3. A bioenergética mitocondrial e sua desregulação têm sido associadas a processos intracelulares que afetam a função celular e a saúde geral. Isso despertou um interesse crescente em pesquisar o potencial farmacêutico de direcionar a função mitocondrial para desenvolver terapias inovadoras e bioprodutos seguros 4,5,6. Além disso, compreender a intrincada interação dos processos mitocondriais e seu impacto na função celular é crucial para o desenvolvimento de terapias direcionadas e apresentar oportunidades para o design de bioprodutos para controlar doenças transmitidas por vetores e infestações de pragas 7,8.

O direcionamento de componentes específicos da cadeia de transporte de elétrons com xenobióticos surgiu como uma estratégia para modular a função mitocondrial para a geração de biopesticidas. Compostos naturais e sintéticos incluídos nas formulações de pesticidas, como pesticidas direcionados às mitocôndrias à base de nanopartículas, demonstraram afetar a função mitocondrial, diminuindo o potencial mitocondrial e a síntese de ATP em S. frugiperda9.

Além disso, a maioria dos carbamatos e produtos à base de piretróides foram relatados como inibidores do complexo I em mosquitos; no entanto, sua exposição prolongada criou algumas populações resistentes a piretróides em Anopheles gambiae, muitas vezes relacionadas a níveis elevados de P450s que podem metabolizar esses substratos10,11. Da mesma forma, as plantas e seus óleos essenciais, extratos e metabólitos secundários foram documentados como inseticidas potenciais com uma ampla gama de mortalidade em diferentes estágios do inseto12,13. A atividade inseticida desses compostos naturais pode estar relacionada à inibição do transporte de elétrons em um ponto específico da cadeia respiratória mitocondrial, modulando a produção de espécies reativas de oxigênio, o potencial mitocondrial ΔΨm e a síntese de ATP que podem desencadear processos de morte celular 6,8.

Os compostos naturais, como fontes para a formulação de pesticidas, e seus efeitos nas mitocôndrias desempenham um papel crucial no projeto de biopesticidas novos e seguros. Nesse contexto, este manuscrito descreve uma metodologia para identificar a capacidade dos xenobióticos de ativar ou inibir o transporte de elétrons através de complexos mitocondriais. Essa abordagem abrangente permite a medição precisa dos efeitos dos xenobióticos na função mitocondrial usando uma variedade de substratos, empregando métodos de respirometria e espectrofotometria. Essa metodologia tem sido aplicada para analisar a função mitocondrial de espécies-chave de vetores, incluindo o Aedes aegypti, levando à teorização da presença de proteínas desacopladoras e preferências distintas de substrato oxidável específicas para cada espécie.

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Protocolo

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Investigação Científica CEINCI: Comitê de Ética em Pesquisa Científica da Universidade Industrial de Santander. Além disso, esses ensaios cumpriram as diretrizes do Arrive e seguiram a Lei Colombiana 84 de 1989 (Capítulo IV, Art. 23-26) e a Resolução 8430 (1993, Título IV, Art. 83-93) que regulamentam a pesquisa com animais na Colômbia.

NOTA: É altamente recomendável ler o capítulo de fosforilação oxidativa de qualquer livro de bioquímica antes de iniciar este protocolo.

1. Reagentes e soluções

  1. Para isolar as mitocôndrias do fígado de rato, prepare 250 mL de tampão de isolamento de mitocôndrias: 250 mM de D-manitol, 10 mM de HEPES pH 7,2 e 1 mM de EGTA. Retire 50 mL de tampão de isolamento (isso será chamado de tampão de isolamento sem BSA) e, em seguida, adicione 0,2 g de BSA aos outros 200 mL (isso será chamado de tampão de isolamento com BSA).
  2. Para homogeneizar larvas de Aedes aegypti , prepare 100 mL de tampão: 250 mM de sacarose, 10 mM de HEPES, 1 mM de EGTA pH 7,2.
  3. Prepare o tampão de reação: solução tampão de fosfato de sódio 80 mM, pH 7,4, 50 μM EDTA.
  4. Preparar um stock de reagentes utilizados para atividades enzimáticas a pH 7,2 conforme descrito abaixo: 25 mM NADH (recém-preparado para cada ensaio), 2 M de succinato de sódio, 4 mM de citocromo c (recém-preparado para cada ensaio), 200 μM de rotenona, 0,5 mM de KCN, 6 mM de 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP), 100 mM de fenassulfato de fenazina (PMS) e 60 mM de ferricianeto de potássio.
    NOTA: Água ultrapura com resistividade de 18,2 MΩ·cm a 25 °C foi usada para todos os experimentos e preparação de reagentes. Essa água foi gerada usando um sistema de purificação Milli-Q, garantindo a remoção de contaminantes orgânicos, inorgânicos e microbianos a níveis abaixo dos limites detectáveis, tornando-a adequada para aplicações bioquímicas e de biologia molecular de alta sensibilidade.

2. Dissecção hepática, homogeneização e isolamento de mitocôndrias do fígado de rato

  1. Antes de começar, coloque todos os materiais e tampões no gelo, garantindo que todos os materiais estejam gelados durante todo o ensaio para evitar danos mitocondriais.
  2. Coloque 10 mL de tampão de isolamento mitocondrial em um tubo cônico gelado.
  3. Eutanasiar o rato Wistar macho por decapitação cervical, evitando o uso de CO2 que pode interferir nos ensaios respiratórios. Para isso, o Comitê de Ética em Pesquisa Científica da Universidade Industrial de Santander (CEINCI) aprovou os métodos na resolução 13 de 2022.
    NOTA: Os ratos não devem pesar mais de 170 g; A gordura também pode afetar as análises da respiração.
  4. Faça uma incisão (aproximadamente 4-5 cm) com um bisturi estéril através da seção abdominal do rato.
  5. Disseque o fígado completamente quando a área abdominal estiver visível. O fígado de rato é um órgão multilobulado, vermelho escuro aproximadamente 10 cm x 5 cm.
  6. Coloque cuidadosamente o fígado dentro do tampão de isolamento gelado e enxágue duas vezes com este meio.
  7. Pique finamente o fígado (tamanho inferior a 1 cm) com uma tesoura afiada em uma placa de Petri com 10 mL de meio de isolamento.
  8. Coloque a solução no tubo homogeneizador de tecidos Potter Elvehjem e homogeneize cuidadosamente pelo menos dez vezes, baixa velocidade (~ 390 rpm).
  9. Transferir a solução para um tubo cónico e centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4 °C.
  10. Após centrifugação, despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo cônico. Descarte o pellet com parte do tecido, sangue e componentes celulares intactos.
  11. Encha o tubo com mais tampão de isolamento (~ 35 mL) e centrifugue a 6000 x g por 10 min a 4 ° C.
  12. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento (mitocôndrias) num novo tampão de isolamento sem BSA.
    NOTA: Para ressuspensão mitocondrial, recomenda-se o uso de uma escova macia.
  13. Em seguida, centrifugue a 7000 x g por 10 min a 4 ° C, descarte o sobrenadante e ressuspenda as mitocôndrias isoladas em 2 mL de tampão de isolamento sem BSA.
  14. Determine a concentração de proteínas usando o método de Bradford ou similar14.

3. Homogeneização de colônias e larvas de Aedes aegypti .

NOTA: Para este procedimento, a colônia de Ae. aegypti foi mantida dentro de gaiolas de reprodução (40 cm × 40 cm × 40 cm) sob condições de inseticidão como umidade (70% ± 5%), fotoperíodo (12:12) e temperatura (27 ± 5 °C). Os ovos foram coletados em papel filtro.

  1. Certifique-se de que os ovos sejam chocados em bandejas com água filtrada e sem cloro uma semana antes do experimento. Identifique o ínstar pelo processo de muda no ciclo das larvas. Observe cada processo de muda para verificar seu status L1, L2 e L3. Quando a larva entrar em L3, aguarde no máximo 12 h para coletar o material.
  2. Colete pelo menos 100 larvas de Ae. aegypti no ínstar L3-L4 em água sem cloro (~ 30 mL de água). Pegue as larvas com uma pipeta Pasteur.
  3. Filtrar as larvas com papel de filtro, enxaguar as larvas coletadas e ressuspendê-las no tampão de homogeneização do Aedes aegypti (~2 mL).
  4. Transfira a solução com larvas para o tubo homogeneizador de tecidos Potter Elvehjem e homogeneize cuidadosamente pelo menos dez vezes a ~ 390 rpm.
  5. Transfira o tecido homogeneizado e filtre-o através de uma seringa de lã de vidro para remover grandes resíduos de exoesqueleto.
  6. Determinar a concentração de proteínas pelo método de Bradford ou similar15.
    NOTA: Não é necessário isolar as mitocôndrias das larvas do mosquito; É possível avaliar o efeito dos xenobióticos utilizando o extrato proteico obtido nesta etapa.

4. Determinação dos efeitos dos xenobióticos na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial

NOTA: Este protocolo foi projetado para avaliar o efeito de xenobióticos na bioenergética mitocondrial em mitocôndrias isoladas de fígado de rato e tecido de inseto homogeneizado.

Os ensaios são divididos em dois: polarográficos (NADH e succinato oxidase) e espectrofotométricos (NADH desidrogenase - complexo I, succinato desidrogenase - complexo II, citocromo c redutase - complexo III e citocromo c oxidase - complexo IV).

  1. Ensaios polarográficos: Para isso, use a respirometria de alta resolução para medir a oxidação completa de NADH e succinato pelo consumo de O2 e relate os resultados como NADH e succinato oxidase.
    1. Calibre o instrumento todos os dias antes de iniciar os ensaios. Esta etapa pode variar dependendo do oxígrafo usado. Siga as instruções do fabricante.
      1. Para calibração de Oroboros, adicione meio de reação nas câmaras com excesso de pelo menos 0,2 mL acima do volume da câmara experimental (2 mL), para encher a câmara e o capilar de injeção com meio.
    2. Ligue os agitadores após adição média.
    3. Aguarde até que o sinal de concentração de oxigênio se estabilize e registre-o.
    4. Para calibração zero de oxigênio, adicione mitocôndrias, suspensões celulares, fermento de padeiro ou ditionita (recomenda-se levedura de padeiro) que permitem o esgotamento de oxigênio e registre-o. Aguarde até que o sinal atinja os níveis de fundo (normalmente ± 2 pmol/mL/s para o sistema O2k).
    5. Realize atividades de NADH e succinato oxidase monitorando o consumo de oxigênio ao adicionar tampão de reação, 0,1 mg de proteína (mitocondrial ou larvas homogeneizadas) e o substrato (0,17 mM NADH ou 10 mM de succinato de sódio) à câmara.
    6. Use inibidores de proteína de transporte de elétrons para confirmar que o consumo de oxigênio observado é devido à cadeia respiratória mitocondrial. Os mais comuns são rotenona 1 μM e KCN1mM 16. Na célula do oxígrafo, adicione os reagentes de acordo com a Tabela 1 (a sequência é importante).
  2. Ensaios espectrofotométricos
    NOTA: Para avaliar o transporte de elétrons através dos complexos mitocondriais, ensaios enzimáticos foram conduzidos e medidos usando um espectrofotômetro e aceptores de elétrons artificiais, como PMS, DCPIP e citocromo c. Recomenda-se medir uma enzima por dia. Preparar tampões e reagentes pelo menos um dia antes dos ensaios. Alguns compostos são fotossensíveis; ver Tabela 2 para mais recomendações.
    1. Para a atividade da NADH desidrogenase, os sistemas de reação contêm 50 mM de solução tampão fosfato pH 7,4, 2 mM de EDTA, 0,1 mg/mL de proteína mitocondrial, 1 μM de rotenona e 1 mM de KCN. Na célula do espectrofotômetro, adicione os reagentes de acordo com a Tabela 2 (a sequência é importante)17. As etapas recomendadas são as seguintes:
      1. Prepare 100 mL de fosfato tampão misturado com o EDTA e verifique novamente se o pH não muda. Manter o tampão no frigorífico, mas é obrigatório mantê-lo à temperatura ambiente (RT; aproximadamente 25 °C) durante os ensaios.
      2. Prepare soluções frescas de rotenona, KCN, NADH e ferricianeto de potássio (estável até 4 h). O volume sugerido é de 1 mL de soluções concentradas (ver a primeira coluna da tabela).
      3. Se o composto ensaiado tiver baixa solubilidade em água, incluir um controlo adicional da actividade enzimática na concepção experimental utilizando apenas o solvente do composto.
      4. Primeiro, monitore a atividade da NADH desidrogenase pela redução do ferricianeto de potássio a 420 nm. Calcule sua concentração por seu coeficiente de extinção molar de 1,04 mM-1·cm-1. O espectrofotômetro tem a opção de calcular a atividade máxima em uma reação; Verifique o manual do usuário. Posteriormente, divida a atividade relatada pela concentração de proteína usada para obter a atividade específica da enzima.
    2. Avalie a atividade da succinato desidrogenase adicionando 20 mM de succinato de sódio e 1 mM de fenazina metossulfato (PMS) com 60 μM de 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP) como aceptores artificiais de elétrons. Na célula do espectrofotômetro, adicione os reagentes de acordo com a Tabela 3 (a sequência é importante)17. As recomendações são as seguintes:
      1. Prepare o mesmo tampão usado para a NADH desidrogenase. Mantenha-o nas mesmas condições.
      2. Prepare soluções frescas de succinato, PMS e DCPIP. O volume sugerido é de 1 mL de soluções concentradas. Prepare as soluções PMS e DCPIP no mesmo dia do ensaio.
      3. Se o composto ensaiado tiver baixa solubilidade em água, incluir um controlo adicional da actividade enzimática na concepção experimental.
      4. Monitore a oxidação do succinato pela redução do DCPIP a 600 nm. Calcule sua concentração por seu coeficiente de extinção molar de 21,0 mM−1·cm−1, aplicando a lei de Beer. Posteriormente, divida a atividade relatada pela concentração de proteína usada para obter a atividade específica da enzima.
    3. Meça a atividade da citocromo c redutase (complexo III) usando NADH ou succinato como substratos oxidáveis. Com esta enzima, o transporte de elétrons do complexo I (usando NADH) ou complexo II (usando succinato) passa para a ubiquinona e depois para o complexo III, que passa os elétrons para o citocromo c. Esta reação é seguida pela redução do citocromo c. Prepare o sistema de reação contendo 50 mM de solução tampão fosfato pH 7,4, 2 mM de EDTA, 0,1 mg de proteína mitocondrial, 50 μM de NADH e 0,1 mM de KCN. Na célula do espectrofotômetro, adicione os reagentes de acordo com a Tabela 4 (a sequência é importante)18. As recomendações são as seguintes:
      1. Prepare o mesmo tampão usado para a NADH desidrogenase. Mantenha-o nas mesmas condições.
      2. Use o mesmo NADH e KCN da NADH desidrogenase.
      3. Se o composto ensaiado tiver baixa solubilidade em água, incluir um controlo adicional da actividade enzimática na concepção experimental.
      4. Monitore a redução do citocromo c a 550 nm e calcule sua concentração por seu coeficiente de extinção molar de 19,8 mM−1·cm−1, aplicando a lei de Beer. Posteriormente, divida a atividade relatada pela concentração de proteína usada para obter a atividade específica da enzima.
    4. Medir a citocromo c oxidase (complexo IV) expressa como atividade da citocromo c oxidase. Para isso, prepare uma reação do sistema contendo 50 mM de solução tampão fosfato, pH 7,4, 2 mM de EDTA e 0,1 mg de proteína mitocondrial (Tabela 5). Para esses ensaios enzimáticos, reduza o citocromo c misturando quantidades equimolares de citocromo c e ditionito de sódio, garantindo a redução completa do citocromo c.
    5. Em seguida, passe a mistura resultante por uma coluna de gel de dextrano reticulada usando a mesma solução tamponada com fosfato da fase móvel. Em seguida, quantificar as frações coletadas usando um espectrofotômetro a 550 nm19. As recomendações são as seguintes:
      1. Use o mesmo tampão usado para a NADH desidrogenase. Mantenha-o nas mesmas condições.
      2. Se o composto testado tiver baixa solubilidade em água, um controle adicional da atividade enzimática deve ser incluído no projeto experimental.
      3. Monitore a oxidação do citocromo c a 550 nm e calcule sua concentração por seu coeficiente de extinção molar de 19,8 mM−1·cm−1, aplicando a lei de Beer. Posteriormente, divida a atividade relatada pela concentração de proteína usada para obter a atividade específica da enzima.
        NOTA: Um arquivo de planilha mostrando o processo de cálculo da atividade específica das enzimas, medida pelo consumo de oxigênio e espectrofotometria, está incluído como Arquivo Suplementar 1.

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Resultados

Antes de analisar os resultados obtidos com este protocolo, é fundamental lembrar um pouco sobre a bioquímica da cadeia de transporte de elétrons nas mitocôndrias. Primeiro, o NADH fornece um par de elétrons para os centros de oxidorredução localizados no complexo I. Lá, inicia-se o transporte de elétrons que passam do complexo I para a ubiquinona, posteriormente para o complexo III, que os doa para o citocromo c, e finalmente para o complexo IV, onde o oxigênio é o aceptor final de elétrons, reduzindo-o a água. Por outr...

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Discussão

Um método espectrofotométrico e polarográfico com O2 de alta resolução foi empregado para investigar os efeitos dos xenobióticos na função mitocondrial. O estudo avaliou especificamente o impacto do óleo essencial de Cymbopogon flexuosus e do carvacrol na oxidação do NADH e do succinato, bem como no transporte de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, usando dois modelos biológicos diferentes: mitocôndrias isoladas de fígado de rato e larva...

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Divulgações

Todos os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores agradecem à "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" da Universidad Industrial de Santander pelo financiamento da bolsa número 3739 correspondente ao projeto "Formulação de um ixodicida e ixorepelente projetado em laboratório e validado em campo para prevenir a infestação por carrapatos em bovinos".

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,6-diclorofenolindofenolMerck119814Prepare no mesmo dia de uso.
Reagente de BradfordMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Citocromo cMerckC2506Conversor fotossensível cobri-lo com folha de alumínio. Em solução, deve ser armazenado no freezer.
D-manitolMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Ácido etilenodiaminotetracético sal tetrassódico di-hidratadoMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178Em solução funciona por 2 semanas.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC MicroplatePhotometer Thermo Scientific 
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Fenazina metossulfato MerckP9625Prepare no mesmo dia de uso.
Ferricianeto de potássioMerck244023Prepare no mesmo dia de uso.
homogeneizador de tecidos Potter Elvehjem
RotenonaMerck557368Solúvel em etanol. Conver fotossensível cobri-lo com folha de alumínio. Em solução, deve ser armazenado no freezer.
Succinato de sódioMerckS9637Em solução, deve ser armazenado no freezer.
SacaroseMerckS0389
β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo, hidrato de sal dissódico reduzidoMerckN8129Conversor fotossensível cobri-lo com folha de alumínio. Em solução, deve ser armazenado no freezer.
51119100Tubo

Referências

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