Isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório

Resumo

Este protocolo detalha o isolamento de condrócitos, condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs) e condroprogenitores migratórios (MCPs) da cartilagem articular humana. Abrange digestão enzimática, adesão de fibronectina e ensaios baseados em migração para isolar e caracterizar essas células.

Resumo

As células condroprogenitoras (CPCs), recentemente identificadas como uma subpopulação distinta, exibem promessa devido às suas propriedades mesenquimais, condrogênese aumentada e características hipertróficas limitadas. O enriquecimento de progenitores é obtido por meio de ensaios diferenciais de adesão à fibronectina e explante baseados em migração, com condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs) e condroprogenitores migratórios (MCPs) demonstrando potencial superior em comparação com os condrócitos. Este artigo investiga os detalhes do isolamento de células derivadas da cartilagem residentes, ou seja, condrócitos e condroprogenitores. Embora informações valiosas da pesquisa de condrócitos contribuam para nossa compreensão do reparo da cartilagem, os esforços contínuos são direcionados para o uso de condroprogenitores e para a exploração de seu potencial como uma abordagem terapêutica alternativa. Além disso, este artigo de metodologia fornece um protocolo passo a passo detalhado para isolar três tipos específicos de células da cartilagem: condrócitos, FAA-CPs e MCPs. Seguindo procedimentos padronizados, este protocolo facilita a extração bem-sucedida desses subtipos de células. Com base em extensa pesquisa, o artigo enfoca as intrincadas técnicas utilizadas no isolamento dos diferentes subconjuntos e as condições de cultura otimizadas necessárias para expandir e manter suas culturas. A metodologia engloba o isolamento enzimático de condrócitos derivados da cartilagem articular humana, adesão diferencial de fibronectina após digestão enzimática sequencial e ensaios de explante baseados em migração para obter células residentes na cartilagem.

Introdução

O surgimento da terapia regenerativa baseada em células representa uma abordagem significativa para o tratamento de doenças relacionadas à cartilagem, como osteoartrite (OA) e defeitos condrais¹. Esses distúrbios, caracterizados pela quebra ou lesão da cartilagem dentro das articulações, apresentam desafios substanciais durante o tratamento. O auto-reparo da cartilagem articular é relatado como limitado devido à sua arquitetura aneural, avascularidade e baixa atividade mitótica².

As células mais utilizadas para a regeneração do tecido cartilaginoso são as células-tronco mesenquimais (CTMs) e os condrócitos³. No entanto, vários estudos relataram limitações no uso dessas células para regeneração⁴. Essas limitações incluem a diferenciação terminal de condrócitos durante a expansão in vitro estendida para atingir a contagem de células necessária e a tendência hipertrófica das MSCs. Esses fatores podem resultar na formação de tecido de reparo com uma combinação subótima de fibrocartilagem e hialina 5,6,7,8.

A descoberta das células condroprogenitoras (CPCs) surgiu da busca por células alternativas na cartilagem articular⁹. Eles geraram imenso interesse devido à sua semelhança com as CTMs e seu potencial condrogênico superior, ao mesmo tempo em que exibem hipertrofia reduzida - uma combinação indispensável procurada^10,11. Em contraste com os condrócitos, foi relatado que essas populações progenitoras exibem atividade replicativa e telomerase aumentada, bem como aumento da expressão da proteína homóloga 1 do locus notch neurogênico (NOTCH-1) e do fator de transcrição SRY-box 9 (SOX-9) ^{12 , 13 , 14 , 15} . Existem dois métodos padrão para isolar CPCs relatados tanto da cartilagem quanto do menisco, incluindo um baseado na expressão de seu receptor de integrina (CD49e / CD29), isolado por meio de um ensaio de adesão de fibronectina - Condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs), e o outro baseado em seu potencial migratório aumentado de explantes de cartilagem - Condroprogenitores migratórios (MCPs) ^{11 , 13 , 16 , 17 ,18,19}. Numerosos estudos in vitro demonstram a superioridade condrogênica e a redução da hipertrofia de FAA-CPCs e MCPs em comparação com condrócitos e medula óssea (MO)-MSCs 20,21,22,23.

Investigações in vitro recentes comparando FAA-CPCs com MCPs demonstraram a capacidade aumentada de regeneração da cartilagem da última população progenitora em condições normais de oxigênio²⁴. Esses resultados otimistas in vitro mostram uma regeneração semelhante à hialina, incentivando mais experimentos in vivo. No entanto, ambas as populações de CPCs foram relatadas para reparar e regenerar eficientemente a cartilagem na OA e outros distúrbios osteocondrais em modelos animais^{25 , 26 , 27 , 28 , 29} .

Nosso laboratório tem contribuído ativamente para padronizar as técnicas de isolamento de CPC e comparar suas características fenotípicas com condrócitos e MSCs. Este artigo fornecerá um protocolo detalhado explicando as etapas envolvidas no isolamento e cultura de células residentes na cartilagem, ou seja, condrócitos, FAA-CPCs e MCPs.

Protocolo

O protocolo foi aprovado e está em conformidade com os regulamentos e diretrizes apropriados do Comitê de Ética em Pesquisa (Comitê de Pesquisa e Ética). Após a obtenção do consentimento informado por escrito, as articulações tibiofemorais humanas são obtidas de pacientes com osteoartrite (OA) (escore radiológico de Kellgren-Lawrence 4)³⁰ que necessitam de artroplastia total do joelho como parte de seu tratamento. As articulações de pacientes com quaisquer sinais de tumores, infecções ou artrite inflamatória (como artrite reumatóide ou gota) foram excluídas do estudo. É garantido que todos os procedimentos sejam conduzidos em condições estéreis, aderindo aos protocolos laboratoriais padrão durante todo o processo experimental.

1. Obtenção de articulações tibiofemorais

1. Obter articulações do joelho (articulações tibiofemorais) de doadores humanos que necessitem de amputação acima do joelho como parte do tratamento ou daqueles com osteoartrite de grau IV³⁰ (evidência radiológica mostrando redução acentuada do espaço articular com esclerose condral) submetidos à substituição total do joelho.
   NOTA: Certifique-se de que o consentimento informado seja obtido dos pacientes seguindo os princípios da Declaração de Helsinque. Garantir a adesão às regras do Comitê de Ética e do Conselho de Revisão Institucional.
2. Exclua quaisquer articulações que apresentem sintomas de infecção ou inflamação.

2. Processamento de juntas colhidas

1. Coloque as articulações tibiofemorais colhidas em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em condições estéreis.
2. Prepare uma área estéril sob o capô, colocando uma almofada estéril. Transfira as juntas colhidas para a almofada.
3. Estabilize as articulações tibiofemorais seccionadas segurando o osso subcondral com a cartilagem voltada para cima.
4. Usando uma lâmina de bisturi (nº 22), colha aparas de cartilagem retangular das áreas sem suporte de peso para pacientes com OA dentro de 1-2 h após a obtenção da articulação.
5. Colha as seções de cartilagem de 8 mm x 10 mm da camada superficial para a camada mais profunda.
6. Lave as fatias de cartilagem com 1x solução de PBS e coloque-as em uma placa de Petri contendo 1-2 mL de meio DMEM simples.
7. Pique bem as fatias de cartilagem até um tamanho inferior a 1 mm x 1 mm x 1 mm com uma lâmina de bisturi (nº 22).
   NOTA: Certifique-se de que as fatias de cartilagem ou cartilagem picada não sequem; coloque-os em um meio de cultura ou PBS desprovido de soro.

3. Isolamento de condrócitos

1. Coloque a cartilagem picada em um frasco vertical T-25 contendo 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) com 0,15% de colagenase tipo II para digestão enzimática. Deixar o balão em repouso durante 12-14 h numa incubadora de CO₂ , garantindo condições de cultura normalizadas³¹.
   NOTA: Deve-se usar meio DMEM-F12 simples sem vestígios de soro, pois o soro inativa a ação enzimática.
2. Após a digestão durante a noite, transfira o meio contendo as células liberadas para um tubo de centrífuga fresco e estéril contendo um volume igual de DMEM-F12 + 10% de soro fetal bovino (FBS), usando um filtro de células para separar as células dos detritos. As células liberadas são os "condrócitos".
3. Centrifugue as células filtradas a uma velocidade de 1200 x g durante 5 minutos a 37 °C.
4. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Reconstitua o pellet obtido em 1 mL de meio e conte as células viáveis liberadas usando um ensaio de exclusão de azul de tripano.
5. Carregue os condrócitos em um frasco T-25 a uma concentração de 10.000 células/cm² e expanda até o número de passagem necessário usando DMEM-F12 contendo 10% de FBS. Componentes adicionais no meio incluem ácido ascórbico (62 μg/mL), L-glutamina (2,5 mM/L), penicilina-estreptomicina (100 UI/mL) e anfotericina-B (2 μg/mL).
6. Atualize o meio a cada 3 dias e colha as células em subconfluência usando 0,125% de tripsina contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

4. Isolamento de condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs)

1. 12 h antes da liberação dos condrócitos, prepare 10 mL de 1x PBS contendo 1 mM de MgCl₂ (10 μL) e 1 mM de CaCl₂ (10 μL) e 100 μL de Fibronectina (10 μL/mL)³².
2. Cubra o número necessário de poços de uma placa de 6 poços (1,5 mL / 9,3 cm²) usando a solução preparada.
3. Feche bem a placa e leve à geladeira durante a noite a 4 °C.
4. Além disso, obtenha aparas de cartilagem de maneira semelhante à explicada para o isolamento de condrócitos (etapas 2.1-2.5).
5. Submeter as aparas de cartilagem a digestão enzimática sequencial durante a noite (0,2% de Pronase por 3 h; seguida de 0,04% de colagenase tipo II por 12 h) em banho-maria agitado mantido a 37 ° C para obtenção de condrócitos individuais.
6. No dia seguinte, remova a placa de 6 poços revestida com fibronectina da geladeira e remova o excesso de fibronectina.
   NOTA: O excesso de fibronectina deve ser removido lenta e suavemente, sem perturbar o revestimento no fundo do poço. A presença de MgCl₂ (10 μL) e 1 mM de CaCl₂ é crucial para garantir a fixação das células.
7. Adicione 2-3 mL de meio DMEM-F12 simples nos poços revestidos.
8. Semeie os condrócitos liberados nos poços revestidos a uma densidade de carga de 4000 células/poço e deixe a placa intacta por um período de 20 min.
9. Após a incubação, remova o excesso de meio e as células não aderentes. Adicione 2-3 mL de meio de crescimento padrão usado para condrócitos (DMEM-F12 + 10% FBS).
10. Manter as células aderentes em condições de cultura padrão por 10-12 dias para obter clones de CPC (colônias de >32 células).
11. Isolar usando 0,125% de tripsina-EDTA por 180 s, recolocar os clones em uma proporção de 1 clone / 5 cm² e expandir os CPs policlonais enriquecidos para a confluência necessária. Essas células obtidas são chamadas de "FAA-CPCs".
12. Cultive as células em meio DMEM-F12 + 10% FBS + fator de crescimento transformador beta 2 (TGFβ2: 1 ng/mL) + fator de crescimento de fibroblastos (FGF2: 5 ng/mL).
    NOTA: A incubação das células em placas revestidas com fibronectina não deve exceder 20 min, pois os condrócitos também podem começar a aderir. Durante o período de adesão de 20 minutos, o meio deve ser desprovido de soro. Em seguida, as células que aderem aos clones de forma devem ser cultivadas em um meio contendo adicionalmente FBS. Os clones devem ser isolados somente depois de garantir que cada clone tenha mais de 32 células; Isso é para evitar amplificadores de trânsito. A expansão adicional dos clones após a tripsinização deve incluir os fatores de crescimento adicionais mencionados. Uma densidade de carga de 4000 condrócitos/9,3^cm2 de uma placa revestida com fibronectina, após uma incubação de 20 minutos seguida de uma lavagem, resulta na adesão de 80-100 células no total. Destes, cerca de 20 clones progredirão para crescer e atingir uma duplicação da população de 5 em 10-12 dias.

5. Isolamento de condroprogenitores migratórios

1. Raspe os explantes de cartilagem (10 mm x 5 mm x 1 mm) da articulação articular colhida e coloque-os em uma placa estéril de 6 poços contendo meio DMEM-F12 com 10% de FBS e 10 mM de Glutamax (2-3 explantes/poço)³³.
2. Deixar a placa com os explantes intacta durante 48 h numa incubadora de CO₂ mantida a 37 °C.
3. Após 2 dias, transfira os explantes para um tubo de centrífuga contendo 10 mL de solução de colagenase a 0,1% para digestão enzimática. Incubar o tubo a 37 °C durante 2 h.
   NOTA: Os explantes precisam ser enxaguados com 1x PBS antes da digestão enzimática, pois vestígios de soro podem inativar a ação enzimática. Para lavar, mergulhe os explantes em uma placa de Petri preenchida com 2-3 mL de 1x PBS; Isso também é para garantir a não contaminação com quaisquer condrócitos liberados. O manuseio dos explantes deve ser reduzido ao mínimo, e isso é para evitar estressar os progenitores que começaram a migrar.
4. Após a digestão, enxágue os explantes com 1x PBS e coloque-os de volta nos mesmos poços da placa contendo meio DMEM-F12 fresco com 10% de FBS e 10 mM de meio Glutamax.
5. Mantenha a placa em condições de cultura padrão na incubadora. Observe a migração de condroprogenitores nos dias subsequentes.
6. Ao atingir a subconfluência, colher os MCPs usando 0,125% de tripsina contendo EDTA.
7. Expanda os MCPs usando o meio de expansão padrão, que inclui DMEM-F12, que contém 10% de FBS e 10 mM de Glutamax.

6. Caracterização fenotípica de condrócitos, FAA-CPs e MCPs

1. Análise por citometria de fluxo (FACS)
   NOTA: As etapas a seguir são seguidas para a análise FACS dos grupos de células coletados.
   1. Tripsinize as células de acordo com o protocolo padrão usando 0,125% de tripsina e centrifugue a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obter o pellet celular.
   2. Descarte o sobrenadante, lave e suspenda novamente o pellet com 1x PBS.
   3. Transfira a suspensão para tubos rotulados para FACS.
   4. Divida a suspensão igualmente em dois tubos: um tubo 'não corado' que atua como controle (suspensão celular sem anticorpo) e tubos 'corados' que atuam como testes (suspensão celular com anticorpo).
   5. Siga a ficha técnica de anticorpos individuais/marcadores de cluster de diferenciação (CD) para coloração. Os anticorpos para comparação incluem CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (marcadores de expressão positiva); CD34-PE, CD45-FITC e CD14-FITC (marcadores de expressão negativa)^34,35; CD166-BB515 e CD146-PE (potenciais marcadores condrogênicos)^36,37.
      NOTA: Os marcadores de CD são sensíveis à luz. Para garantir que as etapas sejam feitas no escuro.
   6. Incubar a suspensão celular com anticorpo durante 30 min no escuro.
   7. Após a coloração, adicione 1 mL de 1x PBS aos tubos e centrifugue a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obter o pellet celular.
   8. Descarte três quartos do sobrenadante. Ressuspender o pellet no conteúdo sobrenadante restante por trituração suave.
   9. Prossiga para a análise FACS.

7. qRT-PCR

NOTA: a análise qRT-PCR da expressão gênica envolve a avaliação do colágeno tipo I (COL1A1), colágeno tipo X (COL10A1) e fator de transcrição relacionado a Runt (RUNX2) para expressão hipertrófica e SOX-9, Aggrecan (ACAN) e colágeno tipo II (COL2A1) para condrogênese.

1. Extraia o RNA dos grupos de células usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
2. Após a extração, avaliar a relação A₂₆₀/A₂₈₀ e a concentração de RNA.
3. Utilize 280 ng do RNA extraído para construir DNA complementar (cDNA).
4. Inicie qRT-PCR usando Sybr Green, cada reação contendo uma concentração final de 7 ng de cDNA em um termociclador.
5. Normalize a expressão relativa de mRNA de cada gene para o gene de manutenção de referência GAPDH (ΔCt).
6. Calcule a expressão relativa de cada gene usando a técnica ^2-ΔΔCt , comparando o valor de ΔCt de cada gene individual com o dos FAA-CPs (ΔΔCt) ³⁷ .

8. Diferenciação de múltiplas linhagens

NOTA: Os meios diferenciais disponíveis comercialmente induzem a diferenciação da trilinhagem em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas.

1. Para diferenciação adipogênica, sementes de células com densidade de carga de 1000 células/^cm2 em placa de cultura celular e cultivo em meio de diferenciação adipogênica (alteração do meio - uma vez em 3 dias) até uma subconfluência de 80% por 3 semanas.
2. Para diferenciação osteogênica e condrogênica, siga o sistema de cultura de pellets de 28 dias³⁸.
3. Centrifugue 0,5 x 10⁶ células a 400 x g por 12 min a 37 ° C para formar pellets e iniciar a diferenciação usando meio de diferenciação osteogênica e condrogênica.
4. Fixe, incorpore e corte os pellets para coloração confirmatória (etapa 9).

9. Coloração confirmatória

1. No caso de células de linhagem adipogênica, fixe as células com formalina tamponada, lave e core com Oil Red O (0,5%). Pinte os controles (cultivados em um meio DMEM padrão com 10% de FBS) também.
2. Observe ao microscópio e adquira as imagens.
3. Para as células de linhagem osteogênica diferenciada, corar com Vermelho de Alizarina (2%).
   NOTA: Vários protocolos de coloração confirmatória são aplicáveis para as células condrogênicas diferenciadas.
4. Coloração Alcian Blue: Manchar as células fixas com azul Alcian por 5 min e contra-corar com Vermelho Neutro.
5. Para avaliar o conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG), faça a coloração com Safranina O: Pinte as lâminas com Hematoxilina de Ferro de Wiegert seguida de incubação subsequente com álcool ácido (1%), solução verde rápida (0,05%), ácido acético (1%) e solução de Safranina O (1%).
6. Coloração com azul de toluidina: Manchar as lâminas com azul de toluidina (0,1%) por 5 min.
7. Coloração PicroSirius Red: Manchar as lâminas com Picrosirius Red (0,1%) e contra-corar com corante Hematoxilina.
   NOTA: Após a coloração, desidrate as lâminas com álcool graduado e limpe com xileno. Monte as lâminas usando o montante Dibutilftalato Poliestireno Xileno (DPX), observe-as ao microscópio e adquira imagens.
8. Para a coloração imuno-histoquímica (colágeno tipo II) do pellet diferenciado condrogênico, submeta as seções do pellet à recuperação enzimática do antígeno usando as enzimas pronase (1 mg/mL) e hialuronidase (2,5 mg/mL).
9. Incube as seções com anticorpo monoclonal primário anticolágeno tipo II de camundongo, seguido por anticorpo anti-camundongo de cabra marcado com HRP secundário 1:250.
10. Pinte as lâminas com cromogênio de 3,3′-Diaminobenzidina (DAB) e contra-core com hematoxilina.
11. Observe ao microscópio e capture imagens.

10. Determinação do conteúdo de GAG / DNA

1. Digerir os pellets diferenciados condrogénicos utilizando uma solução de papaína-cisteína a 65 °C durante 16 h.
2. Estimar a concentração de ADN utilizando o reagente Picrogreen³⁸ e adquirir a intensidade de fluorescência nos comprimentos de onda - excitação: 480 nm, emissão: 520 nm utilizando um leitor de placas ELISA.
3. Avaliar o teor total de GAG utilizando o método do corante azul de dimetilmetileno³⁸.
4. Meça a densidade óptica a 525 nm usando um leitor de placas ELISA.
5. Normalize os valores GAG para os valores de DNA e calcule a proporção total de GAG/DNA.

Resultados

A partir de 86,9 mg de fatias de cartilagem, observou-se um rendimento de células de condrócitos de 1,72 x 10⁵ células. Após o carregamento, os condrócitos aderem prontamente, apresentando uma aparência inicial de paralelepípedos arredondados e transformando-se em um estado fibroblástico após a expansão adicional (Figura 1 A,B). A semeadura desses condrócitos em placas de fibronectina normalmente resulta em 2% de adesão, com cada célula passando por crescimento clonal (Figura 2 C, D), atingindo uma duplicação populacional de 5 nos dias 10-12 (32 células / clone). Os clones dentro da área de 10 cm² são combinados e expandidos até a passagem necessária para a produção de FAA-CPs. Os explantes de cartilagem, mantidos em cultura após a incubação da colagenase, exibem soltura da matriz extracelular, e a migração é geralmente observada já no^7º dia (Figura 2E). Tanto os FAA-CPs quanto os MCPs exibem uma estrutura fusiforme, uma característica comumente associada aos BM-MSCs, adquirindo uma estrutura semelhante a um favo de mel antes da confluência (Figura 1E, F).

Os três tipos de células isoladas, ou seja, condrócitos, FAA-CPs e MCPs, são monitorados de perto usando imagens de contraste de fase. Os FAA-CPs são transferidos somente após a confirmação de cinco duplicações populacionais.

A caracterização fenotípica das células isoladas e expandidas normalmente inclui análise de citometria de fluxo para marcadores putativos de condrogênese, ou seja, CD146 e CD166, bem como análise de expressão gênica para marcadores de condrogênese (SOX-9, ACAN, COL2A1), o marcador de fibrocartilagem COL1A1 e marcadores de hipertrofia (RUNX2 e COL10A1). Todos os três grupos de células exibem alta expressão (>95%) de CD105, CD73 e CD90; expressão baixa a negativa de CD34 e CD45; e alta expressão (>98%) de CD166, com expressão moderada e dependente de doador de CD146 (40%-75%) (Figura 2A).

Os resultados de qRT-PCR mostram expressão comparável e alta de SOX-9, ACAN e também COL1A1, um marcador de fibrocartilagem, pois as células são cultivadas antes da avaliação (Figura 2B). Para confirmação da condrogênese, a captação positiva de complexos laranja-vermelho nas áreas contendo GAG após Safranina O e complexos azulados a arroxeados após Azul de Alcian e Azul de Toluidina é observada em todos os grupos de células, com maior proporção nos grupos FAA-CP e MCP. A análise imuno-histoquímica dos pellets diferenciados condrogênicos para colágeno tipo II mostra captação fibrilar acastanhada nos três grupos (Figura 3). Além disso, a análise de GAG/DNA também mostrou confirmação da diferenciação condrogênica com os grupos FAA-CP exibindo maior expressão (Figura 2C).

Figura 1: Isolamento e caracterização de condrócitos e condroprogenitores. O algoritmo do estudo descreve o isolamento de três grupos de células e suas características morfológicas sob um microscópio de contraste de fase imediatamente após o isolamento e após alguns dias de expansão. (A) Os condrócitos recém-isolados se ligam às culturas aderentes durante os primeiros dias da cultura, adquirindo uma aparência fibroblástica com maior expansão (B). (C) Os condrócitos submetidos a um ensaio de adesão à fibronectina apresentam crescimento clonal, atingindo uma população que dobrou de 5 no dia 10 (D). (E) Os condroprogenitores migram da borda do explante no dia 10 da cultura e exibem um padrão de crescimento em forma de fuso com expansão adicional (F). Ampliação da imagem de contraste de fase: 10x; Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Dados de caracterização molecular. (A) Análise de citometria de fluxo para marcadores MSC positivos e negativos e potenciais marcadores de condrogênese. (B) Dados de expressão de RT-PCR para os três grupos de células para análise da expressão gênica de marcadores condrogênicos e hipertróficos. (C) Análise total de GAG / DNA dos pellets diferenciados condrogênicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Coloração confirmatória após diferenciação condrogênica. Safranina O e análise imuno-histoquímica para colágeno tipo II entre os três grupos celulares. Barras de escala: para ampliação de 10x, 50 μm; Ampliação de 40x, 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O potencial de regeneração da cartilagem articular, contendo tecido hialino, pode ser alcançado através da otimização de seus dois tipos de células nativas: condrócitos e condroprogenitores. Embora uma extensa pesquisa sobre condrócitos tenha fornecido informações valiosas sobre seu papel no reparo da cartilagem, questões sobre a natureza do tecido regenerado levaram a esforços para melhorar seu fenótipo e explorar terapias alternativas³. Os condroprogenitores, identificados como uma subpopulação celular relativamente recente, mostram-se promissores devido às suas propriedades mesenquimais inerentes, condrogênese aumentada e características hipertróficas limitadas¹². As duas técnicas primárias para colher e aumentar os progenitores envolvem adesão diferencial de fibronectina e ensaio de explante baseado em migração^18,32. O isolamento de FAA-CPs humanos também foi descrito usando tecido meniscal, relatando alto potencial proliferativo e multipotente ^16,17. Estudos de caracterização in vitro comparando FAA-CPs e MCPs com condrócitos indicam um potencial superior para FAA-CPs e MCPs exibirem fenótipos condrogênicos mais altos e hipertróficos mais baixos, refletindo um perfil favorável com aumento do acúmulo e produção de GAG 15,24,31,39. Estudos in vivo limitados sugerem que os condroprogenitores podem atenuar a progressão da osteoartrite e demonstrar resultados benéficos no reparo de defeitos osteocondrais quando usados em conjunto com bioscaffolds. Nos últimos anos, esforços significativos de pesquisa foram feitos para aprimorar e descobrir todo o potencial dos condroprogenitores.

Este artigo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de células residentes na cartilagem. As células primárias e mais comuns liberadas da cartilagem são os condrócitos. No entanto, a cartilagem digerida enzimaticamente é uma população heterogênea de células que contém não apenas condrócitos, mas também progenitores em uma concentração muito baixa, o que requer enriquecimento em condições in vitro .

Observando evidências circunstanciais indicando o envolvimento dessas células na condução do crescimento aposicional, Dowthwaite et al. empreenderam o isolamento e caracterização de condroprogenitores. Esses progenitores foram derivados da camada superficial da cartilagem articular por meio da utilização de um ensaio de adesão de fibronectina¹⁰. Essa população distinta foi extraída de bezerros fetais por meio de um processo envolvendo adesão seletiva à fibronectina. Demonstrou-se que possui flexibilidade fenotípica e alta capacidade de formação de colônias, juntamente com a expressão do gene seletor de destino celular Notch-1. Além dessas investigações iniciais, a caracterização de progenitores da cartilagem articular humana revelou níveis elevados de expressão de SOX9 e Notch1, preferência por CD49e/CD29 e aumento da atividade da telomerase em comparação com condrócitos maduros^12,32. Esse protocolo também foi estabelecido no tecido cartilaginoso humano osteoartrítico, com relatos mostrando sua presença não apenas na cartilagem superficial, mas também nas camadas mais profundas da cartilagem, com muitos grupos empregando culturas policlonais a culturas monoclonais^11,12.

Por outro lado, Koelling et al. investigaram o potencial envolvimento de condroprogenitores no homing e na migração em resposta à lesão da cartilagem, contribuindo assim para o reparo tecidual¹⁸. Além disso, Seol et al. demonstraram que, em resposta à lesão da cartilagem, os progenitores exibiram aumento da migração através da proteína Box 1 do Grupo de Alta Mobilidade (HMGB1) e quimiotaxia mediada por RAGE¹⁹. Elsaesser et al. também observaram a capacidade migratória superior dos condroprogenitores nasais em comparação com os condrócitos e as BM-MSCs²². Um estudo conduzido por Joos et al. descobriu que a liberação do Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas-BB (PDGF-BB) e do Fator de Crescimento Semelhante à Insulina 1 (IGF-1) aumentou a migração de condroprogenitores, enquanto a Interleucina 1 beta (IL-1β) e o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNFα) inibiram o movimento do progenitor após a lesão⁴⁰. Foi realizado um relatório recente comparando quatro métodos diferentes de isolamento de MCP em termos de seus métodos de isolamento e condições de cultura, e o método recomendado é explicado neste artigo³³. A abordagem de isolar progenitores com base em suas capacidades migratórias resultou em células que não apenas exibiam um alto potencial condrogênico, mas também exibiam características semelhantes às células-tronco mesenquimais.

No laboratório, seguindo protocolos padronizados, foi alcançado um isolamento bem-sucedido de todos os três subtipos. Além disso, estudos comparativos pioneiros demonstraram os atributos superiores dos FAA-CPs em comparação com os condrócitos 12,15,41. Comparações entre condroprogenitores também foram exploradas, revelando que os MCPs exibem maior potencial²⁴. Deve-se ter em mente que, uma vez que os três subtipos são isolados do mesmo tecido e o progenitor em sua forma nativa é muito baixo em sua presença na liberação inicial da cartilagem articular - que contém principalmente condrócitos - há necessidade de enriquecê-los usando culturas in vitro.

Os métodos de avaliação abrangentes abrangeram Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS), Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa (RT-PCR), análise microscópica eletrônica, estudos de titulação de fatores de crescimento, técnicas de marcação celular, imunoperfil e avaliação de seu potencial terapêutico para o tratamento de osteoartrite e defeitos condrais usando modelos in vivo 12,24,42.

Os achados atuais indicam que o isolamento de todos os três subtipos é viável mesmo em articulações osteoartríticas, embora exija um tempo de expansão prolongado. Notavelmente, enfatizamos a importância de evitar a adição de fatores de crescimento durante o crescimento clonal, destacando a necessidade crucial de introduzir fatores adicionais durante a expansão dessas células. Etapas cruciais, como o momento da incubação em placas revestidas com fibronectina, a adição de fatores de crescimento em diferentes momentos e o manuseio mínimo de explantes, entre outros itens essenciais mencionados, desempenham um papel significativo na cultura e expansão das células colhidas. Também é essencial garantir que as células atinjam uma confluência não superior a 75% -80% em um determinado momento.

O potencial dos condroprogenitores tem atraído um interesse significativo devido à sua superioridade sobre as terapias baseadas em células comumente usadas no campo do reparo da cartilagem, ou seja, BM-MSCs e condrócitos. Esses progenitores se mostram promissores, com vários experimentos in vivo demonstrando sua eficiência na substituição do padrão atual de atendimento. Como um subconjunto recentemente descoberto, a caracterização e as informações sobre seu fenótipo ainda estão em andamento, com o primeiro ensaio clínico usando FAA-CPs para o tratamento de defeitos condrais programado para começar em 2024. Assim, o isolamento e a expansão de células derivadas da cartilagem, particularmente condroprogenitores, são cruciais e promissores para o reparo baseado em células no campo da regeneração da cartilagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
22-lâmina de bisturi;	PLACA DE VIDRO
DE 6 poços	CORNING	3516
Alcian Blue	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Alizarin Red	SIGMA	130223
Anfotericina B (2 μ g/mL).	GIBCO	15240062
Ácido ascórbico (62 μ g/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC CytoFLEX LX citômetro de fluxo	Software BECKMAN COULTER	CYTExpert Versão 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH&	nbsp; C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE
CD106-APC	BD BIOSCIENCE
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE
CD29-APC	BD BIOSCIENCE
CD34-PE	BD BIOSCIENCE
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC&	nbsp; MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE
CD73-PE	BD BIOSCIENCE
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Contador	de células DE NOVIX	Cell Drop BF
Filtro de células	HIMEDIA	TCP024
Centrífuga	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
Incubadora CO2	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Colágeno tipo X (COL10A1), fator de transcrição relacionado a Runt (RUNX2), Fator de Transcrição SRY-Box 9 (SOX-9), Agrecan (ACAN) e Colágeno tipo II (COL2A1)	EUROGENTEC, BÉLGICA
Colagenase tipo II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
Leitor de placas ELISA	MOLECULARES	Leitor SpectraMax i3x Fast
Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Fetal Soro Bovino	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectina (10 µ L/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
Sistema de síntese de primeira fita	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxilina	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
Óleo Vermelho O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	Termociclador Quantstudio 12K Flex
Penicilina-estreptomicina (100 UI/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Anticorpo primário (colágeno de camundongo tipo II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagente	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Refrigerador	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Anticorpo secundário (Anticorpo IgG Anti-Camundongo de Cabra, conjugado HRP)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Banho-maria agitador	REMI
StemPro	GIBCO	1007201, A1007001 e A1007101
T-25	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Azul	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGFβ	ABCAM	ab277760
Cultura de Tecidos Petrídish	TARSONS	960010
Azul de Toluidina	QUALIGENS	2040
Azul de Triphan	GIBCO	15250061
Tripsina EDTA	GIBCO	25200072