As células cerebelares de Purkinje (PCs) são particularmente sensíveis a deficiências na resposta a danos no DNA. Um protocolo é apresentado para a avaliação visual da dinâmica da resposta do PC ao dano ao DNA, que envolve a coloração de cadeias de poli(ADP-ribose) ligadas a proteínas dentro de culturas organotípicas cerebelares.
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Artigo de método
Visualizando a resposta ao dano do DNA em células de Purkinje usando culturas organotípicas cerebelares
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células cerebelares de Purkinje (PCs) exibem uma interação única de altas taxas metabólicas, arquitetura específica da cromatina e extensa atividade transcricional, tornando-as particularmente vulneráveis a danos no DNA. Isso requer uma resposta eficiente ao dano ao DNA (DDR) para prevenir a degeneração cerebelar, muitas vezes iniciada por disfunção ou perda do PC. Um exemplo notável é a síndrome de instabilidade do genoma, ataxia-telangiectasia (A-T), marcada por depleção progressiva do PC e deterioração cerebelar. Investigar os mecanismos de DDR em PCs é vital para elucidar os caminhos que levam à sua degeneração em tais distúrbios. No entanto, a complexidade de isolar e cultivar PCs in vitro há muito dificulta os esforços de pesquisa. As culturas organotípicas (fatias) cerebelares murinas oferecem uma alternativa viável, imitando de perto o ambiente de tecido in vivo . No entanto, este modelo é restrito a indicadores DDR passíveis de imagens microscópicas. Refinamos o protocolo de cultura organotípica, demonstrando que a imagem fluorescente de cadeias de poli(ADP-ribose) (PAR) ligadas a proteínas, um indicador de DDR rápido e precoce, revela efetivamente a dinâmica de DDR em PCs dentro dessas culturas, em resposta ao estresse genotóxico.
Introdução
A integridade do DNA celular está constantemente sob ameaça de agentes prejudiciais ao DNA, predominantemente subprodutos metabólicos como espécies reativas de oxigênio, que infligem dezenas de milhares de lesões de DNA por célula diariamente1. A manutenção persistente da estabilidade do genoma é essencial para a homeostase celular 2,3. A pedra angular dessa manutenção é a resposta a danos no DNA (DDR) - uma intrincada rede de sinalização em camadas que inicia vias específicas de reparo do DNA enquanto ajusta cuidadosamente muitos outros processos celul....
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Protocolo
Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre materiais, equipamentos e anticorpos. Os procedimentos em animais foram empregados de acordo com as diretrizes éticas do Comitê de Ética da Universidade de Tel Aviv após a aprovação. O procedimento é realizado em filhotes de camundongos de 10 dias, independentemente do sexo. Se necessário, a genotipagem é realizada no dia anterior usando uma biópsia de cauda e métodos padrão. As soluções são estéreis e conservadas a 4 °C, salvo indicação em contrário; ver Tabela 1.
1. Preparação das culturas
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Resultados
A Figura 1 ilustra a aparência geral das culturas organotípicas cerebelares. A linha superior da Figura 1A mostra a foliação cerebelar, que é mantida em cultura, enquanto a linha inferior mostra os PCs corados para Calbindina D-28k (verde) e os núcleos neuronais corados para NeuN (vermelho). Na Figura 1B, os astrócitos nos PCs (vermelho) são corados para GFAP (verde), uma proteína intermediária do tipo III do filamento.
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Discussão
Observações na generalidade
A principal vantagem do sistema de cultura organotípica é que ele facilita os estudos usando o tecido do córtex cerebelar, preservando sua organização estrutural por várias semanas na configuração da placa de cultura. Este sistema é útil para a realização de análises morfológicas aprofundadas de células de Purkinje (PCs), incluindo exames detalhados de espinhas dendríticas e características ultraestruturais 52,53,54,55,56,57,58,59.
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados a este estudo.
Agradecimentos
O trabalho em nosso laboratório é apoiado pela Fundação de Pesquisa Médica Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson e pela Associação Israelense de Combate à Doença A-T.
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Materiais
Anticorpos
íris GIBCO Espátula de íris de pele
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente e Equipamento | |||
| 150 x 30 cm Placa de Petri | Corning Inc. | 3261 | |
| Placa de Petri de 35 x 10 mm | Corning Inc. | 3294 | |
| Acetona | Invitrogen | 25030081 | |
| Acetona | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| Lâminas adesivas para microscópio | Marienfeld | 48187 | 76 x 26 x 1 mm |
| Lâminas para chopper | TED PELLA | Modelo TC752-1 | Lâminas de barbear estilo |
| BME | GIBCO | 41010-026 500ml. | Sem L-Glut |
| Inserções de cultura de células | Millipore | PICM0RG50 | |
| D-Glucose | Biological Indo. | 02-015-1A | |
| HBSS sem fenol vermelho | Sigma-Aldrich | H-1138-500L | Sem Ca+, Sem Mg+ |
| HBSS com vermelho de fenol | Sartorius | 02-015-1A | |
| Soro de cavalo | Pinça de | inativada por calor | 26050088 |
| CellPath | GZX-0100-00A | serrilhada romba de 130mm | |
| F.S.T | 10092-12 | ||
| L-Glutamina (200 mM) | Gibco | 41010026 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 322412-1L | |
| Microscópio Sigma-Aldrich | G5767 | ||
| Olympus | |||
| Meio de Montagem sem | GRIGENE. Ltd, Israel | K239320A | |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 856177-250MG | Dicloreto de paraquat (Metil viologênio) |
| PARG- Poli(ADP-Ribose) Inibidor da glicohidrolase | Tocris Bioscience, Reino Unido | PDD 00017273 | sensível à luz |
| Tampão fosfato | Biological Indo. | 02-018-1A | |
| Tesoura, tecido | |||
| Placas de seis poços | Corning incorporated | CLS3516 | |
| Discos de Corte de Reposição | TED PELLA | Modelo 10180-01 | |
| Cortador de tecidos | McIlwain | Modelo TC752 | 10180-220 |
| Pinças, pontiagudas | |||
| Copos urinários | |||
| Alexa fluor 488 burro anti Coelho IgG | Invitrogen | A21206 | 1:500; secundário ab; Tampão de diluição secundário; Incubação por 2 h em temperatura ambiente |
| Prótien ácido fibrilar antiglial | Miliphore | MAB3402 | 1:1500; ab primário; bloqueio; Host:mouse |
| Anti-calbindin-D-28K | Swant | CB300 | 1:2000; ab primário; bloqueio; hospedeiro: rabbit |
| Anti-calbindina-D-28K | Swant | CB-38a | 1:2000; abdominais primários; bloqueios |
| Reagente anti-pan-ADP-ribose | Milliphore | MABE1016 | 1:800; ab primário; bloqueio; incubação por 2 h à temperatura ambiente |
| DAPI (dicloridrato de 4',6-diamidina-2'-fenilindol) | Sinalização celular | 4084 | 1:1000; tampão de diluição secundário; incubação por 20 min em temperatura ambiente |
Referências
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (....
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Reimpressões e permissões
