Artigo de método

Visualizando a resposta ao dano do DNA em células de Purkinje usando culturas organotípicas cerebelares

DOI:

10.3791/67167

⸱

27 de dezembro de 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células cerebelares de Purkinje (PCs) são particularmente sensíveis a deficiências na resposta a danos no DNA. Um protocolo é apresentado para a avaliação visual da dinâmica da resposta do PC ao dano ao DNA, que envolve a coloração de cadeias de poli(ADP-ribose) ligadas a proteínas dentro de culturas organotípicas cerebelares.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células cerebelares de Purkinje (PCs) exibem uma interação única de altas taxas metabólicas, arquitetura específica da cromatina e extensa atividade transcricional, tornando-as particularmente vulneráveis a danos no DNA. Isso requer uma resposta eficiente ao dano ao DNA (DDR) para prevenir a degeneração cerebelar, muitas vezes iniciada por disfunção ou perda do PC. Um exemplo notável é a síndrome de instabilidade do genoma, ataxia-telangiectasia (A-T), marcada por depleção progressiva do PC e deterioração cerebelar. Investigar os mecanismos de DDR em PCs é vital para elucidar os caminhos que levam à sua degeneração em tais distúrbios. No entanto, a complexidade de isolar e cultivar PCs in vitro há muito dificulta os esforços de pesquisa. As culturas organotípicas (fatias) cerebelares murinas oferecem uma alternativa viável, imitando de perto o ambiente de tecido in vivo . No entanto, este modelo é restrito a indicadores DDR passíveis de imagens microscópicas. Refinamos o protocolo de cultura organotípica, demonstrando que a imagem fluorescente de cadeias de poli(ADP-ribose) (PAR) ligadas a proteínas, um indicador de DDR rápido e precoce, revela efetivamente a dinâmica de DDR em PCs dentro dessas culturas, em resposta ao estresse genotóxico.

Introdução

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A integridade do DNA celular está constantemente sob ameaça de agentes prejudiciais ao DNA, predominantemente subprodutos metabólicos como espécies reativas de oxigênio, que infligem dezenas de milhares de lesões de DNA por célula diariamente1. A manutenção persistente da estabilidade do genoma é essencial para a homeostase celular 2,3. A pedra angular dessa manutenção é a resposta a danos no DNA (DDR) - uma intrincada rede de sinalização em camadas que inicia vias específicas de reparo do DNA enquanto ajusta cuidadosamente muitos outros processos celulares 4,5. Os déficits na DDR são comumente manifestados como 'síndromes de instabilidade do genoma', marcadas por instabilidade cromossômica, deterioração progressiva do tecido, crescimento ou desenvolvimento prejudicado, predisposição ao câncer e sensibilidade aumentada a determinados agentes que danificam o DNA 6,7,8,9. Notavelmente, a neurodegeneração, que muitas vezes inclui atrofia cerebelar, é uma característica distinta de muitas síndromes de instabilidade do genoma 7,10,11,12.

O distúrbio autossômico recessivo, ataxia-telangiectasia (A-T), é um exemplo bem documentado de um distúrbio de instabilidade do genoma 13,14,15. Essa condição surge de mutações nulas no gene ATM (A-T, mutado), responsável por codificar a proteína quinase principal, ATM, que é conhecida principalmente como mobilizadora de DDR em resposta a quebras de fita dupla de DNA (DSBs) 16 , 17 . A T-A se manifesta como um distúrbio multissistêmico, predominantemente caracterizado por degeneração cerebelar progressiva, levando a deficiências motoras agudas, imunodeficiência, atrofia gonadal, predisposição ao câncer e extrema sensibilidade à radiação ionizante. Células cultivadas de indivíduos com A-T apresentam instabilidade cromossômica e aumento da sensibilidade a agentes genotóxicos, especialmente aqueles causadores de DSBs 15,18,19. É importante ressaltar que o ATM também desempenha um papel no reparo de outras lesões de DNA, ressaltando sua ampla importância na manutenção da estabilidade do genoma 20,21,22.

Apesar da pesquisa minuciosa sobre os inúmeros papéis da ATM, o mecanismo específico que leva à degeneração cerebelar na A-T continua sendo um tópico de debate ativo, com vários modelos propostos para elucidar esse processo 23,24,25,26,27,28,29,30. Nosso modelo28 sugere que a degeneração cerebelar em pacientes com A-T começa com a disfunção e eventual perda de células de Purkinje (PCs). Considerando o papel crítico do ATM na preservação da estabilidade do genoma em face de danos contínuos ao DNA, os PCs são particularmente vulneráveis à ausência de ATM. Atribuímos essa vulnerabilidade à combinação de sua alta atividade metabólica, estrutura distinta da cromatina e extensa atividade transcricional. Em última análise, sugere-se que a perda da função do PC e, portanto, sua degeneração, é devido à inativação estocástica e funcional dos genes, uma consequência da produção de transcritos defeituosos28.

O estudo da biologia do PC em laboratório é impedido por desafios no cultivo de PCs isolados, pois essas células dependem fortemente de seu meio natural e das células vizinhas para sobrevivência e função, tornando-as incompatíveis com o crescimento dissociado da cultura. No entanto, os PCs podem permanecer viáveis por longos períodos em culturas de fatias de tecido. As culturas organotípicas cerebelares, que são fatias de tecido tipicamente derivadas de cerebelo de roedores, mantêm a organização estrutural do tecido e suportam várias manipulações experimentais análogas às possíveis com células cultivadas. Portanto, essas culturas permitem estudos cerebelares em um ambiente controlado 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Especificamente, no contexto de A-T, as culturas organotípicas cerebelares murinas provaram ser fundamentais na exploração do DDR em PCs deficientes em Atm 40,41,42,43. Embora os camundongos deficientes em Atm exibam apenas um fenótipo cerebelar sutil 44,45,46,47, presumivelmente devido a diferenças entre a fisiologia cerebelar humana e de camundongo, a suposição é que os papéis do ATM são amplamente conservados nessas espécies. Essa noção é apoiada por nossas observações de que a resposta deficiente a DSBs de DNA em PCs murinos Atm-/- se alinha com a observada em outros tipos de células murinas e humanas deficientes em ATM/Atm40,41,42,43.

Uma limitação na análise das respostas do PC a vários estímulos ou estresses em culturas organotípicas é a necessidade de confiar em imagens microscópicas para leituras. A DDR é geralmente estudada por meio de leituras bioquímicas em massa, embora marcadores imunofluorescentes comuns também sejam utilizados, como seguir a dinâmica de formação e resolução de focos nucleares de histona fosforilada H2AX (γH2AX) e da proteína 53BP1, que são considerados indicadores de DSBs48,49. Uma medida mais ampla é a imagem fluorescente da formação da cadeia de poli (ADP-ribose) (PAR) em proteínas, uma resposta rápida e robusta a danos precoces no DNA, particularmente a quebras de fita 7,50. Modificamos o protocolo de Komulainen et al.51 para coloração PAR em culturas organotípicas cerebelares. Observamos uma resposta PAR pronunciada nos núcleos consideráveis dos PCs. Apresentamos aqui nosso protocolo refinado para estabelecer culturas organotípicas cerebelares murinas e para visualizar a resposta PAR sob estresse genotóxico.

Protocolo

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Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre materiais, equipamentos e anticorpos. Os procedimentos em animais foram empregados de acordo com as diretrizes éticas do Comitê de Ética da Universidade de Tel Aviv após a aprovação. O procedimento é realizado em filhotes de camundongos de 10 dias, independentemente do sexo. Se necessário, a genotipagem é realizada no dia anterior usando uma biópsia de cauda e métodos padrão. As soluções são estéreis e conservadas a 4 °C, salvo indicação em contrário; ver Tabela 1.

1. Preparação das culturas

NOTA: Realize o procedimento em um ambiente estéril e desinfete a superfície de trabalho com antecedência usando etanol a 70%.

  1. Adicione 1 mL de BME a cada poço de placas de 6 poços. Usando uma pinça estéril, coloque uma única inserção de cultura de células em cada poço e incube as placas em uma incubadora a 37 ° C / 5% CO2 por um mínimo de 2 h antes do procedimento de dissecação.
  2. Configure uma área de dissecação dentro de uma capa biológica, contendo o picador de tecido, placas de cultura de 30 mm, um microscópio binocular e uma fonte de luz.
  3. Mergulhe as ferramentas cirúrgicas em etanol 70% durante todo o processo. Use um copo urinário cheio de etanol 70% para imersão e um copo urinário separado com 1x PBS para lavar o etanol antes de usar.
  4. Para cada dissecção (ou seja, para cada cerebelo), prepare duas placas de cultura de 30 mm cheias de meio de dissecção a frio e deixe-as no gelo.
  5. Pulverize o animal com etanol 70%.
  6. Usando uma tesoura afiada, decapite rapidamente o animal. Para expor o cérebro, faça uma pequena incisão com uma tesoura longe do cerebelo. Usando uma pinça com pontas arredondadas, retire suavemente o crânio. Remova o crânio em pequenos pedaços para evitar danificar o tecido cerebelar.
  7. Transfira imediatamente o cérebro para o meio de dissecção a frio ou remova diretamente o cerebelo de dentro do crânio. Para fazer isso, exponha o cerebelo e separe o córtex cerebelar do tronco encefálico, desconectando os três pares de pedúnculos, usando uma espátula de íris curva fina. Para identificar os pedúnculos, veja de rostral para caudal: os pedúnculos cerebelares superiores emparelhados conectam o mesencéfalo a cada lado do cerebelo; os pedúnculos cerebelares médios emparelhados conectam a ponte a cada lado do cerebelo; e os pedúnculos cerebelares inferiores emparelhados se conectam à medula de cada lado do cerebelo. Quando o cerebelo estiver visível, separe-o do cérebro usando a mesma espátula: deslize a espátula entre o cerebelo, o colículo superior e o tronco encefálico.
    NOTA: Não faça um esforço especial para remover as meninges, pois elas se desprendem facilmente após o cerebelo ser cortado.
  8. Ajuste o picador de tecidos para uma espessura de fatia de 350 μm.
  9. Antes de posicionar o cerebelo na base do picador, remova o excesso de tampão dissecante do tecido. Isso melhorará a adesão do tecido à base do picador.
  10. Posicione o cerebelo na plataforma de corte em uma orientação vertical e execute o corte parassagital com uma espessura de corte de 350 μm. Separe delicadamente as fatias usando uma espátula de íris fina e coloque-as em meio de dissecção a frio.
  11. Transfira o tecido fatiado de volta para um tampão de dissecção frio fresco. Use uma ponta de 1.000 μL para guiar delicadamente as fatias de tecido para o prato contendo tampão de dissecção a frio.
  12. Sob o binóculo, use duas espátulas de íris curvas para separar cuidadosamente as fatias de tecido uma da outra. Para culturas, use fatias derivadas do vermis cerebelar situado na zona corticonuclear medial do órgão.
  13. Transfira cada fatia de tecido para uma inserção de cultura usando uma espátula larga e mova cada inserção carregando uma fatia de tecido para um poço nas placas de 6 poços contendo o meio pré-aquecido. Deixe as placas na incubadora.
  14. Substitua o meio em dias alternados: aspire o meio usado usando uma pipeta de vidro estéril e, com uma pipeta sorológica de 5 mL, adicione 1 mL de MBE fresco com a ponta da pipeta encostada na parede do poço. Certifique-se de não direcionar o fluxo do meio para o tecido.
    NOTA: A fatia de tecido exibirá uma aparência semelhante a inflamação nos primeiros 5-7 dias em cultura e estará pronta para experimentos assim que esse fenômeno desaparecer e até 2 semanas após o estabelecimento da cultura.

2. Tratamento com agentes prejudiciais ao DNA, fixação, coloração e imagens microscópicas

  1. Adicionar produtos químicos que danificam o ADN directamente ao meio de cultura em concentrações finais adequadas, durante períodos pré-determinados. Após o período de exposição, remova os produtos químicos substituindo o meio por meio de cultura fresco.
  2. Se a leitura de DDR envolver coloração PAR, adicione um inibidor de poli(ADP-ribose) glicohidrolase (PARG) ao meio de cultura a uma concentração final de 10 μM, 30 min antes da fixação.
    NOTA: Este tratamento é crítico, pois a modificação do PAR é de curta duração e continuamente degradada pelo PARG.
  3. Imediatamente antes da fixação, aspirar o meio e substituí-lo por 1 ml de tampão fosfato 0,1 M à temperatura ambiente.
    NOTA: O tampão frio pode causar o descolamento das fatias de tecido da inserção.
  4. Fixar imediatamente as fatias substituindo o tampão por uma mistura pré-arrefecida (-20 °C) de acetona:metanol (1:1) de modo a que a fatia de tecido fique submersa nesta mistura e deixar repousar 20 min a -20 °C.
    NOTA: É possível parar nesta fase e prosseguir com a imunocoloração mais tarde. Para isso, lave os tecidos 3x com tampão fosfato 0,1 M pré-resfriado a 4 °C, certificando-se de que o tecido esteja submerso no tampão. Os tecidos podem ser armazenados agora em tampão fosfato 0,1M por até 2 semanas a 4 °C.
  5. Transfira a fatia de tecido para um poço em uma placa de 48 poços.
  6. Use um bisturi e uma tábua de corte para remover as margens da inserção, cortando ao redor da fatia de tecido. Coloque cada fatia em um poço de um prato de 48 poços. Adicione 100 μL de tampão fosfato 0,1 M.
  7. Para permeabilização, aspire o tampão, adicione ao poço 100 μL de tampão fosfato 0,1 M contendo 1% de Triton X-100 e deixe por 5 min em temperatura ambiente.
  8. Aspirar a solução e adicionar 100 μL de solução de bloqueio (ver Tabela 1) por alvéolo. Agite suavemente em temperatura ambiente por 2 h.
  9. Durante a etapa de bloqueio, diluir o anticorpo primário ou o reagente anti-PAR (1:800) na solução de bloqueio.
  10. Remova a solução de bloqueio (não há necessidade de lavar) e adicione 100 μL de mistura de anticorpos primários a cada poço. Aplique agitação suave por 2 h em temperatura ambiente.
  11. Dilua os anticorpos secundários em tampão fosfato 0,1 M contendo 0,2% de Triton X-100 (1:500), minimizando sua exposição à luz.
  12. Aspire a solução de anticorpo primário e lave as fatias 3 x 5 min com tampão fosfato 0,1 M contendo 0,2% de Triton X-100, à temperatura ambiente, agitando suavemente.
  13. Substitua a solução de lavagem por 100 μL de solução de anticorpos secundários (diluição 1:500). Continue agitando suavemente por 2 h em temperatura ambiente no escuro (cubra as placas com papel alumínio).
  14. Para preparar uma solução de DAPI, dilua a solução estoque (2 mg / mL) para 1 μg / mL em 1x PBS.
  15. Vinte minutos antes do final da incubação de 2 h com o anticorpo secundário, adicione 20 μL da solução final de DAPI a cada poço e continue agitando por 20 min. Aspire o líquido e lave com a solução de lavagem por 3 x 5 min com agitação suave.
  16. Para a montagem, coloque o tecido em uma lâmina de vidro de microscópio com o tecido voltado para cima, adicione o meio de montagem e cubra com um vidro de cobertura. Coloque as lâminas em uma superfície plana e deixe-as secar durante a noite no escuro, em temperatura ambiente (evite usar um meio de montagem contendo DAPI para evitar desfoque).
  17. Armazene as lâminas a 4 °C em uma caixa à prova de luz.
  18. Capture imagens microscópicas usando um microscópio confocal e filtros apropriados.

Resultados

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A Figura 1 ilustra a aparência geral das culturas organotípicas cerebelares. A linha superior da Figura 1A mostra a foliação cerebelar, que é mantida em cultura, enquanto a linha inferior mostra os PCs corados para Calbindina D-28k (verde) e os núcleos neuronais corados para NeuN (vermelho). Na Figura 1B, os astrócitos nos PCs (vermelho) são corados para GFAP (verde), uma proteína intermediária do tipo III do filamento. As Figuras 2 e 3 mostram a coloração PAR observada após o tratamento dessas culturas com dois agentes que danificam o DNA, ambos oxidantes fortes: bromato de potássio (uma concentração final de 10 mM por 12 h) e paraquat. A resposta PAR foi marcada nos PCs tratados no fólio cerebelar em comparação com o controle.

figure-results-1
Figura 1: Visão geral das culturas organotípicas cerebelares murinas. (A) A linha superior ilustra a foliação cerebelar, que é mantida na cultura. A linha inferior se concentra na camada do PC. Os PCs são destacados por Calbindin D-28k (verde). A coloração NeuN (vermelho) identifica núcleos neuronais através das camadas. (B) Um olhar mais atento aos PCs (vermelho). GFAP (verde), uma proteína de filamento intermediário tipo III, que destaca os astrócitos. Barras de escala = 968,8 μm (A, linha superior), 42,1 μm (A, segunda linha), 72,7 μm (B, linha superior), 18,2 μm (B, segunda linha). Abreviaturas: PC = células de Purkinje; GFAP = proteína glial fibrilar ácida; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Coloração PAR em fatia cerebelar tratada com bromato de potássio. A fatia cerebelar foi tratada com bromato de potássio (KBrO3) - um potente agente oxidante, na concentração final de 10 mM por 12 h. Barras de escala = 775 μm. Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Resposta PAR em fatias cerebelares expostas ao paraquat, um forte produtor de ânions superóxido. (A) Uma visão geral de um fólio cerebelar. Observe a resposta robusta do PAR, particularmente em PCs, em comparação com o controle. (B) Um exame mais detalhado mostra a resposta PAR em PCs e outros tipos de células. Barras de escala = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Soluções e buffers
Solução  Ingredientes
Meio de dissecçãoSolução salina balanceada de Hank (HBSS) contendo 0,5% de D-glicose. Adicione 0,5 mL de solução de D-glicose a 50% a 50 mL de HBSS sem Mg2+ e Ca2+.
Meio de cultura BMEMisture 100 mL de Basal Medium Eagle (BME) contendo vermelho de fenol, mas não L-glutamina ou HEPES, com 50 mL de HBSS com vermelho de fenol, 50 mL de soro de cavalo inativado pelo calor, 2 mL de D-glicose a 50% e 1 mL de L-glutamina 200 mM. Misture e filtre através de um filtro de 0,22 μm em um ambiente estéril. Conservar a 4 °C
Solução de bloqueio para imunocoloraçãoem 0,1 M Tampão fosfato: adicione 0,5% Triton X-100, 10% de soro de cabra
Tampão de diluição de anticorpos secundáriostampão do fosfato de 0,1 M, 0.2%Triton X-100
Tampão de lavagemtampão do fosfato de 0,1 M, 0.2%Triton X-100
Solução fixadoraActenoe: metanol (1: 1 v: v)
Solução de permeabilização0,1 M tampão de fosfato, 1% Triton X-100
Solução DAPISolução estoque (2 mg/mL) diluída a 1 μg/mL em 1x PBS
Tampão de fosfatoPrepare duas soulutions A e B (veja abaixo). Misture as soluções de acordo com as proporções especificadas abaixo para fazer tampão fosfato 0,2 M. Em seguida, dilua a solução 0,2M com DDW (1:1) para fazer tampão fosfato 0,1 M (solução de trabalho).
solução A (para 0,2 M)12 g de fosfato de sódio monobásico anidro (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL de DDW
Solução B (para 0,2 M)14,2 g de fosfato de sódio diabásico anidro (Na2HPO4 FW 141,96)
500 mL de DDW
Soluções mistas para fazer 0,2 MPrepare 1 L: 230 mL de solução A e 770 mL de solução B
Tampão fosfato 0,1 MDiluir a solução misturada com DDW (1:1)

Tabela 1: Soluções e sua composição.

Discussão

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Observações na generalidade
A principal vantagem do sistema de cultura organotípica é que ele facilita os estudos usando o tecido do córtex cerebelar, preservando sua organização estrutural por várias semanas na configuração da placa de cultura. Este sistema é útil para a realização de análises morfológicas aprofundadas de células de Purkinje (PCs), incluindo exames detalhados de espinhas dendríticas e características ultraestruturais 52,53,54,55,56,57,58,59. Nossas observações indicam que a resposta ao dano ao DNA (DDR) é notavelmente ativa em PCs dentro dessas culturas. No entanto, as principais limitações deste sistema incluem a duração limitada de seu uso e sua dependência de imagens microscópicas para monitorar os processos celulares, destacando a necessidade contínua de desenvolver ou adaptar técnicas de imagem adequadas.

Outra palavra de cautela refere-se à porção cerebelar que é dissecada para preparar as fatias de tecido. Observamos que diferentes lobos cerebelares podem produzir culturas com organização interna e qualidade geral marcadamente diferentes. Portanto, preferimos estabelecer culturas a partir de cortes obtidos por meio de cortes sagitais médios do vermis cerebelar. Nessas fatias, a folia do córtex cerebelar é convenientemente visível.

É aconselhável utilizar fatias de tecido obtidas do vermis cerebelar, que exibem a foliação característica do córtex cerebelar. Essas fatias mantêm sua estrutura organizacional na cultura por várias semanas. Além disso, recomenda-se iniciar os procedimentos experimentais com as culturas aproximadamente 7-12 dias após o estabelecimento. Um experimento típico projetado para avaliar a resposta a danos no DNA nessas culturas envolve o início do dano por irradiação ou pela adição de produtos químicos prejudiciais ao DNA ao meio de cultura. Posteriormente, a fixação e coloração do tecido são realizadas em vários intervalos de tempo. Para avaliar a recuperação de danos induzidos por produtos químicos, é incluído um período de incubação em meio fresco. É aconselhável iniciar experimentos de longo prazo na primeira oportunidade, idealmente cerca de 7 dias após o estabelecimento da cultura.

As culturas organotípicas cerebelares são mantidas em meio desprovido de antibióticos; assim, é imperativo manter um ambiente estéril durante o seu estabelecimento. A idade dos filhotes dos quais o cerebelo é colhido é crítica, com um intervalo recomendado de 9 a 12 dias. Essa faixa etária é ideal, pois o córtex cerebelar está suficientemente desenvolvido para seccionamento. Notavelmente, em animais mais velhos, os tecidos tendem a aderir à lâmina. É crucial manter o cerebelo imerso em uma solução de dissecção fria até ser dissecado.

Durante os 5-7 dias iniciais em cultura, os cortes de tecido podem apresentar sinais que lembram inflamação, caracterizados por inchaço e descoloração leitosa. Esses atributos podem afetar potencialmente a medição de parâmetros fisiológicos e a eficácia das técnicas de imunocoloração.

É altamente recomendável não cortar o cerebelo com espessura inferior a 350 μm para evitar inconsistência na espessura durante o corte. Lembre-se de que um tecido fatiado de 350 μm fica muito mais fino após 7 dias em cultura para cerca de 90 μm (com base na medição da pilha Z).

Aqui, introduzimos a coloração PAR 7,50 ao kit de ferramentas usado para investigar o DDR em PCs. Essa leitura é rápida, sensível e captura a natureza dinâmica do DDR, provando ser especialmente útil em nossa análise do DDR em PCs do tipo selvagem e deficientes em Atm. Os protocolos descritos aqui devem ser particularmente benéficos para pesquisadores que estudam síndromes de instabilidade genômica que afetam o cerebelo.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados a este estudo.

Agradecimentos

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O trabalho em nosso laboratório é apoiado pela Fundação de Pesquisa Médica Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson e pela Associação Israelense de Combate à Doença A-T.

Materiais

Anticorpos

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente e Equipamento
150 x 30 cm Placa de PetriCorning Inc.3261
Placa de Petri de 35 x 10 mmCorning Inc.3294
AcetonaInvitrogen25030081
AcetonaSigma-Aldrich270725-1L
Lâminas adesivas para microscópioMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Lâminas para chopperTED PELLAModelo TC752-1  Lâminas de barbear estilo
BMEGIBCO41010-026 500ml. Sem L-Glut
Inserções de cultura de célulasMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS sem fenol vermelhoSigma-AldrichH-1138-500LSem Ca+, Sem Mg+
HBSS com vermelho de fenolSartorius02-015-1A
Soro de cavalo Pinça deinativada por calor26050088
CellPathGZX-0100-00Aserrilhada romba de 130mm
F.S.T10092-12
L-Glutamina (200 mM)Gibco41010026
MetanolSigma-Aldrich322412-1L
 Microscópio Sigma-AldrichG5767
Olympus
Meio de Montagem semGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGDicloreto de paraquat (Metil viologênio)
PARG- Poli(ADP-Ribose) Inibidor da glicohidrolaseTocris Bioscience, Reino UnidoPDD 00017273sensível à luz 
Tampão fosfatoBiological Indo.02-018-1A
Tesoura, tecido
Placas de seis poçosCorning incorporatedCLS3516
Discos de Corte de Reposição TED PELLAModelo 10180-01
Cortador de tecidosMcIlwainModelo TC75210180-220
Pinças, pontiagudas
Copos urinários
Alexa fluor 488 burro anti Coelho IgG 
Invitrogen		A212061:500; secundário ab; Tampão de diluição secundário;   Incubação por 2 h em temperatura ambiente
Prótien ácido fibrilar antiglialMiliphoreMAB34021:1500; ab primário; bloqueio; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; ab primário; bloqueio; hospedeiro: rabbit 
Anti-calbindina-D-28KSwantCB-38a1:2000; abdominais primários; bloqueios 
Reagente anti-pan-ADP-riboseMilliphoreMABE10161:800; ab primário; bloqueio; incubação por 2 h à temperatura ambiente
DAPI (dicloridrato de 4',6-diamidina-2'-fenilindol)Sinalização celular40841:1000; tampão de diluição secundário; incubação por 20 min em temperatura ambiente
íris GIBCO Espátula de íris de pele

Referências

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