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Artigo de método

Processamento eficiente de células auxiliares foliculares T tonsilares e análise funcional por meio de citometria de fluxo de alta dimensão

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DOI:

10.3791/67188

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11 de julho de 2025

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1Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, 5Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para coleta e processamento de amostras de amígdalas, fenotipagem usando citometria de fluxo espectral de alta dimensão e realização de análises não supervisionadas.

Resumo

As células T foliculares auxiliares (Tfh) são um subconjunto de células T auxiliares CD4+ que auxiliam na troca de isotipo de células B, formação de centro germinativo (GC), hipermutação somática e maturação de afinidade, ajudando assim a orquestrar respostas imunes humorais adaptativas em tecidos linfóides secundários durante infecção, autoimunidade e vacinação. Compreender o desenvolvimento e a função das células Tfh é crucial para projetar vacinas eficazes e desenvolver estratégias de tratamento direcionadas para doenças que envolvem essa população. As células das amígdalas humanas são órgãos linfóides da mucosa acessíveis. Eles oferecem uma oportunidade única de traçar o perfil de populações imunes distintas, como células Tfh e GC, interrogar interações célula a célula, avaliar funções celulares dinâmicas e descobrir seus mecanismos regulatórios no nível do órgão. Além disso, as culturas in vitro de células de amígdalas são fáceis de processar e permitem a avaliação da biologia celular Tfh sob várias condições. Aqui, apresentamos um protocolo para coleta, isolamento, preservação e cultura de células de amígdalas humanas. Também descrevemos dois painéis de citometria de fluxo espectral otimizados projetados para caracterização aprofundada de células Tph. Por último, usando um tratamento com inibidor da proteína fosfatase 2A (PP2A) como exemplo, demonstramos a eficiência e o poder das análises não supervisionadas de dados de citometria de fluxo de alta dimensão, descobrindo efetivamente as diferenças induzidas pelo tratamento em uma escala de alta dimensão.

Introdução

As células T foliculares auxiliares (Tfh) são um subconjunto distinto de células T auxiliares CD4+ que são essenciais para a formação e função dos centros germinativos (GCs) e produção de anticorpos de células B. As células Tfh se originam de células T CD4+ virgens por meio de interações com células apresentadoras de antígenos e da integração de fatores intrínsecos e extrínsecos, incluindo sinalização de receptores de células T, interações coestimulatórias com células B, citocinas e quimiocinas1. As células Tfh expressam CXCR5 e PD-1, que orientam sua posição dentro ou perto do GC. BCL-6 é o fator de transcrição mestre crítico para o desenvolvimento, manutenção e função do Tfh 1,2. As células Tfh são fundamentais para a montagem de respostas imunes humorais, particularmente nas respostas vacinais e na defesa contra patógenos bacterianos e virais. Respostas anormais das células Tfh estão implicadas em vários distúrbios, incluindo doenças autoimunes, imunodeficiência e potencialmente algumas formas de câncer 3,4,5,6. Compreender sua função e regulação é, portanto, importante para o desenvolvimento de estratégias vacinais e terapêuticas eficazes7.

Em contraste com outras células T auxiliares CD4 + como Th1, Treg e Th17, para as quais os sistemas de diferenciação in vitro estão bem estabelecidos8, as células Tfh são mais complexas de estudar porque seu desenvolvimento envolve interações dinâmicas célula a célula e estruturas anatômicas especializadas7. Assim, os estudos de células Tfh têm se baseado amplamente na fenotipagem ex vivo de células Tfh circulantes periféricas humanas (cTfh) e modelos de camundongos in vivo . Investigar a regulação de moléculas específicas em células Tfh é, portanto, um desafio, particularmente para células Tfh humanas9. Assim, um estudo ex vivo aprofundado de células Tfh derivadas de tecidos linfóides é essencial para melhorar nossa compreensão das células Tfh humanas.

As amígdalas, como órgãos linfóides secundários, abrigam populações de células únicas que não estão presentes no sangue periférico, como células pré-Tfh (CXCR5intPD-1int CD4+) e GC-Tfh (CXCR5hiPD-1hi CD4+), ambas instrumentais na formação de GCs. Além disso, as amígdalas palatinas são alguns dos tecidos mais comumente removidos em cirurgias pediátricas e são facilmente acessíveis, tornando-as uma fonte inestimável de tecido humano para explorar mecanismos imunológicos complexos envolvendo células Tph. Por estarem situadas nas vias aéreas superiores, local primário de infecções virais respiratórias, as amígdalas oferecem um tecido vantajoso para investigar as respostas imunes a essas infecções virais. Por exemplo, nosso laboratório caracterizou anteriormente células Tfh em amígdalas e adenóides de crianças que convalesceram de COVID-19 e comparou esses tecidos com os de controles não infectados10. Aqui, descrevemos nosso protocolo para processar e armazenar células de amígdalas. Usando amígdalas tratadas com inibidores de PP2A como exemplo, detalhamos como caracterizar essas células por meio de citometria de fluxo espectral de alta dimensão e analisamos os dados usando análise não supervisionada.

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Protocolo

O Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque) foi seguido em todas as pesquisas humanas deste estudo. Amostras de amígdalas humanas foram obtidas de pacientes com hipertrofia adenotonsilar causando distúrbios respiratórios do sono ou apneia obstrutiva do sono, provenientes da Divisão de Otorrinolaringologia Pediátrica, Children's National Hospital, Washington, DC, EUA. Este estudo recebeu aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Children's National Hospital (protocolo IRB número 00009806). O consentimento informado foi assinado pelos pais ou responsáveis de todos os participantes inscritos, e o consentimento foi obtido dos participantes menores de idade com 7 anos ou mais.

1. Coleta de amígdalas humanas e isolamento e armazenamento de célula única

  1. Isolamento de células únicas tonsilares
    1. Coleta de peças cirúrgicas
      1. Obtenha amígdalas de pacientes submetidos a amigdalectomia e colete os pedaços de tecido fresco na sala de cirurgia em um tubo centrífugo de 50 mL preenchido com 25-35 mL de meio de amígdala estéril gelada: RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 0,05 mg/mL de gentamicina, 10 mM de glutamina e mistura antibiótica-antimicótica (100 unidades/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicilina, e 0,25 μg/mL de anfotericina B).
        NOTA: As amígdalas no meio acima podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite e processadas no dia seguinte. Perda mínima de viabilidade celular foi observada com armazenamento noturno versus processamento no mesmo dia (Figura 1A). As amígdalas também podem ser enviadas durante a noite no gelo.
    2. Processamento de amígdalas
      NOTA: Todos os meios, tampões e ferramentas cirúrgicas devem ser estéreis, e o isolamento das células das amígdalas deve ser realizado em gelo em uma capa de biossegurança.
      1. Colocar as amígdalas numa placa de cultura de células de plástico de 60 mm contendo 5 ml de meio de amígdalas refrigerado. Trabalhe no gelo. Usando uma pinça e tesoura estéreis ou um bisturi, remova cuidadosamente quaisquer coágulos sanguíneos, gordura e tecido conjuntivo visíveis (Figura 1B, C).
      2. Mova as amígdalas para uma nova placa de cultura de células de 60 mm com 5 mL de meio de amígdala gelado. Corte os pedaços de amígdala em fragmentos de 3-5 mm.
      3. Preparar uma nova placa de cultura de células de 60 mm com 10 ml de meio de amígdalas frias e colocar um coador de células de 70 μm na placa.
      4. Mova os fragmentos de amígdala para o filtro e esmague os fragmentos de amígdala usando a extremidade do êmbolo de uma seringa estéril de 3 mL através do filtro.
      5. Recolha o meio contendo células fora do filtro no prato e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
      6. Adicione mais 10 mL de meio amígdala ao prato com a peneira, esmague os fragmentos de amígdala com o êmbolo e colete o meio no tubo cônico. Para amígdalas grandes, repita esta etapa 2-3x mais até que apenas fragmentos de tecido conjuntivo sejam deixados no filtro. Coloque o tecido restante e as placas usadas em um saco de risco biológico e no lixo médico.
      7. Encha o tubo cônico de 50 mL até o topo com meio amígdala.
      8. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
        NOTA: Estender a centrifugação para 20 min pode aumentar o rendimento.
      9. Remova o sobrenadante aspirando ou pipetando cuidadosamente e ressuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) à temperatura ambiente (RT) para lisar os glóbulos vermelhos. Incube por 5 min em RT e, em seguida, adicione 35 mL de PBS resfriado para evitar lise adicional. Centrifugue a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
      10. Lave uma vez com 50 mL de PBS resfriado e centrifugue. Ressuspenda com 10 mL de PBS e estique as células através de um filtro de plástico de 70 μm. Contar células.
  2. Criopreservação de células tonsilares
    1. Prepare o meio de congelamento (90% de FBS inativado por calor e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO)).
      NOTA: Isso pode ser armazenado a 4 ° C por até 1 mês.
    2. Centrifugar a suspensão celular (passo 1.1.2.10) a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com meio de congelação.
      NOTA: Aconselhamos congelar as células a uma densidade de 10 × 106 a 50 × 106 células/mL de meio de congelamento11.
    3. Alíquota 0,5-1 mL da suspensão celular em criogeniais estéreis. Congele os frascos para injetáveis em recipientes de congelação com taxa controlada num congelador a -80 °C. Transfira os frascos para um tanque de armazenamento contendo nitrogênio líquido dentro de uma semana para preservação a longo prazo.
  3. Descongelamento de células congeladas
    NOTA: Uma abordagem de descongelamento por diluição sequencial referenciada a partir de um protocolo de preparação de amostra para sequenciamento de RNA de célula única é descrita abaixo12. Outros métodos de descongelamento também podem funcionar, mas encontramos maior viabilidade celular com essa abordagem em comparação com a colocação imediata das células no tampão de descongelamento quente (Figura 1D). O tampão de lavagem pode ser preparado com antecedência. O tampão de descongelamento é composto de tampão de lavagem mais 0,1 mg / mL de DNase I (DNase I deve ser adicionada imediatamente antes de iniciar o descongelamento). Aumentar o tempo de centrifugação para 1 min/mL (para tubos de 15 mL) é opcional para aumentar o rendimento da célula.
    1. Aquecer um banho-maria a 37 °C. Pré-aqueça o tampão de descongelamento e lavagem no banho-maria a 37 °C.
      NOTA: Todas as lavagens de células são realizadas em RT.
    2. Descongele os criotubos no banho-maria a 37 °C por 2-3 min imediatamente após a remoção do armazenamento. Evite submergir totalmente o frasco para injetáveis no banho-maria. Remova o frasco do banho-maria enquanto um pequeno cristal de gelo permanece visível.
    3. Transfira suavemente as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mL usando uma ponta de pipeta de orifício largo em uma capa de biossegurança. Enxágue o criogênico com 0,5 mL de tampão de descongelamento pré-aquecido e adicione o enxágue gota a gota (1 gota a cada 5 s) ao tubo cônico de 15 mL, agitando suavemente o tubo para misturar.
    4. Dilua as células sequencialmente no tubo cônico de 15 mL adicionando incrementalmente 2 mL e depois 4 mL de meio com ~ 1 min de tempo de espera entre as adições. Adicione o meio a uma taxa de 1 mL a cada 3-5 s ao tubo, girando suavemente para misturar.
    5. Centrifugar a 400 × g durante 5 min à RT.
    6. Remova o sobrenadante; ressuspender o sedimento celular em 300 μL de tampão de descongelamento; e incubar em RT por 5 min.
    7. Adicione 10 mL de tampão de lavagem (sem DNase I). Centrifugue novamente a 400 × g por 5 min em RT.
    8. Lavar mais uma vez: remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de tampão de lavagem. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a RT.
    9. Filtrar as células através de um filtro de 70 μm. Centrifugue novamente por 5 min a 400 × g em RT e conte as células. Ressuspender no meio de cultura.

2. Medição da expressão de citocinas intracelulares e fatores de transcrição após tratamento ex vivo

NOTA: Aqui, detalhamos nosso método para caracterização fenotípica de células Tfh tonsilares usando dois painéis de citometria de fluxo de alta dimensão. Dado que a atividade de PP2A é essencial para a expressão ideal da proteína BCL-6 e diferenciação de Tfh4, ilustramos nossa avaliação da manutenção e funcionalidade das células Tfh por meio do exame de células de amígdalas tratadas com o inibidor de PP2A cantaridina (CAN).

  1. Coloração por citometria de fluxo
    1. Coloração intracelular de citocinas
      NOTA: As incubações são realizadas no escuro. Reagentes, anticorpos e suas respectivas quantidades por poço utilizados em ambos os painéis estão listados na Tabela de Materiais. Para avaliar a degranulação das células T, o anticorpo anti-CD107a é adicionado durante a etapa de tratamento para minimizar os resultados falso-negativos causados por sua internalização13.
      1. A placa 2 × 10 células de6 amígdalas com 200 μL de meio de cultura (1 × 107 células/mL) em um poço de placa inferior U de 96 poços com as seguintes quantidades de inibidor de PP2A CAN por 16 h: controle do veículo, 3 μM e 6 μM.
        NOTA: O CAN foi reconstituído a 0,1 M com 1% de DMSO.
      2. Adicione monensina (0,7 μL / mL), brefeldina (1: 1.000), acetato de miristato de forbol (50 ng / mL, PMA), ionomicina (1.000 ng / mL) e 2 μL anti-CD107a a cada poço por 2,5 h em incubadora de CO 5%2 a 37 oC. O volume total de cultura é de 200 μL por poço.
      3. Centrifugue anticorpos de coloração a ~ 16.000 × g por 3-5 min a 4 ° C para remover agregados de anticorpos. Prepare a mistura de anticorpos de superfície para a etapa 2.1.1.8, que inclui todos os anticorpos de superfície, exceto os receptores de quimiocina, Brilliant Stain Buffer Plus e FACS buffer (volume de cada um anotado na Tabela de Materiais, total de 112 μL de mistura por reação).
      4. Depois de completar 2,5 h em cultura, lave as células 2x com 200 μL de PBS gelado, centrifugando a 400 × g por 2 min a 4 ° C. Entre as lavagens, descarte o sobrenadante invertendo rapidamente a placa. Realize a coloração na mesma placa.
      5. Incube as células em 100 μL / poço de corante azul VIVO / MORTO diluído 1: 800 em PBS por 15 min em RT. Lave 2x com 200 μL de tampão FACS.
      6. Ressuspenda as células com True Stain Monocyte Blocker (5 μL de bloqueador de monócitos + 45 μL de tampão FACS por poço) por 5 min em RT.
      7. Adicione sequencialmente anticorpos do receptor de quimiocina diretamente à reação de coloração (primeiro, anti-CXCR3 e anti-CCR7 por 10 min cada, seguidos por uma mistura de anti-CXCR5 e anti-CCR6 junto com 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus por 5 min em RT). Misture bem após cada adição, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Consulte a Tabela de Materiais para volumes de anticorpos.
      8. Adicione a mistura de anticorpos de superfície preparada na etapa 2.1.1.3 diretamente à reação de coloração e incube por 30 min em RT. O volume total de coloração por reação é de 180 μL: 50 μL de bloqueador de monócitos em tampão (ver etapa 2.1.1.6) + 18 μL de anticorpos anti-receptores de quimiocinas (ver etapa 2.1.1.7) + 112 μL de mistura de anticorpos de superfície (ver etapa 2.1.1.3).
      9. Lave 2x com 200 μL de tampão FACS frio.
      10. Ressuspenda as células e incube com 80 μL / poço de tampão de fixação à base de paraformaldeído em RT por 20 min.
      11. Adicione 160 μL de tampão de permeabilização 1x a cada poço, que já contém tampão de fixação. Centrifugue a placa a 400 × g por 2 min em RT e lave 1x com 200 μL de tampão de permeabilização.
      12. Prepare a mistura de anticorpos de citocinas intracelulares (ICS), que inclui anticorpos anticitocinas, Brilliant Stain Buffer Plus e tampão de permeabilização (volume total de 50 μL / poço, Tabela de Materiais). Incube as células com esta mistura de anticorpos de citocinas intracelulares em RT por 30 min.
      13. Lavar 2x com tampão de permeabilização de 200 μL/poço. Ressuspenda com 200 μL/poço de tampão FACS.
      14. Armazene as células coradas a 4 ° C no escuro e adquira dados em um citômetro de fluxo espectral dentro de 24 h para minimizar a perda de intensidade de coloração14.
    2. Coloração do fator de transcrição nuclear
      1. Cultive as células com CAN como na etapa 2.1.1.1 (sem estimular as células).
      2. Adicione o anticorpo anti-CD40 humano (0,5 μg/mL) ao meio de cultura e cultive com células por 15 minutos antes de iniciar a coloração. Se as células forem estimuladas, adicionar esse anticorpo 15 min antes de iniciar a estimulação para evitar a internalização do CD40L após a ativação 15,16.
      3. Centrifugue os anticorpos de coloração e prepare a mistura de anticorpos de superfície semelhante à etapa 2.1.1.3: anticorpos de superfície na Tabela de Materiais, 10 μL / poço de Brilliant Stain Buffer Plus e 54,1 μL / poço de tampão FACS.
        NOTA: O volume total de coloração por poço é de 180 μL: 50 μL de bloqueador de monócitos em tampão + 13 μL de anticorpos receptores de quimiocinas + 117 μL de mistura de anticorpos de superfície.
      4. Lave as células e execute a coloração LIVE/DEAD Blue e a coloração e lavagens da superfície como nas etapas 2.1.1.5-2.1.1.8.
        NOTA: O anticorpo anti-CXCR3 não está incluído neste painel.
      5. Fixe as células com 80 μL de tampão de fixação do fator de transcrição nuclear do FoxP3 / Conjunto de tampão de coloração do fator de transcrição. Incubar por 30 min em RT.
      6. Lave as células com tampão de permeabilização como na etapa 2.1.1.11.
      7. Prepare a mistura de anticorpos do fator de transcrição intracelular (TF), que inclui anticorpos antifator de transcrição listados na Tabela de Materiais, 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus e 16 μL de tampão de permeabilização (volume total de 40 μL/poço). Incubar as células com esta mistura durante 1 h a 4 °C.
      8. Lavar e adquirir num citómetro espectral, como indicado nos passos 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Análise não supervisionada de dados de citometria de fluxo de alta dimensão

NOTA: Software, pacotes e suas versões usadas para análise estão listados na Tabela de Materiais. As capturas de tela das etapas 3.2 a 3.4 estão no Arquivo Suplementar 1. Os scripts de exemplo das etapas 3.5 a 3.7 estão noArquivo S upplemental 2 e no Arquivo Suplementar 3, as etapas 3.8 a 3.9 estão no Arquivo Suplementar 4 e no Arquivo Suplementar 5. Os arquivos brutos ICS e TF para os scripts são fornecidos no Arquivo Suplementar 6 e no Arquivo Suplementar 7, respectivamente.

  1. Abra a área de trabalho do software de análise de citometria de fluxo onde os arquivos ".fcs" são armazenados e conclua o gating conforme mostrado na Figura 1E.
  2. Clique com o botão direito do mouse no nó de destino (células T CD4+ neste caso). Escolha Selecionar nós equivalentes.
  3. Clique com o botão direito do mouse no nó de destino novamente. Selecione Exportar/Concatenar Populações.
  4. Aguarde até que a janela Populações: Exportar ou Concatenar seja aberta, escolha os valores do canal CSV e escolha o destino dos arquivos exportados. Inclua todas as células na caixa Incluir eventos e selecione Todos os parâmetros compensados na caixa Parâmetros . Expanda as Opções Avançadas, digite um prefixo para renomear os arquivos e clique em exportar para exportar os arquivos para a pasta de destino (exporte um arquivo .csv para cada amostra).
  5. Leia os arquivos "*.csv" exportados com R (um para cada amostra). Atribua um ID de amostra a cada célula e combine células de todas as amostras em um único quadro de dados.
  6. Adicione ou mescle metadados (informações adicionais sobre amostras) no quadro de dados.
  7. Reduza aleatoriamente a amostragem de um número igual de células por amostra para a análise a seguir. Esta etapa é opcional.
    NOTA: Neste exemplo, 8.000 células T CD4 + foram reduzidas do total de células T CD4 + de cada condição, representando pelo menos 1/7 do número total de células T CD4 + .
  8. Criar objeto Seurat: interprete os valores do canal para marcadores de anticorpos como níveis de expressão gênica ao criar um objeto Seurat.
    1. Crie o objeto Seurat com o quadro de dados gerado a partir da etapa 3.6. Ignore a etapa NormalizeData e salve-os diretamente como ensaio de "dados".
    2. Selecione os marcadores de superfície no painel de fluxo para usar como VariableFeatures no agrupamento não supervisionado.
    3. Execute ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP como o pipeline padrão introduzido do Seurat, exceto a etapa17 do NormalizeData.
    4. Ajuste o parâmetro de resolução na etapa FindClusters para modificar o número de clusters, garantindo que eles reflitam com mais precisão o contexto biológico subjacente.
  9. Use ferramentas de visualização como DimPlot e FeaturePlot compatíveis com o pacote Seurat. Para comparar grupos que contêm várias amostras por grupo, calcule a porcentagem de cada cluster por sujeito e faça comparações estatísticas. Posteriormente, utilizar modelos matemáticos para análises estatísticas mais sofisticadas10.

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Resultados

Para comparar a viabilidade celular geral, cortamos a amígdala em três pedaços semelhantes e os processamos usando nosso protocolo sob três condições: (1) processamento no mesmo dia, (2) armazenamento noturno a 4 ° C e (3) armazenamento noturno em gelo. A viabilidade entre essas três condições foi bastante semelhante, sem diferença significativa (Figura 1A). Também avaliamos o impacto do processo de descongelamento na viabilidade das células. O método de descongelamento gota a gota que usamo...

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Discussão

Em contraste com relatos anteriores de que as amígdalas frescas devem ser processadas dentro de 3 h após a cirurgia19, descobrimos que as amostras frescas de amígdalas podem manter sua viabilidade quando armazenadas a 4 ° C e processadas em 24 h. Para otimizar a viabilidade celular do tecido da amígdala após o descongelamento do armazenamento de nitrogênio líquido, adotamos o método de descongelamento gota a gota recomendado no sequenciamento de célula única, onde...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela Divisão de Pesquisa Intramural do NIAID, NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Máquinas e instrumentos
3 mL Seringa de PlásticoBD309657
96 Poços U Placa InferiorThermo Scientific163320
1.2 mL Frascos Criogênicos Corning430487
Cell strainer 70 µ m NylonFalcon352350
Placa de Cultura de Células (60 mm)VWR10062-890
CentrífugaThermo ScientificSorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Tesoura FinaBenchmarkB2000-2
- SharpF.S.T14060-11
Estojos de Instrumentos de PlásticoF.S.T20830-05
Citômetro de fluxo espectral, AuroraCytek5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Fórceps PadrãoF.S.T11000-13
Fórceps PadrãoF.S.T11000-20
Vi-cell Analisador de viabilidade de célula Blu Beckman CoulterC19201
Reagents
0.5 M EDTA pH 8.0 QualityBiology351-027-101
2-MercaptoethanolGibco21985-023
ACK lysing bufferGibcoA10492-01
Mistura antibiótica-antimicótica (Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B Suspensão, 100x)Gibco15240-062
tampão brilhante da mancha mais (RUO)BD566385
CantharidinSigmaC7632-25MG
tampão da fixação de CytofixBD554655
sulfóxido de dimetilo (DMSO)SigmaD8418-250ml
DNAase IRoche10104159001
fetal Soro bovino (FBS)VWR97068-085
Conjunto de tampão de coloração FoxP3/fator de transcriçãoeBioscience00-5523-00
Gentamicina (50 mg/mL)Gibco15750-060
GolgiplugBD555029
GolgiSTOPBD554724
HEPES (1 M)Gibco15630-080
IonomicinaSigma  I0634-1mg
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030-081
MEM NEAA (100x)Gibco11140-050
Solução de paraformaldeído a 16%, grau EM (PFA)Microscopia eletrônica
  Science		15710Diluir com PBS
PBS, pH 7,4Gibco10010072
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140-122
Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)SigmaP8139-1mg
Recipientes de congelamento controlados por taxaMilliporeCorning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamina)Gibco11875-085
Piruvato de Sódio (100 mM)Gibco11360-070
Bloqueador de Monócitos True-StainBioLegend426103
Buffers
Meiode cultura 10% FBS inativado por calor (VWR),
2 nM glutamina,
0.055 mM 2-mercaptoetanol,
1% penicilina/ estreptomicina,
1 mM de piruvato de sódio
10 mM HEPES,
1% de aminoácidos não essenciais
em RPMI (+L-Glutamina)
Tampão2 mM EDTA e 2% de FBS inativado por calor em PBS
Meio90% de FBS inativado por calor e 10% de tampão
descongelamentoTampão de lavagem + 0,1 mg/mL DNaseI
Meiode amígdalaRPMI suplementado com 5% de FBS inativado por calor,
10 mM de glutamina,
0,05 mg/mL de gentamicina,
mistura antibiótico-antimicótica a 1%
  (penicilina, estreptomicina e anfotericina B).
TampãoRPMI (+L-Glutamina) suplementado com 10%  FBS inativado por calor e 10 mM HEPES
Anticorpos e outros regentes para painel de citocinas 
Biotina anti-CD107a humano (LAMP-1) AnticorpoBioLegend3286042 μ L em 200 μ L meio de cultura completo por poço.
Este anticorpo foi adicionado às células durante a estimulação com PMA/ionomicina.
Coloração de mortos-vivos100 μ L mistura por poço
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1: 800, 0,125 μ L em 100 μ L PBS por poço. 
Bloco de monócitos50 μ L mistura por poço
Tampão bloqueador de monócitosBioLegend4261035 μ L Bloqueador de monócitos True Stain e 45 μ L Buffer FACS por anticorpos
< bem>superfície para mistura de receptores de citocinas
Chemokine mixμ L/bem 
Anti-humano CCR6-BV711BioLegend3534361
Anti-humano CCR7-BV421BioLegend3532081
Anti-humano CXCR3-PE-Cy5BD5511285
Anti-humano CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
           18 μ L mistura por poço para receptores de quimiocinas;
Adicionar direcionado às células com o tampão
Other mistura de anticorpos de superfícieμ L/bem 
Anti-humano CD103-BUV661BD7499932.5
Anti-humano CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
Anti-humano CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
Anti-humano CD25-BB515 BD56446710
Anti-humano CD27- Super Bright 436Thermo62-0279-425
Anti-humano CD3-BV510BioLegend3448282.5
Anti-humano CD38 APC-Fire810BioLegend3035501
Anti-humano CD4 CF YG584CytekR7-200412.5
Anti-humano CD45RA-BUV395BD7403150.6
Anti-humano CD56-BUV737BD6127663.5
Anti-humano CD57-FITCBioLegend3596041.2
Anti-humano CD69-BUV563BD7487641
Anti-humano CD8-BUV805BD6128891.2
Anti-humano FAS-BB700BD5665420.6
Anti-humano HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anti-humano PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-humano-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS buffer61
                                           112 μ L mistura por alvéolo para outros anticorpos de superfície;
Adicione diretamente ao buffer de bloco de monócitos (50 μ L) e mistura de receptores de quimiocinas (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L no total por poço)
anticorpos intracelulares de citocinas para painel de citocinasμ L/bem 
Anti-humano Granzyme B-PEBD1
Anti-humano IL10-PE-Dazzle 594BioLegend5068121
Anti-humano IL17A-BV605BioLegend5123261
Anti-humano IL2-BV650BioLegend5003343
Anti-humano IL21- Alexa Fluor 647BD56049310
Anti-humano IL4-PerCP Cy5.5BD5612341
Anti-humano Perforin-APCBioLegend3533122.5
Anti-humano TNFa-PE-Cy7BioLegend5029300.1
Anti-IFNγ-Pacific BlueBioLegend5025221
SAv-BUV615BD6130130.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1x tampão de permeabilização eBioscience00-5523-0019.15
       (50 μ L mix por poço)
< forte > anticorpos e outros regentes para painel de fator de transcrição < / forte >
CD40 Anticorpo, anti-humanoMiltenyi Biotec130-094-1330,5 μ g/mL de meio de cultura para concentração de trabalho
coloração de mortos-vivos100 μ L mistura por poço
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1: 800, 0,125 μ L em 100 μ L PBS por poço. 
Tampão bloqueador de monócitosBioLegend4261035 μ L Bloqueador de monócitos True Stain e 45 μ L Buffer FACS por bem
Anticorpos de superfície para painel de fatores de transcrição
Mistura de receptores de quimiocinasμ L/bem 
Anti-humano CCR6-BV711BioLegend3534361
Anti-humano CCR7-BV421BioLegend3532081
Anti-humano CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
               13 μ Mistura L por mistura de anticorpos de superfície <
forte> outras < / forte>μ L/bem 
Anti-humano 4-1BB-PE-CY7BioLegend3098182.5
Anti-humano CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
Anti-humano CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
Anti-humano CD200-PerCP-eFluor 710ThermoFisher46-9200-422.5
Anti-humano CD25-PE-Cy5BioLegend3026085
Anti-humano CD3-BV510BioLegend3448282.5
Anti-humano CD38-APC-Fire810BioLegend3035501
Anti-humano CD4-Pacific BlueBioLegend3174231
Anti-humano CD40L-PEBD15
Anti-humano CD45RA-BUV395BD7403150.6
Anti-humano CD56-BUV737BD6127663.5
Anti-humano CD69-BUV650BioLegend3109342.5
Anti-humano CD8-BUV805BD6128891.2
Anti-humano HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anti-humano ICOS-BUV563BD7414211.2
Anti-humano OX40-APCBioLegend3500085
Anti-humano PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-humano-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS buffer54.1
                 117  μ L mistura por alvéolo para outros anticorpos de superfície;
Adicionar diretamente ao bloco de monócitos  tampão (50 μ L) e mistura de receptores de quimiocinas (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L no total por poço)
Anticorpos do fator de transcrição para o painel do fator de transcriçãoμ L/bem 
Anti-humano T-bet-BV605BioLegend6448174
Anti-humano Bcl6-PE-CF594BD5624014
Anti-humano FoxP3-Alexa Fluor 488BD5608871.6
Anti-humano GATA3-BB700BD5666422
Anti-humano Ki67-Alexa Fluor 700BD5612770.4
Anti-humano Rorgt-Alexa Fluor 647BD5636202
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1 x Tampão de permeabilização eBioscience00-5523-0016
                             40 μ L mix por well
Software e Pacotes para análise não supervisionada
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1data.table1.16.2A Rede de Arquivos R Abrangente
2FlowJO10.9.0Becton, Dickinson and Company
3pheatmap1.0.12A Rede de Arquivos R Abrangente
4R4.3.2A Rede de Arquivos R Abrangente
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9SpectroFlo3.0Cytek
10tidyverse2.0.0A Rede Abrangente de Arquivos R
11viridis0.6.5A Rede Abrangente de Arquivos R
Digital FACS de congelamento de DMSO de lavagem de bloco de monócitos 561142 557299

Referências

  1. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  2. Choi, J., et al. Bcl-6 is the nexus transcription factor of t follicular helper cells via repressor-of-repressor circuits. Nat Immunol. 21 (7), 777-789 (2020).
  3. Goubet, A. G., et al. Escherichia coli-specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer. Cancer Discov. 12 (10), 2280-2307 (2022).
  4. Jiang, Y., et al. Protein phosphatase 2A propels follicular T helper cell development in lupus. J Autoimmun. 136, 103028(2023).
  5. Overacre-Delgoffe, A. E., et al. Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer. Immunity. 54 (12), 2812-2824.e4 (2021).
  6. Patel, P. S., et al. Translational regulation of TFH cell differentiation and autoimmune pathogenesis. Sci Adv. 8 (25), eabo1782(2022).
  7. Alameh, M. G., et al. Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses. Immunity. 55 (6), 1136-1138 (2022).
  8. Sekiya, T., Yoshimura, A. In vitro Th differentiation protocol. Methods Mol Biol. 1344, 183-191 (2016).
  9. Ueno, H., Banchereau, J., Vinuesa, C. G. Pathophysiology of T follicular helper cells in humans and mice. Nat Immunol. 16 (2), 142-152 (2015).
  10. Xu, Q., et al. Adaptive immune responses to SARS-CoV-2 persist in the pharyngeal lymphoid tissue of children. Nat Immunol. 24 (1), 186-199 (2023).
  11. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q. Z., Maltzman, J. S., Stee, V. G. T. L. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  12. 10x Genomics. Cell thawing protocols for single cell assays. CG000447. , https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1710525012/CG000447_Handbook_CellThawingProtocols_SingleCellAssays_Rev_B.pdf (2024).
  13. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  14. Diks, A. M., et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 475, 112616(2019).
  15. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  16. Dan, J. M., et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science. 371 (6529), eabf4063(2021).
  17. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  18. Ditoro, D., et al. Differential IL-2 expression defines developmental fates of follicular versus nonfollicular helper T cells. Science. 361 (6407), eaao2933(2018).
  19. Assadian, F., et al. Efficient isolation protocol for B and T lymphocytes from human palatine tonsils. J Vis Exp. (105), e53374(2015).
  20. Florek, M., et al. Loss of CD62L expression in CD4+FoxP3+regulatory T cells following freeze-and-thaw prevents protection against gvhd in murine models. Blood. 124 (21), 2427-2427 (2014).
  21. Frigyesi, I., et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 123 (9), 1336-1340 (2014).
  22. Anselmo, A., et al. Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function. Cytometry Part A. 85 (4), 292-301 (2014).
  23. Berhanu, D., Mortari, F., De Rosa, S. C., Roederer, M. Optimized lymphocyte isolation methods for analysis of chemokine receptor expression. J Immunol Methods. 279 (1-2), 199-207 (2003).
  24. Den Braanker, H., Bongenaar, M., Lubberts, E. How to prepare spectral flow cytometry datasets for high dimensional data analysis: A practical workflow. Front Immunol. 12, 768113(2021).

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