Avaliação do Efeito dos Fatores de Crescimento na Produção de Clorofilas a e b a partir de Microalgas

Resumo

O presente estudo destaca as vantagens de empregar o método desenvolvido por Jeffrey e Humphrey para extrair e quantificar pigmentos lipossolúveis de microalgas. Este método serve como uma ferramenta valiosa para avaliar a influência dos fatores de crescimento na produção de clorofila e no conteúdo celular nesses organismos.

Resumo

As microalgas contêm dois grupos principais de pigmentos: clorofilas e carotenóides. A clorofila é um pigmento verde que absorve a energia da luz e a transforma em energia química para facilitar a síntese de compostos orgânicos. Este pigmento serve como uma valiosa fonte primária para produtos de insumos biotecnológicos nas indústrias alimentícia, farmacêutica e cosmética devido às suas altas propriedades antioxidantes e capacidade de coloração. O objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito de fatores de crescimento (concentração de CO₂ , cor clara e intensidade de luz) por meio de um delineamento experimental de Taguchi L₄ sobre o crescimento celular e o conteúdo celular de clorofila a e b em Chlorella sorokiniana, seguido da validação do método utilizando Haematococcus pluvialis microalgas como modelo de estudo adicional. O crescimento celular foi quantificado usando a técnica espectrofotométrica de densidade óptica em um comprimento de onda de 550 nm. Para a quantificação das clorofilas, obteve-se um extrato celular utilizando uma solução de acetona pura a 90% e, posteriormente, as concentrações de clorofilas a e b foram quantificadas por meio de técnicas espectrofotométricas nos comprimentos de onda de 647 nm e 664 nm, de acordo com o método descrito por Jeffrey e Humphrey. Os resultados experimentais indicaram que o controle de condições de baixa adição de CO₂ , luz roxa e baixa intensidade de luz aumenta o crescimento celular e a concentração de clorofilas a e b dentro das células. A implementação deste método de quantificação de clorofila permite uma determinação rápida, simples e precisa do teor de clorofila, uma vez que os comprimentos de onda utilizados estão nos picos de absorbância de ambos os tipos de clorofilas, tornando esta técnica facilmente reprodutível para qualquer microalga em estudo.

Introdução

Nos últimos anos, os crescentes problemas ambientais causados pelas atividades antrópicas e seus efeitos adversos na saúde e no equilíbrio dos ecossistemas têm impulsionado a busca por sistemas de produção mais eficientes e ecologicamente corretos. Isso acelerou os processos nas indústrias e promoveu a implementação de tratamentos de biorremediação e o desenvolvimento de biocompostos para mitigar esses efeitos nocivos¹.

Este contexto tem levado a um crescimento significativo no estudo das microalgas, impulsionado pela necessidade de encontrar soluções inovadoras para os desafios ambientais e económicos atuais. As microalgas prosperam em ambientes aquáticos, usando luz solar e dióxido de carbono como fontes de energia e carbono, respectivamente. Essa característica os torna uma alternativa sustentável e promissora para a produção de diversos produtos de valor. As pesquisas nesse campo têm se concentrado na compreensão da fisiologia e do metabolismo dessas células, bem como no desenvolvimento de tecnologias eficientes para seu cultivo e processamento².

Há uma clara necessidade de desenvolver ferramentas acessíveis e confiáveis para estudar microalgas para acelerar os processos de pesquisa e aprofundar a compreensão de sua fisiologia, metabolismo e aplicações potenciais. Essas ferramentas devem permitir uma análise rápida do efeito de fatores ambientais e de produção em parâmetros-chave, como a concentração de clorofila, que é um indicador fundamental da saúde e do desenvolvimento desses organismos. Uma diminuição no teor de clorofila pode indicar estresse ambiental, deficiências nutricionais ou doenças.

Esses pigmentos verdes desempenham um papel crucial na fotossíntese, capturando a energia solar para converter dióxido de carbono e água em glicose e oxigênio e constituem entre 0,5% e 5% da biomassa das microalgas³. Além de seu papel essencial na sustentação dos processos vitais, as clorofilas encontraram aplicações em várias indústrias. Os extratos de clorofila são utilizados no processamento de alimentos e bebidas como corantes naturais, conferindo tons verdes vibrantes aos produtos e, ao mesmo tempo, fornecendo propriedades antioxidantes. Além disso, os suplementos à base de clorofila estão ganhando popularidade no setor de saúde e bem-estar devido aos seus supostos efeitos desintoxicantes e anti-inflamatórios. Ao aproveitar as propriedades multifacetadas da clorofila, as indústrias podem desenvolver produtos inovadores que contribuem tanto para o apelo visual quanto para o bem-estar do consumidor¹.

Nesse sentido, uma microalga de grande relevância biotecnológica é C. sorokiniana. Este microrganismo se destaca por sua rápida taxa de crescimento, tornando-o altamente eficiente na produção de biomassa. Além disso, C. sorokiniana exibe um conteúdo diversificado de compostos altamente nutricionais, incluindo proteínas, lipídios e vitaminas, o que o torna valioso para várias aplicações na produção de alimentos, rações e biocombustíveis². Além disso, descobriu-se que essa espécie de microalga produz enzimas extracelulares com diversas funções, abrindo possibilidades para aplicações biotecnológicas, como tratamento de águas residuais, biorremediação e produtos farmacêuticos⁴. Além de seu rápido crescimento e aplicações versáteis, C. sorokiniana também demonstra um potencial significativo para a produção de clorofila. Como microrganismo fotossintético, C. sorokiniana possui a maquinaria necessária para a síntese da clorofila, que constitui entre 0,5% e 5% da biomassa das microalgas³. Essa capacidade torna C. sorokiniana um candidato atraente para a produção de clorofila em escala comercial e promete ser uma solução sustentável para desafios ambientais e nutricionais urgentes⁵.

Por outro lado, outra espécie de microalga de interesse significativo é H . pluvialis. Esta microalga é conhecida por sua produção de astaxantina, um potente pigmento antioxidante com inúmeras aplicações industriais. A astaxantina serve como um mecanismo de proteção para o fotossistema de H. pluvialis , protegendo-o do estresse oxidativo induzido por fatores ambientais. Este pigmento é muito procurado nas indústrias de cosméticos, nutracêuticos e aquicultura, devido às suas propriedades antioxidantes e potenciais benefícios à saúde. Com sua abundante capacidade de produzir astaxantina, o H. pluvialis apresenta um caminho promissor para o desenvolvimento de produtos inovadores que atendem a várias necessidades industriais e de consumo⁶.

Estudos recentes também destacaram o potencial de H. pluvialis¹ para a produção de clorofila, aumentando ainda mais sua importância industrial. Por exemplo, um estudo investigou o teor de clorofila de H. pluvialis sob condições de crescimento variadas e descobriu que, sob parâmetros ideais de cultivo, H. pluvialis exibiu taxas notáveis de produção de clorofila, superando as de outras espécies de microalgas⁷. Essa descoberta ressalta o potencial de H. pluvialis como fonte sustentável de clorofila, oferecendo novas oportunidades para sua utilização em vários setores industriais.

Protocolo

1. Preparação de meios de cultura e preparação de inóculo

1. Preparar 1 L de meio de crescimento 3N-BBM+ V(CCAP) (Macronutrientes: NaNO₃ [0,75 g ^L-1], CaCl₂ [0,019 g ^L-1], MgSO₄ [0,019 g ^L-1], K₂HPO₄ [0,057 g ^L-1], NaCl [0,025 g ^L-1], KH₂PO₄ [0,175 g ^L-1]; micronutrientes: Na₂ EDTA [0,0186 g ^L-1], FeCl₃ [0,0024 g ^L-1], MnCl₂ [0,001 g ^L-1], ZnCl₂ [1,25 x ^10-4 g ^L-1], CoCl₂ [5 x ^10-5 g ^L-1], Na₂MoO₄ [9,98 x ^10-5 g ^L-1])⁸ e esterilizar por 15 min a 121 °C e 1,5 psi.
2. Inocular um balão com 1 L de meio de cultura a uma concentração aproximada de 3 x 10⁶ células ^mL-1 para a microalga C. sorokiniana; ou adicionar 5% a 10% (v/v) de inóculo ao meio de cultura.
   NOTA: Para manter as condições estéreis, recomenda-se o uso de capuz de fluxo laminar, luvas, jaleco e máscara facial.
3. Incubar o balão inoculado sob fontes de luz vermelha com uma intensidade aproximada de 3.600 a 4.200 lux, a uma temperatura compreendida entre 22-26 °C, com um fotoperíodo de 12 h de luz e 12 h de escuridão para C. sorokiniana e fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h de escuridão para H. pluvialis, e agitar manualmente de 24 em 24 h, aproximadamente por 7 dias para ambas as cepas.
   NOTA: Manter em condições de crescimento durante pelo menos 7-10 dias (até obter uma cor verde intensa) para C. sorokiniana e 10-12 dias para H. pluvialis. Para obter o concentrado de microalgas que servirá de inóculo na cinética, é necessário retirar o meio sobrenadante das algas produzidas.
4. Em um ambiente estéril, encha os tubos de centrifugação cônicos estéreis de 15 mL com aproximadamente 10 mL de meio inoculado e centrifugue a 3.000 x g por 20 min sob 25-30 °C.
5. Em condições estéreis, remova o sobrenadante usando uma micropipeta ou despejando e concentrando a biomassa em um tubo de centrifugação cônico estéril de 50 mL.
6. Repetir este processo se necessário até obter o volume de inóculo necessário para a cinética.
7. Meça a densidade óptica (OD₅₅₀ nm) do inóculo para determinar a concentração celular das microalgas e armazene-a a uma temperatura de 3-4 °C até que esteja pronta para uso.
   NOTA: A contagem celular direta foi inicialmente realizada para correlacionar a concentração celular com a absorbância. Uma vez contado, o inóculo pode ser armazenado sob refrigeração por no máximo 4 dias.

2. Estudo da cinética de crescimento

1. Preparar o volume necessário de 3N-BBM+ V(CCAP) adequado para cada experiência (8 L para os testes de nível do fotobiorreator para C. sorokiniana e 0,5 L para os testes de nível do frasco para H. pluvialis) de acordo com os procedimentos laboratoriais padrão, garantindo uma esterilização adequada.
2. Para o fotobiorreator e os frascos, configure a fonte de luz para o espectro de cores desejado (azul a 460 nm, roxo, mistura de 460 nm e 630 nm para C. sorokiniana e vermelho a 630 nm para H. pluvialis); Cubra ambos os sistemas para evitar interferência de luz externa.
   NOTA: Devido à variação no comprimento de onda emitido por cada diodo emissor de luz, a espectrorradiometria foi realizada usando um espectrorradiômetro nas fontes de luz para determinar o comprimento de onda e a potência de emissão de cada diodo⁹. A luz roxa foi obtida combinando LEDs vermelhos e azuis, resultando em comprimentos de onda de 460 nm com uma potência de emissão de 1,65 W ^nm-1 para os LEDs azuis e 630 nm com uma potência de emissão de 0,6 W ^nm-1 para os LEDs vermelhos. Essas medidas foram usadas para os testes realizados apenas sob luz azul e vermelha.
3. Programe o temporizador para alternar entre ciclos de 12 h de luz e 12 h de escuridão para C. sorokiniana e ciclos de 16 h de luz e 8 h de escuridão para H. pluvialis.
4. Conecte o sistema de aeração de CO₂ ao vaso de cultura do fotobiorreator para fornecer suprimento de dióxido de carbono em intervalos de 12 h para C. sorokiniana.
5. Inocular o recipiente de cultura com um volume suficiente de pré-inóculo para atingir uma densidade celular inicial de 3 x^10,5 células ^mL-1 ou o seu equivalente em densidade óptica (DO₅₅₀ nm) = 0,180.
   NOTA: Assegure a técnica asséptica durante a inoculação para evitar contaminação.
6. Colete amostras da cultura em intervalos regulares de 12 h para C. sorokiniana e 8 h para H. pluvialis para monitorar o crescimento celular e os parâmetros fisiológicos. Colete amostras usando técnicas estéreis para manter a integridade da cultura.

3. Quantificação das clorofilas

NOTA: Os dados para quantificação celular são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

1. Coloque 40 mL da amostra em tubos de centrifugação cônicos de plástico.
2. Centrifugue a 3.000 x g por 20 min a 15 ° C e descarte o sobrenadante por decantação ou usando uma pipeta Pasteur.
3. Transfira o pellet celular para um tubo de vidro coberto com papel alumínio e uma tampa de rosca para evitar a oxidação.
4. Ressuspenda o pellet celular com 3 mL de solução de acetona pura a 90% usando um vórtice.
5. Sonicar a amostra suspensa num banho de gelo durante dois ciclos de 5 minutos cada e deixá-la repousar a 4 °C durante 16 h¹⁰.
6. Após 16 h, sonicar novamente nas mesmas condições mencionadas na etapa anterior (etapa 3.5) e centrifugar novamente nas condições descritas anteriormente (etapa 3.2).
7. Separe o extrato de pigmento usando uma pipeta Pasteur e transfira-o para outro tubo limpo e protegido da luz.
8. Coloque o extrato de pigmento em uma célula de quartzo para ler em um espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 630 nm, 647 nm e 664 nm.
   NOTA: Calibre o espectrofotômetro com acetona a 90%.
9. Para calcular as concentrações de clorofila, use as seguintes equações¹¹:
   Clorofila a = 11,93 A₆₆₄ - 1,93 A₆₄₇
   Clorofila b = 20,36 A₆₄₇ - 5,50 A₆₆₄
   NOTA: Os resultados são expressos em μg ^mL-1 de extrato, que são multiplicados pelo volume do extrato e divididos pelo número de mL de amostra para obter concentrações de clorofila em μg ^mL-1 de cultura.
10. Para obter valores em μg chl ^cell-1, use a seguinte fórmula:
    μg chl ^célula-1 = μg chl em 1 mL de cultura / concentração de células [células ^mL-1] na cultura.

Resultados

Para observar a eficiência da técnica em detectar variações na concentração celular de clorofila e avaliar o efeito dos fatores de crescimento em C. sorokiniana, foi estabelecido um delineamento experimental Taguchi L₄ , avaliando a adição de volume de CO₂ , cor clara e intensidade de luz. Cada fator foi avaliado em níveis baixo e alto, conforme apresentado na Tabela 1, nas condições definidas pelo delineamento experimental da Tabela 2.

Discussão

O estudo comparativo entre H. pluvialis e C. sorokiniana revelou diferenças significativas na dinâmica de produção de clorofila. Enquanto H. pluvialis exibiu uma diminuição na concentração de clorofila ao longo do experimento, C. sorokiniana mostrou um aumento constante. Além disso, houve inicialmente uma menor proporção de clorofila a em ambas as espécies, mas essa proporção se inverteu em condições particulares de crescimento, o que pode dar...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C3H6O	Meyer	67-64-1	Acetona 90%
15 mL tubo	Biologix	10-9502	Tubo de ensaio
2510-DTH	Branson	D-73595	Sonicator
5 mL tampa de rosca tubo de ensaio	Kimax	45066-13100	Tubo
de ensaio 50 mL tubo de centrífuga	Biologix	10-9151
Folha de alumínio	Reynolds	611 padrão, 12" x 1000 pés	Capa de tubo de ensaio
CaCl2	Meyer	0925-250	Centrífuga de Cloreto
Cálcio	Centrífuga Dynamica	14 R	CoCl refrigerado
2< / sub>	Merck	1057-100	Dicloreto de cobalto
FeCl3< / sub>	Merck	157740	Cloreto de ferro (III)
K2< / sub>HPO4< / sub>	Meyer	2051-250	Fosfato dipotássico
KH2< / sub>PO4	Meyer	2055-250	Fosfato Monopotássico
MgSO4	Meyer	1605-250	Micropipeta de Sulfato de Magnésio
	Modelo LabNet	Micropipeta	Beta-Pette
MnCl2	Merck	429449	Cloreto de Manganês(II)
Na2 EDTA	Merck	200-449-4	Edatamil, Edetato Sal Dissódico Dihidratado
Na2MoO4	Merck	243655	Molibdato de Sódio
NaCl	Meyer	2365-500 Cloreto de	Sódio
NaNO3	Meyer	2465-250	Nitrato de Sódio
RGB Faixa LED	Steren	GAD-LED2	Luz fonte
Espectrofotômetro	PerkinElmer	Modelo Lambda35	Espectrofotômetro
espectrorradiômetro	Gigahertz-Optik	modelo BTS256
Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie® 2	Vortex
ZnCl2	Merck	208086	Cloreto de Zinco

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