Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Summary

Este protocolo apresenta um método prático usando Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como exemplo para abordar a distribuição desigual de partículas por meio da otimização da preparação de amostras, fornecendo uma referência para os pesquisadores elucidarem eficientemente estruturas macromoleculares usando microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM).

Abstract

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) revolucionou a biologia estrutural ao permitir o estudo de estruturas macromoleculares em condições quase nativas, suspensas no gelo vítreo. Essa técnica permite a visualização de alta resolução de proteínas e outras biomoléculas sem a necessidade de cristalização, oferecendo informações significativas sobre sua função e mecanismo. Avanços recentes na análise de partícula única, juntamente com o processamento aprimorado de dados computacionais, tornaram o crio-EM uma ferramenta indispensável na biologia estrutural moderna. Apesar de sua crescente adoção, o crio-EM enfrenta desafios persistentes que podem limitar sua eficácia, particularmente a distribuição desigual de partículas. Esse problema geralmente leva a uma resolução ruim e precisão reduzida em estruturas de proteínas reconstruídas. Este artigo descreve uma abordagem simples e prática para enfrentar esse desafio, usando a pequena proteína de choque térmico de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como exemplo. O método otimiza a preparação da amostra para minimizar a adsorção preferencial, garantindo uma distribuição de partículas mais homogênea e estruturas crio-EM de proteína de maior qualidade. Essa técnica oferece uma orientação valiosa para pesquisadores que desejam superar desafios semelhantes em estudos estruturais.

Introduction

Com os avanços recentes no hardware do instrumento ^1,2 e no software de processamento de imagem ^3,4,5, a microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) emergiu como uma ferramenta popular e poderosa na biologia estrutural moderna. Apesar desses avanços, persistem gargalos na obtenção de estruturas macromoleculares de alta resolução usando crio-EM. Um desses desafios significativos é a distribuição desigual de partículas, incluindo o fenômeno de preferência de orientação, que é predominan....

Protocol

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Purificação de proteínas

1. Induza a expressão de MjsHSP16.5 recombinante em E. coli BL21 (DE3) e purifique a proteína usando uma coluna de cromatografia quelante de níquel, conforme descrito anteriormente²⁶. Após a purificação em uma coluna²⁶ de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), examine a pureza da proteína carregando 5 μL de frações de pico em um gel SDS-PAGE a 12,5% e visualizando pela c....

Results

Para identificar as condições ideais da grade para MjsHSP16.5, foi realizada uma triagem inicial de crio-EM, concentrando-se principalmente no exame de várias condições de tampão proteico: (1) o tampão de purificação final, que garante a estabilidade e homogeneidade de MjsHSP16.5 e é importante para sua cristalização³⁰; (2) tampões adaptados das condições necessárias para o crescimento de cristais MjsHSP16.5 de alta qualidade de difração³⁰; e (3) tampões anteriormente empre.......

Discussion

Todos os estudos estruturais de proteínas começam com a purificação de proteínas, um processo iterativo para alcançar um equilíbrio entre o isolamento de alvos proteicos com alta pureza e homogeneidade, preservando sua funcionalidade nativa. Embora as composições de tampão para purificar e preservar amostras de proteínas sejam cuidadosamente selecionadas durante o processo de purificação, esses tampões frequentemente representam desafios durante a preparação e imagem subsequentes de amos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de Fundo Redondo de 14 mL	SPL Life Sciences	40114
250 µ L Seringa à Prova de Gás Modelo 1725 LTN	Hamilton	81100	Agulha Cimentada, calibre 22s, 2 pol, estilo de ponta 2
50 µ L Botão de Diálise	Hampton Research	HR3-326
Copo de Vidro de 50 mL	DIAMOND	HA.1010D.50
Ä Unidade de Filtro Centrífugo KTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Tubo	Cytiva 28989335
1,5 mL	HD Micro	H23015
Tubos PCR 0,2 mL, tampa plana	de brilho Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow	Ted Pella	91000
Bloco de suporte de grade PELCO TEM	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh,	Microscopia Eletrônica Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Tubo de Membrana de Diálise	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Aumento 10/300 GL	Cytiva	29091596
Acetato de uranilo	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Kit de triagem de tampão e detergentes	ThermoFisher Scientific	A49856