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Artigo de método

Cultura glial entérica equina e aplicação ao estudo de um mecanismo inflamatório neural em cólica equina

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DOI:

10.3791/67244

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4 de outubro de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

Neste artigo

Resumo

A glia entérica está se tornando cada vez mais reconhecida por seus papéis na homeostase intestinal e nos processos de doenças, incluindo complicações pós-operatórias. Pacientes equinos em recuperação de laparotomia exploratória de emergência sofrem de alto risco de condições inflamatórias pós-operatórias, destacando a importância de estabelecer cultura de células gliais primárias gliais entéricas equinas repetíveis para estudo.

Resumo

As condições inflamatórias pós-operatórias da cólica equina (abdome agudo) contribuem não apenas para o aumento do custo do cliente, desconforto do paciente e tempo de hospitalização, mas, em muitos casos, provam ser fatais. Uma população única de células intestinais, a glia entérica, é cada vez mais reconhecida por seus papéis na detecção do ambiente gastrointestinal e na comunicação com os tipos de células circundantes. As interações entre a glia entérica e o epitélio intestinal podem ser críticas para estabelecer como a glia entérica equina pode alterar a barreira mucosa para modular a inflamação na saúde e nas cólicas.

Para estudar essa interação, apresentamos um método de estabelecer culturas gliais entéricas equinas primárias do jejuno equino e expor as culturas a condições inflamatórias conhecidas por estarem presentes na cólica. As culturas gliais entéricas primárias foram obtidas de cavalos adultos sacrificados por motivos não relacionados à cólica. As vilosidades intestinais e a lâmina própria foram microdissecadas para expor a submucosa. A submucosa isolada foi submetida à digestão enzimática com colagenase, protease e albumina de soro bovino por 2-3 h. Em seguida, a digestão mecânica envolvendo centrifugação, pipetagem e filtros de células (40-100 μm) produziu um pellet usado para plaqueamento em poços revestidos de poli-L-lisina de 0,05 mg / mL a uma concentração de ~ 400.000 células / 300 μL de meio.

Após a confluência e a primeira passagem, as células gliais entéricas foram então expostas a IL-1β recombinante equina (0, 10, 25 ng) por 24 h. Para modelar as interações epitelial-gliais no momento da cólica, a glia entérica condicionada pelo controle ou tratada foi adicionada diretamente às monocamadas jejunais equinas confluentes enquanto se mede a resistência elétrica transepitelial (TEER) usando uma câmara EndOhm de eletrodo duplo. Esses dados demonstram apenas uma das muitas aplicações potencialmente impactantes da cultura glial entérica equina.

Introdução

A cólica equina é a queixa de apresentação médica mais prevalente para consulta de emergência1. Com até 17% desses cavalos necessitando de correção cirúrgica, os esforços para aumentar os resultados pós-operatórios devem estar na vanguarda da pesquisa médica equina2. Atualmente, os pacientes com cólica pós-operatória apresentam um alto risco de vários distúrbios com risco de vida, incluindo sepse/choque endotoxêmico (12,3% dos pacientes) e íleo paralítico pós-operatório (13,7% dos pacientes)3. Apesar do progresso no tratamento das complicações pós-operatórias, continua havendo necessidade de tratamentos avançados para prevenir ou tratar essas condições.

Pesquisas recentes têm destacado o estado inflamatório local e sistêmico de pacientes com cólica4. Por exemplo, proteínas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral (TNF) alfa, interleucina 1β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) e proteína quimioatraente de monócitos-1, demonstraram estar significativamente aumentadas na expressão na mucosa intestinal cólica versus tecido intestinal normal4. Do ponto de vista sistêmico, foi demonstrado que o aumento do TNF alfa no tecido intestinal está correlacionado com um risco aumentado de refluxo nasogástrico pós-operatório maior que 2 L, uma medida geral de dismotilidade pós-operatória4. Sabe-se também que a administração de interleucina IL-1β e TNF alfa é capaz de induzir sinais clínicos de choque séptico5.

Uma possível explicação para o estado inflamatório do tecido intestinal cólica e sua ligação com complicações pós-operatórias é a barreira epitelial intestinal. Na saúde, os complexos de junção apertada que ligam a única camada de epitélio colunar que reveste o trato intestinal fornecem uma barreira funcional para limitar o conteúdo luminal e seus componentes bacterianos de atingir o espaço submucoso e a corrente sanguínea. No entanto, a distensão e os danos causados pela obstrução intestinal associada à cólica e pela manipulação intestinal durante a cirurgia podem interromper essa função de barreira intestinal.

Em termos dos componentes funcionais da parede intestinal como um todo, a rede glial entérica submucosa dentro do sistema nervoso entérico tem se mostrado crucial no desenvolvimento fisiopatológico das complicações pós-operatórias associadas às vias inflamatórias e pode fornecer um alvo terapêutico específico 6,7,8,9 . A glia entérica não está apenas presente em todo o trato gastrointestinal, mas também atua como sensores do ambiente intestinal, influencia a sinalização com vários tipos de células da parede intestinal e regula diretamente a barreira intestinal6. É, portanto, justificável presumir que esses potentes sensores do intestino seriam ativados por lesão e inflamação e poderiam produzir uma resposta aguda, como alterações na permeabilidade da barreira.

Este estudo é o primeiro a descrever a cultura da glia entérica equina e, mais especificamente, o papel da glia entérica equina inflamatória na função de barreira intestinal. Aqui, apresentamos métodos de cultivo primário de glia entérica submucosa equina e sua resposta à exposição à IL-1β inflamatória, avaliação do efeito de produtos gliais entéricos pós-exposição à IL-1β na permeabilidade de monocamadas de enterócitos equinos e possível bloqueio através da aplicação de soro equino.

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Protocolo

Culturas primárias gliais entéricas equinas foram obtidas de três cavalos sacrificados humanamente com uma overdose de barbitúrico por razões não relacionadas a este estudo. Os cavalos selecionados para os estudos de cultura eram cavalos adultos sem história atual de doença gastrointestinal.

1. Cultura primária glial entérica equina submucosa

  1. Cultive monocamadas epiteliais equinas a partir de criptas jejunais obtidas de três cavalos equinos adultos separados.
    1. Cubra as placas de 24 poços com solução de revestimento por 2 h a 37 °C ou durante a noite em temperatura ambiente, lave-as 2x com água estéril e armazene-as em temperatura ambiente até que as células estejam prontas para o revestimento.
    2. Após a eutanásia humana, dentro de 60 minutos, remova uma seção do jejuno e coloque-a na solução fria de Ringer no gelo.
    3. Remova uma porção de 10 cm do jejuno e abra-a na borda antimesentérica para manter as regiões não linfóides no centro do tecido. Apare a porção em uma seção de aproximadamente 7 cm x 7 cm. Enxágue bem o tecido em solução de Ringer fresca antes da dissecção.
    4. Prenda o tecido em uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone em solução fria de Ringer ou PBS com o lado da mucosa para cima, esticando o tecido o máximo possível (Figura 1A).
    5. Remover as vilosidades intestinais com pinça curva (Figura 1B) seguida da camada de lâmina própria da região não linfóide de aproximadamente 5 cm x 5 cm (Figura 1C).
      NOTA: Essas camadas se separam facilmente da submucosa (Figura 1B).
    6. Remova a submucosa em uma folha, liberando-a com uma tesoura de microdissecção em um canto e observe a separação natural enquanto descasca a submucosa da camada muscular circular interna do jejuno (Figura 1D).
    7. Pique a camada submucosa coletada em pedaços de 2-5 mm e coloque-os em um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de "Organo-FBS" (Tabela 1), 0,825 mg de colagenase, 5 mg de protease e 20 mg de albumina sérica bovina. Incubar o tecido durante 2-3 h a 37 °C para uma digestão enzimática.
    8. Após a incubação, adicione 10 mL de "Organo + FBS" à temperatura ambiente para interromper a ação da enzima. Pipete a mistura de tecidos para cima e para baixo aproximadamente 15x com uma pipeta sorológica de 10 mL para dissociar as células do tecido e, em seguida, centrifugue a 3.000 × g por 3 min em temperatura ambiente.
    9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 10 mL de PBS em temperatura ambiente, pipetando para cima e para baixo novamente aproximadamente 15x com uma pipeta sorológica de 10 mL para dissociar as células do tecido.
    10. Centrifugue o tubo cônico a 3.000 × g por 3 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 10 mL de temperatura ambiente "Organo + FBS" pipetando para cima e para baixo aproximadamente 15x com uma pipeta sorológica de 10 mL para dissociar as células do tecido.
    11. Filtre as células em série através de um filtro de células do tamanho de um poro de 100 μm, 70 μm e, em seguida, de 40 μm.
    12. Centrifugue as células e meios filtrados a 3.000 × g por 3 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de "Organo + FBS".
    13. Corar com azul de tripano para identificar células vivas e contá-las com um hemocitômetro.
    14. Semeie aproximadamente 400.000 células em 300 μL de "Organo + FBS" em cada poço de uma placa de 24 poços e adicione fatores de crescimento a cada poço: N2 5 μL/poço, G5 5 μL/poço e B27 10 μL/poço. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 para permitir que as células adiram. Vinte e quatro horas depois, troque o meio para "glia media" (Tabela 1) com os fatores de crescimento acima e troque a cada 48 h (Figura 2).

2. Citologia imunofluorescente

  1. Cultive as células gliais entéricas da cultura primária (P0) (etapa 2.1.14) até 70-80% de confluência e passe-as uma vez (P1).
  2. Fixe as células de cultura primária (P0) nos poços usando paraformaldeído a 4% por 5 min antes da aplicação de azida PBS a 0,1%.
  3. Prepare a solução de saturação consistindo de azida PBS, soro de burro a 4% e Triton-X a 0,5%. Adicione 300 μL de solução de saturação aos poços para permeabilizar as células por 2 h à temperatura ambiente.
  4. Adicione o anticorpo primário para o marcador glial, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), e o anticorpo primário para o marcador de fibroblastos, actina de músculo liso alfa, em diluições de 1:1.000 em solução de saturação para incubação noturna a 4 oC.
  5. Lave 3x com PBS antes de adicionar anticorpo secundário para IgG Alexa Fluor 594 anti-coelho de burro e IgG Alexa Flour 488 de cabra anti-camundongo em uma diluição de 1:500 em solução de saturação por 2-3 h.
  6. Manchar os núcleos com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em uma diluição de 1:1.000 em PBS por 5 min.
  7. Após três lavagens com PBS, armazene as células em 0,1% de azida PBS.

3. Exposição primária à cultura glial glial entérica equina submucosa IL-1β

  1. Quando as células da primeira passagem (P1) atingirem 70-80% de confluência, realize o experimento de exposição à IL-1β. Exponha os poços a 0 ng, 10 ng e 25 ng de IL-1β por 24 h. Após 24 h, depositar e armazenar o meio de cada poço a -80 °C.

4. Cultura organoide equina para produção de monocamadas de enterócitos

NOTA: Seguindo o protocolo de Stewart et al. publicado em 2018, criptas intestinais equinas e brotos que haviam sido criobancos foram expandidos para estudos enteróides 2D10.

  1. Use aproximadamente 700-1.000 brotos/fragmentos de cripta (40.000-50.000 células quando dissociadas em células únicas) por inserção de transpoço. Cubra as inserções transwell com 42 μL de Matrigel a 0,05% antes da adição dos enterócitos. Deixar fixar o Matrigel no inserto incubando durante 1 h a 37 oC. Aspirar o meio extra e deixar os transpoços secarem durante 30 min descobertos. Adicione 200 μL de meio DMEM-F12 a cada inserto de transwell e armazene a placa a 37 °C até o uso.
  2. Lave os hambúrgueres Matrigel contendo os organoides com PBS e exponha-os a 500 μL de Cell Recovery enquanto estiver no gelo. Pipete-os repetidamente para garantir a coleta completa de células em um tubo de 15 mL.
  3. Centrifugue o tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C., retire o sobrenadante e suspenda o sedimento celular no volume-alvo do meio de células estaminais epiteliais intestinais (IESC). Calcule o volume alvo multiplicando o número desejado de monocamadas por 200 μL de meio. (Tabela 1).
  4. Pré-revestir uma seringa de 1 mL em meio IESC e aspirar a suspensão celular através de uma agulha de 16 G. Substitua a agulha de 16 G por uma agulha de 28 G e ejete a suspensão celular através dela para estimular a separação dos organoides.
  5. Coloque 200 μL da suspensão celular resultante no lado apical dos transwells revestidos e 500 μL de IESC, bem como fatores de crescimento descritos anteriormente no lado basal do inserto do transwell10. Troque o meio e os fatores de crescimento a cada 24-48 h até atingir a confluência. Defina confluência como a densidade celular correspondente a um TEER de 1.000 ohmsxcm 2,11. Para medição, consulte a etapa 5.1.

5. Permeabilidade da monocamada de enterócitos equinos após exposição a citocinas inflamatórias e produtos gliais entéricos equinos

  1. Use uma câmara de medição TEER de eletrodo duplo para quantificar o TEER nas monocamadas e estabelecer uma leitura de base em cada membrana permeável ao transpoço. Certifique-se de que o meio IESC e o transwell tenham 15 minutos para atingir a temperatura ambiente antes de fazer as medições. Encha o copo de cultura com 1,5 mL de meio IESC e certifique-se de que exatamente 200 μL de meio estejam presentes no inserto do transwell para que as linhas de fluido coincidam no momento da medição.
  2. Exponha o aspecto basolateral das inserções transwell a citocinas inflamatórias de 25 ng IL-1β, 10 ng e 25 ng de interleucina 6 (IL-6) por poço, ou produtos gliais de culturas expostas a 10 ng ou 25 ng IL-1β. Exponha o aspecto basolateral das inserções transwell de controle à glia média e à glia média de culturas não expostas à IL-1β.
  3. Meça o TEER por 45 min em intervalos de 10-15 min, colocando cada transwell no copo de cultura.

6. Estatísticas

  1. Calcule a mudança de dobra do TEER de cada poço de trans para os pontos de tempo: 0, 10, 20, 30 e 45 min.
  2. Utilizando o software de escolha (consulte a Tabela de Materiais), compare as correlações entre a diminuição do TEER e a exposição basolateral a IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng e 100 ng) e meios de glia (expostos a 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β e 25 ng IL-1β) para controlar os meios usando um teste t unicaudal não pareado.

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Resultados

A microdissecção do jejuno equino para a camada submucosa (Figura 1) com posterior digestão enzimática e mecânica, poderia produzir culturas celulares viáveis de glia entérica equina. As células demonstraram um pleomorfismo com dominância de células fusiformes consistentes com a glia entérica de outras espécies (Figura 2A). As culturas foram positivas para o marcador glial seletivo, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), com baixa contaminação por fibroblastos (a...

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Discussão

O objetivo deste estudo foi desenvolver um método repetível de cultura primária de glia entérica submucosa equina e demonstrar sua aplicação para modelar interações epitelial-gliais no momento da cólica. O isolamento e a cultura da glia entérica, que são novos no cavalo, provaram ser benéficos na compreensão das vias da doença intestinal em modelos de porcos e roedores e em humanos 6,7,13,14.

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à Morris Animal Foundation pelo financiamento deste projeto.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 M HEPES bufferGibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Diaminidino-2-PhenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Anticorpo de actina de músculo liso alfaAbcam7817
Anfotericina BSigmaAA95294,4 g/mL alíquotas de estoque, concentração final 1,1 µ g / mL
Anti-Antimicótico 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
Albumina de Soro BovinoSigmaAA3311
BSA 50 mg / mL solução estoqueSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Componente do Equine Ringer ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2.
Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".
ColagenaseSigma9891
DMEM-F12 mídiaThermo Fisher11320033
burro anti-coelho IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm eletrodo duplo Câmara de medição TEERPrecision InstrumentsEVM-EL-03-01
Manual EVOM para medição TEERWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
Solução de GentamicinaSigmaG1272Concentração final 20 µ g/mL
de anticorpo GFAPAbcam4674
IgG anti-camundongo de cabra Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Componente da campainha equina ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2.
Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".
Solução de L-glutaminaCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Componente da campainha equina ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2.
Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Componente do Equine Ringer ' s Stock 2: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2.
Combine com Equine Ringer' s Estoque 1 para fazer completo " Campainha' 's Solução".
NaClThermo FisherS271-10Componente da campainha equina ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2.
Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500Componente da campainha equina ' s Stock 2: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2.
Combine com Equine Ringer' s Estoque 1 para fazer completo " Campainha' 's Solução".
NaHCO3Thermo FisherS637-212Componente do Equino Ringer ' s Stock 2: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2.
Combine com Equine Ringer' s Estoque 1 para fazer completo " Campainha' 's Solução".
Solução de caneta / estreptococoGemini400-109
Poli-L-lisinaSigmaP26360,5 mg / mL em 1x tampão de borato
Software PrismGraphPad
ProteaseSigmaP4630
Solução de bicarbonato de sódioSigmaS8761Solução de estoque de 7,5%
World

Referências

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