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Validação da conjugação de agentes terapêuticos para dispositivos médicos revestidos com álcool polivinílico

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DOI:

10.3791/67358

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29 de novembro de 2024

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1Department of Surgery, LSU Health Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, LSU Health Shreveport

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para derivatizar dispositivos médicos com terapêutica proteica conjugando terapêutica proteica a uma membrana de álcool polivinílico fundida em dispositivos médicos. A conjugação de terapêuticas baseadas em proteínas permite a administração localizada e concentrada e é uma abordagem econômica que requer quantidades muito mais baixas de medicamentos para dosagem, minimizando os efeitos fora do alvo.

Resumo

As terapêuticas baseadas em proteínas são frequentemente limitadas por sua via de administração e incapacidade de confiná-las ao seu local de ação. Uma abordagem inovadora que desenvolvemos é ligar covalentemente a terapêutica de proteínas a dispositivos médicos, permitindo uma entrega mais localizada e altamente concentrada desses agentes ao local de ação pretendido. Este estudo tem como objetivo avaliar se o peptídeo-2 semelhante ao glucagon (GLP-2) pode ser ligado covalentemente aos dispositivos de manga de expansão vaginal (VES) e manga de expansão intestinal (IES) em quantidades clinicamente relevantes e mensuráveis.

As mangas de expansão foram revestidas com álcool polivinílico (PVA) e reticuladas com vapor de glutaraldeído/ácido sulfúrico para criar uma superfície quimicamente ativa capaz de se ligar a terapias contendo amina, como o GLP-2. Uma curva padrão foi criada ligando 250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg e 0 μg de GLP-2 a poços revestidos com PVA de uma placa de 24 poços. Um padrão ELISA foi criado usando um anticorpo anti-GLP-2 de coelho seguido por um anticorpo secundário de fosfatase alcalina IgG de cabra anti-coelho mais um substrato de micropoço azul de fosfatase alcalina. A colorimetria (amarelo a azul a 620 nm) foi proporcional à concentração de anticorpos ligados ao GLP-2, permitindo o cálculo da concentração ligada de GLP-2 nas mangas revestidas com PVA. A adição de 50 μg de GLP-2 aos dispositivos IES/VES ligou uma média de 22,69 ± 9,32 μg/cm2 de GLP-2 com uma área de superfície IES/VES externa (9,425cm2), indicando que 44% do GLP-2 adicionado foi imobilizado nas mangas IES/VES revestidas com PVA.

A dosagem atual de GLP-2 humana é de 50 μg/Kg. Como cada manga carrega 22 μg, isso é aproximadamente 44% de uma dose sistêmica em um único dispositivo. Essa metodologia torna possível adicionar doses drasticamente mais baixas de agentes terapêuticos para obter o mesmo efeito que a administração sistêmica do medicamento GLP-2, ao mesmo tempo em que evita efeitos sistêmicos.

Introdução

Terapêuticas baseadas em proteínas, como enzimas, anticorpos, citocinas, hormônios e fatores de crescimento, têm se mostrado altamente eficazes no tratamento de várias doenças1. Se melhorarmos nossa compreensão de como fornecer esses agentes terapêuticos, poderemos avançar significativamente a biotecnologia para a aplicação dessas substâncias como medicamentos/tratamentos médicos1. A eficácia da terapêutica proteica é limitada por sua biodistribuição, custo e efeitos fora do alvo. Várias abordagens têm sido tentadas para melhorar a farmacocinética e a farmacodinâmica da terapêutica proteica, incluindo PEGilação, glicosilação, lipidação e fusão de outras proteínas2. A 'direcionabilidade' é outra preocupação porque a maioria das terapias proteicas atuais tem vários locais de ação, resultando em efeitos fora do alvo. Especificamente, direcionar esses medicamentos para os locais desejados pode diminuir a dose terapêutica necessária e reduzir os efeitos colaterais2. Se alguém pudesse restringir a administração do medicamento ao local de ação pretendido, poderia ser possível melhorar radicalmente o tratamento e, ao mesmo tempo, limitar os efeitos colaterais indesejáveis "fora do alvo" desses medicamentos.

Atualmente, vários dispositivos médicos estão sendo usados que contêm terapêuticas, como stents farmacológicos com revestimento antiproliferativo contendo clopidogrel, vincristina e vimblastina para ajudar a prevenir a reestenose e a necessidade de revascularização repetida após cateterismo cardíaco3. Além disso, stents ureterais biodegradáveis com paclitaxel, doxorrubicina, gencitabina e outros agentes antiproliferativos foram criados para ajudar a tratar o carcinoma urotelial do trato superior4. À medida que esses stents se degradam, os fármacos antitumorais são liberados localmente de forma controlada, prolongando a liberação do fármaco sem a necessidade de dosagem adicional4. Essa metodologia permite o efeito a longo prazo dos medicamentos antitumorais no local de ação pretendido, ao mesmo tempo em que previne a necessidade de exposição sistêmica, limitando a ação do medicamento em células não tumorais e reduzindo a toxicidade do medicamento. Além disso, a natureza biodegradável do stent também pode evitar a necessidade de um procedimento de remoção do stent4.

A síndrome do intestino curto (SIC) é outra condição em que o uso de terapias à base de proteínas mostrou melhora significativa nos pacientes5. A SIC pode ocorrer por vários mecanismos, mas resulta em comprimento intestinal inadequado, causando má absorção e desnutrição. Terapias, como análogos do peptídeo 2 semelhante ao glucagon (GLP-2), podem ser usadas antes de passar para o tratamento cirúrgico dessa condição5. O GLP-2 humano, um hormônio peptídico nutriente sistêmico, é produzido no intestino delgado distal e no cólon por células endócrinas do tipo L. O GLP-2 induz a proliferação de células da cripta intestinal, promove o reparo da mucosa danificada, inibe a apoptose das células epiteliais intestinais e melhora o suprimento sanguinolento intestinal5. Os análogos do GLP-2, como o teduglutido, foram aprovados para pacientes com 1 ano ou mais para o tratamento da SIC para ajudar a aumentar a adaptação intestinal natural6. Naturalmente, a adaptação intestinal pode levar anos e resulta em retardo do esvaziamento gástrico para aumentar o tempo de absorção e aumento do diâmetro por dilatação intestinal para aumentar a área de superfície para absorção7. Os análogos do GLP-2 têm a mesma atividade farmacológica que o GLP-2 natural, embora tenham uma estrutura mais estável, permitindo uma meia-vida mais longa e maior afinidade com os alvos5. Atualmente, o custo anual do teduglutido é de US$ 295.000 e a dosagem do paciente é de 0,05 mg/kg por dia5. Os efeitos colaterais do teduglutido incluem náuseas, vômitos, diarréia, dor abdominal, perda de peso, pólipos gastrointestinais e aumento do crescimento de tumores existentes5.

Anteriormente, nosso laboratório mostrou que a implantação de uma manga de expansão intestinal (IES) (Figura 1) foi capaz de produzir um alongamento imediato de 36,2% do intestino delgado ex vivo e um alongamento de 30,2% do intestino delgado após uma implantação de um mês in vivo 6,8. Este dispositivo pode se tornar uma terapia para pacientes com SIC que pode encurtar a dependência nutricional parenteral. A capacidade de bioconjugar a terapêutica ao dispositivo IES pode melhorar ainda mais a capacidade de enterogênese por distração, adicionando o agonista de crescimento da mucosa intestinal GLP-2 ao dispositivo. As membranas de álcool polivinílico (PVA) são polímeros hidrofílicos que podem ser preparados dissolvendo o PVA em água, lançando-o em um suporte estrutural e, em seguida, reticulando com glutaraldeído usando ácido sulfúrico como catalisador9. Essas nanopartículas de hidrogel demonstraram ter potencial como sistemas de liberação de medicamentos por meio de difusão de medicamentos, inchaço da matriz de hidrogel e reatividade química do medicamento/matriz10. O PVA foi aprovado pela FDA para uso clínico em humanos devido à sua excelente biocompatibilidade e segurança11. A polimerização do PVA resulta em grupos terminais que permitem a bioconjugação12.

Os dispositivos IES/VES têm 3 cm de comprimento com uma área de superfície externa de 9,425 cm2 que é capaz de fundir com membranas de PVA. Essas membranas de PVA podem ser bioconjugadas com GLP-2 para permitir a administração localizada e concentrada de agentes terapêuticos. Diminuir a dose necessária do medicamento e contornar a necessidade de administração sistêmica, evitando efeitos negativos fora do local do tratamento. Isso pode ajudar a mitigar o custo desses medicamentos caros, exigindo menos dosagem, e a liberação tardia do medicamento pode diminuir a frequência da dosagem, reduzindo ainda mais os custos. Revestir o dispositivo IES com GLP-2 pode reduzir as dosagens necessárias, economizar dinheiro dos pacientes, evitar a administração sistêmica, prevenir os efeitos negativos do tratamento e manter uma entrega contínua do medicamento no local alvo. Este relatório avalia até que ponto uma proteína terapêutica, como o GLP-2, pode ser ligada covalentemente a dispositivos médicos, como dispositivos IES / VES em quantidades fisiologicamente significativas para fornecer o benefício local desses medicamentos, evitando efeitos fora do alvo.

Protocolo

NOTA: As seções 1 e 2 são concluídas ao mesmo tempo. O revestimento com PVA e a reticulação da membrana de PVA devem ser feitos ao mesmo tempo para as mangas de expansão e a placa de 24 poços. Isso permite que eles estejam prontos ao mesmo tempo para criar a curva padrão com a placa de 24 poços para usar a absorbância para calcular a concentração de GLP-2 de cada luva.

1. Criação de dispositivos IES e VES revestidos com GLP-2

  1. Faça a solução de PVA a 5% adicionando 5 g de PVA em 100 mL de água deionizada. Para ajudar a dissolver, considere mexer em uma placa de aquecimento. Em seguida, faça a solução de GLP-2 de 1 mg/mL adicionando 1 mg de GLP-2 em 1 mL de água deionizada.
  2. Pré-contraia mangas de expansão intestinal e mangas de expansão vaginal sobre uma pipeta de vidro, estabilizando as extremidades com pipetas de plástico cortadas para se encaixarem firmemente na pipeta de vidro ao redor das mangas pré-contraídas.
  3. Pinte as mangas pré-contraídas com o PVA 5% pré-fabricado usando um pincel pequeno. Depois de pintar uma camada de PVA, deixe as mangas secarem à temperatura ambiente (RT) por 10 min e, em seguida, pinte outra camada para um total de 5 camadas de PVA em cada manga.
  4. Após a secagem da5ª demão, coloque as mangas pré-contraídas em um dessecador sob uma capa de segurança química para permitir que elas se reticulem em RT. Inicie a reticulação adicionando 3 mL de glutaraldeído a 25% e 3 mL de ácido sulfúrico a 94% -98% para separar os copos abertos no dessecador para que os vapores reajam e reticulem as membranas de PVA nas mangas.
  5. Depois de reticular as mangas na câmara por 48 h, retire-as da câmara e deixe o glutaraldeído evaporar das mangas por 15 min.
  6. Em seguida, adicione 50 μL da solução de GLP-2 de 1 mg / mL pipetando cuidadosamente em cada manga. Deixe secar por 30 min em RT antes de remover as mangas pré-contraídas da pipeta de vidro e adicionar cada manga ao respectivo poço na placa de 24 poços.

2. Criando a placa de 24 poços revestida com GLP-2

  1. Para fazer a curva padrão de GLP-2 ligada ao PVA, pipete 50 μL de 5% de PVA no fundo de 18 dos poços destinados a uso de uma placa de 24 poços. Deixe 6 poços em branco para conter os dispositivos IES e VES (3 para cada tipo de dispositivo).
  2. Deixe a camada de PVA secar na placa de 24 poços durante a noite em um forno a 120 °C.
  3. Coloque a placa de 24 poços em um dessecador sob uma capa de segurança química para permitir que o PVA reticule por 48 h em RT. Inicie a reticulação adicionando 3 mL de glutaraldeído a 25% e 3 mL de ácido sulfúrico a 94% -98% para separar os copos abertos para que os vapores possam reagir dentro da câmara para reticular o PVA na placa de 24 poços.
  4. Após reticulação por 48 h, remova a placa de 24 poços da câmara e deixe o glutaraldeído evaporar da placa por 15 min.
  5. Em seguida, faça um gradiente de concentração adicionando 250 μL, 100 μL, 50 μL, 25 μL e 0 μL de solução de GLP-2 de 1 mg/mL em seus poços marcados, criando a placa de 24 poços com 3 poços para cada concentração de GLP-2 (250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg e 0 μg) e 3 poços para cada tipo de manga (IES e VES).

3. Criação de curva padrão e de discernimento da concentração GLP-2 da luva

  1. Depois que as respectivas diluições de GLP-2 forem adicionadas aos poços e as mangas revestidas com medicamentos forem adicionadas aos poços, refrigere a placa durante a noite a 4 ° C para permitir que ocorra a ligação do medicamento.
  2. No dia seguinte, adicione 2 mL de 1 mg/mL de leite em pó em solução de bloqueio de água deionizada em cada poço por 1 h. Após o bloqueio, lave cada poço 3 vezes com PBS por 5 min a cada lavagem.
  3. Faça a solução de anticorpo anti-GLP-2 de coelho adicionando 40 μL de anticorpo anti-GLP-2 de coelho em 50 mL de água deionizada. Em seguida, adicione 2 mL da solução de anticorpo GLP-2 de coelho a cada poço na placa de 24 poços e leve à geladeira durante a noite a 4 ° C.
  4. Após a incubação do anticorpo primário, lave cada poço mais 3x com PBS por 5 min cada lavagem. Faça a fosfatase alcalina IgG anti-coelho produzida em solução de anticorpo secundário de cabra adicionando 20 mL de anticorpo secundário em 40 mL de água deionizada. Em seguida, adicione 2 mL de solução de anticorpo secundário a cada poço e deixe descansar por 2 h em RT.
  5. Aspire a solução de anticorpo secundário e lave cada poço com outra lavagem 3x PBS por 5 min cada. Em seguida, adicione o substrato de micropoço azul de fosfatase alcalina a cada poço.
  6. Deixar a fosfatase alcalina conjugada com o anticorpo secundário reagir com o substrato durante 20 min em RT. À medida que a reação progride, observe a cor da solução mudar de amarelo para azul.
  7. Pare a reação pipetando 200 μL de solução de cada poço e coloque-a em uma placa de 96 poços rotulada da mesma forma que a placa de 24 poços. Uma vez que o reagente é removido da placa de 24 poços com a membrana de PVA conjugada à enzima fosfatase alcalina, a reação será interrompida e a cor não mudará.
  8. Leia a placa de 96 poços usando um leitor de microplacas de absorbância no comprimento de onda de 620 nm para gerar a curva padrão e calcular a concentração de GLP-2 nas mangas revestidas com PVA.

Resultados

Este protocolo descreve o revestimento e a reticulação de dispositivos IES e VES com PVA para permitir a conjugação de GLP-2. A Figura 2 mostra a curva padrão gerada para determinar a concentração de GLP-2 em cada dispositivo. A Figura 3 mostra a concentração de GLP-2 de cada dispositivo IES e VES e a concentração dos poços usados para a curva padrão. As mangas apresentaram concentração média de GLP-2 de 22,69 ± 9,32 μg/cm2, o que correspondeu aos poços de 50 μg da placa de 24 poços, que apresentaram concentração de GLP-2 de 23,7 μg/cm2. Isso mostra que a adição de 50 μg de GLP-2 resulta em 45% do medicamento adicionado permanecendo ligado ao dispositivo médico revestido com PVA.

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Figura 1: Implantação do IES. Este gráfico mostra a implantação in vivo de uma manga de expansão intestinal no modelo de rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Curva padrão. Esta imagem mostra a curva padrão gerada usando um gráfico de linhas com os seguintes valores: Y = mx + b, Y = absorbância a 620 nm, x = concentração, m = 0,0118, B = 0,0734, R2 = 0,966. A placa de 24 poços tinha uma área de superfície de 1,93 cm2, dando as concentrações de GLP-2 de 125,95 μg / cm2, 66,38 μg / cm2, 23,77 μg / cm2, 14,58 μg / cm2 e 0,00 μg / cm2 para os poços de 250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg e 0 μg, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Concentração de GLP-2 para dispositivos e respectivos poços. Este gráfico mostra as concentrações determinadas para cada dispositivo IES e VES e os poços da placa de 24 poços usados para fazer a curva padrão. Após a adição de 50 μg de GLP-2 a cada manga (área de superfície externa de 9,425 cm2), a quantidade de GLP-2 ligada ao dispositivo foi de 22,69 ± 9,32 μg / cm2. Isso corresponde a 23,7 μg/cm2 para o poço de 50 μg da curva padrão. Ao adicionar 50 μg de GLP-2 a essas mangas, 45% do medicamento adicionado foi ligado ao dispositivo após ser lavado várias vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Apresentamos aqui uma metodologia para ligar terapias baseadas em proteínas, como GLP-2, a dispositivos médicos revestidos com PVA e reticulados. A concentração do GLP-2 ligado foi determinada pela criação de uma curva de concentração padrão de GLP-2 em placas de 24 poços revestidas com PVA pela adição de anticorpo anti-GLP-2 de coelho, fosfatase alcalina IgG anti-coelho de cabra e substrato de micropoço azul de fosfatase alcalina. O anticorpo secundário conjugado a uma enzima fosfatase alcalina permitiu a adição de um substrato de micropoço azul de fosfatase alcalina que começa amarelo e, à medida que a fosfatase alcalina ligada ao anticorpo GLP-2 reage com o substrato, ela fica azul. Esta mudança de cor é lida a uma absorbância de 620 nm para criar a curva padrão na Figura 2 e calcular a concertação dos dispositivos IES e VES ligados ao GLP-2 usando sua absorção. Após a adição de 50 μg de GLP-2 a esses dispositivos revestidos com PVA, 45% do medicamento adicionado foi ligado ao dispositivo.

Neste protocolo, a etapa crítica é a etapa de reticulação. Os dispositivos médicos revestidos com PVA requerem mais de 48 h em uma câmara hermética para permitir que os vapores de glutaraldeído a 25% e ácido sulfúrico a 94% a 98% reticulem o PVA nos dispositivos. Essa reticulação permite que a membrana de PVA com grupos reativos seja uma superfície biorreativa estável para se ligar à terapêutica baseada em proteínas para administração direcionada de medicamentos. O uso de 5 demãos foi determinado empiricamente, uma vez que 1-2 demãos resultaram em reexpansão em 1 h, 3 demãos em 24 h, e desejamos que o dispositivo levasse vários dias para se expandir novamente para fornecer uma força de distração ao longo do tempo para expansão intestinal e vaginal. Com uma área de superfície de 9,425 cm2, os dispositivos IES e VES têm o potencial de bioconjugar uma grande quantidade de agentes terapêuticos em comparação com seu pequeno tamanho. Se a etapa de reticulação falhar, a estabilidade da membrana de PVA é diminuída e a capacidade de reter terapêutica bioconjugada é reduzida, como visto pela IES 2 na Figura 3.

A terapêutica baseada em proteínas de ligação covalente a dispositivos médicos revestidos com PVA permite a entrega localizada e concentrada desses agentes aos locais de interesse, ao mesmo tempo em que evita a administração sistêmica e o custo associado e os efeitos fora do alvo. Atualmente, a dose típica de Teduglutido para todos os pacientes é de 50 μg/kg por dia13. Como cada manga carrega 22 μg/cm2, isso é aproximadamente 44% de uma dose sistêmica em um único dispositivo. Com uma área de superfície externa de 9,425 cm2, essas mangas são capazes de fornecer 213,85 μg de GLP-2. Esta é uma dose 4,3 vezes maior que a sistêmica e está localizada na área de interesse. A direcionabilidade permite que menos do medicamento seja usado, ignorando a necessidade de administração sistêmica. Atualmente, a terapia anual com teduglutido custa US$ 295.000 para a dosagem de 50 μg/kg por dia5. Ao conjugar o teduglutido com a manga, a dose do fármaco necessária deve ser diminuída e os efeitos secundários sistémicos minimizados. Os efeitos secundários frequentes do teduglutido incluem dor abdominal (28%), reação no local da injeção (26%), náuseas (26%), distensão abdominal (17%), cefaleias (16%) e vómitos (14%)13.

Uma limitação deste estudo é a farmacodinâmica e a farmacocinética da liberação prolongada de GLP-2 do dispositivo médico revestido com PVA bioconjugado. O estudo atual documentou que o GLP-2 pode ser ligado aos dispositivos de PVA reticulado, mas ainda não temos informações sobre quanto tempo o medicamento permanece ligado antes de ser liberado da membrana de PVA e a extensão da liberação total do GLP-2 do local de implantação. Sabemos que após várias etapas de lavagem, o GLP-2 permanece preso ao dispositivo, mas a extensão da conjugação ao dispositivo e como isso afetará a liberação são desconhecidos. Em estudos futuros, pudemos medir a liberação em sobrenadantes de IES e VES armazenados em biofluidos para modelar a liberação in vivo ou recuperar esses dispositivos em diferentes momentos após o implante in vivo para medir o GLP-2 restante. Além disso, planejamos medir se algum fator, como pH, temperatura e umidade, afeta a estabilidade e a taxa de liberação do medicamento do dispositivo. Experimentos futuros determinariam isso implantando uma manga de PVA bioconjugada e medindo a concentração de drogas ao redor da manga em diferentes momentos após a implantação e sob diferentes condições definidas. Sem conhecer a farmacodinâmica da manga revestida com PVA, não podemos determinar como a dosagem localizada de GLP-2 se compararia à dosagem sistêmica típica. Além disso, a capacidade máxima de ligação das mangas revestidas com PVA ainda é desconhecida. Após a adição de 50 μg, determinou-se que 45% do fármaco adicionado permanecia ligado à manga. Isso pode significar que já excedemos a capacidade máxima de encadernação. Estudos futuros adicionando diferentes concentrações de GLP-2 a cada manga são necessários para determinar a verdadeira capacidade máxima de ligação desses dispositivos e a taxa de liberação com doses variadas.

Aqui, validamos a capacidade de conjugação terapêutica para nossos dispositivos médicos revestidos com PVA. Os resultados mostram que 44% do GLP-2 adicionado estava covalentemente ligado aos dispositivos IES e VES, permitindo a entrega altamente concentrada e local de terapias baseadas em proteínas, como o GLP-2. Espera-se que a administração localizada de medicamentos ajude a reduzir os custos do tratamento, aumentar a acessibilidade e diminuir os efeitos colaterais. Essa metodologia pode ser usada para centenas de terapias atuais baseadas em proteínas para melhorar a administração local de medicamentos e melhorar os resultados do tratamento.

Divulgações

Jonathan Steven Alexander e Christen J. Boyer detêm a patente US10537659B2, dispositivos médicos de álcool polivinílico impressos em 3D e métodos de ativação (2017). Os demais autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada por R. Keith White, MD, por meio do Departamento de Cirurgia John C. McDonald Chair Fund, W. Reid Grimes, MD para financiamento por meio do Departamento de Cirurgia Whitney Boggs Endowed Professorship Fund e LSU LIFT2 grant, HSCS-2022-LIFT-002.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IgG anti-coelho (molécula inteira)– Anticorpo peroxidase produzido em cabraSigma-AldrichA0545-1ML
Kit de Substrato de Micropoços BluePhosSera Care5120-0059
GenClone 25-107, Placas de Cultura de Células de 24 Poços de Fundo Plano, Tratado com TC, 100 Placas/UnidadeGenesee Scientific 25-107
GLP-2 Anticorpo Monoclonal Recombinante de Coelho (3K3P5)Invitrogen MA5-42869
Peptídeo-2 semelhante ao glucagon (GLP-2) (1-33), ratoEchelon Biosciences195262-56-7
Glutaraldeído, solução aquosa a 25%Dessecador de polipropileno Sigma-Aldrich111-30-8
Nalgene com torneiraThermoFisher Scientific5310-0250
Poli(álcool vinílico)Sigma-Aldrich9002-89-5
Ácido sulfúrico (grau TraceMetal), Fisher ChemicalFischer ScientificA510-P212

Referências

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Reimpressões e permissões

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