Método para Estudar o Metabolismo em Células Linfóides usando Química para Medir a Incorporação de Puromicina por Citometria de Fluxo

Resumo

O protocolo mostra um método baseado em citometria de fluxo usando química para estudar o metabolismo energético nas células.

Resumo

Após a estimulação do antígeno, as células T virgens sofrem rápida proliferação e expansão para células T efetoras. O metabolismo desempenha um papel importante na geração de biomassa necessária para essas células em rápida proliferação e para a geração de moléculas necessárias para a diferenciação e função das células T efetoras, que influenciam o resultado da resposta imune adaptativa em infecções ou cânceres. As células T virgens reprogramam seu metabolismo após estimulação antigênica para aumentar a geração de ATP, que é necessária para apoiar seu crescimento, biossíntese e funções efetoras. O ATP pode ser gerado em uma célula pela via de fosforilação mitocondrial-oxidativa (OXPHOS) ou pela via glicolítica. Como a maior parte do ATP gerado em uma célula em crescimento é usada para a síntese de proteínas, a síntese de proteínas tem sido usada como um substituto para os níveis de ATP. A síntese de proteínas pode ser medida pela incorporação de puromicina, que imita a adenosina 3 'de um tRNA carregado com uma tirosina modificada e leva ao término espontâneo da tradução de proteínas. Inibidores metabólicos como a 2-desoxiglicose (2DG), que bloqueia a via glicolítica, e a oligomicina (O), que bloqueia o complexo 5 da cadeia de transporte de elétrons (ETC), podem ser usados para estudar as dependências da geração de ATP celular nessas duas vias em conjunto com a avaliação da síntese proteica em um método chamado SCENITH. Descrevemos aqui uma variação desse método que detecta a incorporação de puromicina por citometria de fluxo usando química. Este método de estudo do metabolismo é relativamente fácil e pode ser usado para avaliar populações de células raras, bem como amostras de pacientes, por citometria de fluxo.

Introdução

Nos últimos anos, tem havido uma crescente valorização do importante papel do metabolismo na regulação das células T. O metabolismo celular regula muitas funções críticas nos linfócitos, incluindo a expansão clonal de células T específicas do patógeno e sua diferenciação em subconjuntos de células efetoras, que sintetizam uma variedade de moléculas efetoras, incluindo citocinas inflamatórias e granzimas citolíticas necessárias para matar patógenos¹. O estudo do metabolismo das células T é, portanto, importante tanto para avaliar a função normal das células T quanto para o desenvolvimento de potenciais terapêuticas.

As células T virgens são metabolicamente quiescentes e dependem do metabolismo catabólico e da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para suas necessidades energéticas ^1,2. Após a ativação do receptor de células T (TCR), as células T passam por uma rápida reprogramação metabólica impulsionada em parte pela regulação positiva de transportadores de nutrientes na superfície das células, que aumentam a captação de glicose e vários aminoácidos, incluindo a glutamina, do meio ambiente. Esses blocos de construção de nutrientes são então usados em vias anabólicas para produzir macromoléculas que contribuem para o crescimento celular e suportam o aumento das demandas de energia associadas ao aumento do crescimento e divisão celular ^1,2,3. A reprogramação metabólica em células T ativadas torna as células mais dependentes da glicólise aeróbica e da glutaminólise para suas necessidades energéticas ^1,2,3. Após a estimulação do TCR, a absorção de nutrientes também desempenha um papel crítico na ativação das vias moleculares a jusante³. Por exemplo, a absorção de aminoácidos e o aumento da concentração local de aminoácidos ativam a sinalização mTORC1⁴. Por outro lado, a redução da disponibilidade de aminoácidos intracelulares diminui a via de sinalização mTORC1 2,3,5,6,7. Assim, o metabolismo e a função celular estão intimamente ligados em uma célula T efetora.

O grande aumento na biomassa necessária para a divisão rápida das células T requer a regulação positiva da síntese / tradução de proteínas⁸. A síntese de proteínas pode ser quantificada em uma célula estudando a incorporação de puromicina⁹, um imitador de tirosil-tRNA que bloqueia a tradução incorporando, marcando e liberando cadeias polipeptídicas alongadas da tradução de ribossomos⁹. A tradução de proteínas é um processo altamente dependente de energia; de fato, a maior parte do ATP gerado na divisão de células em crescimento é usado para a síntese de proteínas. Assim, a síntese de proteínas tem sido usada como uma medida substituta para o ATP¹⁰ celular. Para gerar ATP, as células geralmente dependem da glicólise e/ou da via mitocondrial OXPHOS¹¹. A glicólise gera duas moléculas de ATP por molécula de glicose. A via OXPHOS gera 36 ATPs por glicose^12,13, mas a glicólise pode gerar ATP mais rapidamente¹⁴. Assim, as células T ativadas que se dividem rapidamente, como as células cancerígenas, dependem fortemente da via glicolítica para a geração de ATP.

A dependência de uma célula em cada via metabólica pode ser estudada pelo uso de inibidores específicos. O inibidor da via glicolítica 2-Desoxiglicose (2-DG), que é um análogo da glicose, atua como um inibidor competitivo da enzima glicolítica hexoquinase¹⁵. 2-DG é fosforilado em 2DG-fosfato (2DG-P) pela hexoquinase. A 2DG-P não pode ser metabolizada pela fosfohexose isomerase, que normalmente converte glicose-6-fosfato (G-6-P) em frutose-6-fosfato¹⁶. O 2DG-P é, portanto, aprisionado e se acumula nas células, levando à inibição da glicólise e depleção do ATP celular, bloqueando assim a síntese proteica¹⁷. De maneira semelhante, a dependência das células na via mitocondrial OXPHOS pode ser estudada usando oligomicina, que se liga ao canal de prótons da ATP sintase da cadeia de transporte de elétrons (ETC) ¹⁸, bloqueando assim a síntese de ATP mitocondrial (Figura 1). O uso desses inibidores em conjunto com uma avaliação da síntese proteica pode fornecer uma imagem do estado metabólico das células e tem sido usado em um poderoso método de célula única conhecido como SCENITH, que avalia a incorporação de puromicina usando citometria de fluxo¹⁰. No entanto, a disponibilidade de reagentes SCENITH pode ser limitante. Outras técnicas comumente usadas para avaliar a glicólise e o OXPHOS incluem análises de fluxo extracelular de cavalos-marinhos, que requerem números de células maiores, o que pode não ser experimentalmente viável. Neste artigo, descrevemos um método alternativo para avaliar a incorporação de puromicina usando um reagente químico Click-it disponível comercialmente. A facilidade desse método permite uma avaliação rápida do estado metabólico dos linfócitos, incluindo populações de células raras e amostras de pacientes.

Protocolo

A criação de animais e os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo aprovado G98-3 pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano, NIH, e o protocolo aprovado LISB 22E pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, NIH. Camundongos C57Bl/6J machos com idade entre 6 e 12 semanas, criados e alojados em condições específicas livres de patógenos (SPF), foram usados para o presente estudo. Resultados semelhantes foram obtidos com camundongos fêmeas. O sangue total humano foi obtido do Banco de Sangue do NIH sob o protocolo 99-CC-0168 aprovado pelo NIH Clinical Center IRB Coleta e Distribuição de Componentes Sanguíneos de Doadores Saudáveis para Uso em Pesquisa In Vitro. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos, de acordo com a Declaração de Helsinque.

1. Isolamento e cultura de células T CD4 ⁺ virgens de camundongo

1. Purificar células T CD4⁺ virgens por seleção negativa de suspensões unicelulares agrupadas de baço ou gânglios linfáticos de camundongos machos de 6 a 12 semanas de idade usando um sistema de separação de células magnéticas de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Células de cultura (conforme descrito abaixo) em meio IMDM contendo dipeptídeo L-alanil-L-glutamina e suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 U / mL de estreptomicina e 0,05 mM de 2-β-mercaptoetanol.
3. Células T CD4 virgens de co-cultura em uma proporção de 1:8 com esplenócitos T depletados de T tratados com mitomicina C (descritos abaixo) como APCs em placas de 48 poços sob condições não polarizadas (1 μg/mL de anti-CD3 [clone 2C11] e 3 μg/mL de anti-CD28 [clone 37.51]) e Th0 (1 μg/mL de anti-CD3, 3 μg/mL de anti-CD28, 10 μg/mL de anti-IFNg [clone XMG1.2], anti-IL-12 [clone C17.8] e anti-IL-4 [clone 11B11]) por 72 h a 37 °C. Configure culturas usando 1 x 10⁶ APCs e 0,13 x 10⁶ células T CD4 virgens por poço de uma placa de 48 poços (Tabela de Materiais)
4. Geração de esplenócitos T-depletados tratados com mitomicina C como APCs: Em resumo, core uma suspensão de célula única do baço de camundongo com anticorpos CD4 e CD8 conjugados com FITC. Em seguida, rotule as células magneticamente com Microesferas Anti-FITC (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, usando um sistema de separação de células magnéticas de acordo com o protocolo do fabricante, selecione negativamente as APCs das células T. Em seguida, trate os APCs com 50 μg / mL de mitomicina C por 40 min na incubadora a 37 ° C, seguido de lavagem 3x com 1x PBS.

2. Isolamento e cultura de PBMCs humanos

1. Isole PBMCs de sangue total usando meios de separação de linfócitos e de acordo com o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. PBMCs de cultura em meio RPMI suplementado com 2 mM de L-glutamina, HEPES 0,01 M, piruvato de sódio 1 mM, 1% de aminoácidos não essenciais, 100 U/mL de penicilina e estreptomicina, 0,05 mM de 2-β-mercaptoetanol e 5% de soro humano.
3. Cultura 1 x 10⁶ PBMCs por poço de uma placa de 96 poços com fundo em U com 5 μg/mL de Fitohemaglutinina-L (PHA-L) por 18-24 h a 37 °C.

3. Ensaio metabólico

NOTA: É importante manter todas as células, inibidores [Oligomicina (O), 2-Desoxiglicose (2-DG), DMSO (Co)] e O-propargil-puromicina (OPP) reagentes o mais próximo possível de 37 ° C. Aliquotar as células, inibidores e reagente OPP em placas 96 com fundo em U e deixar as placas em uma incubadora a 37 ° C o máximo possível. Alíquotas de inibidores 2-DG e O em volumes menores para evitar congelamento múltiplo.

1. Fazer uma solução-mãe 2 M (20x) de 2-DG e uma solução-mãe 40 μM (40x) de O. Para OPP, dilua 1 μL de OPP em 49 μL de meio para que a concentração seja de 400 μM - esta será a solução estoque 20x.
2. Certifique-se de que todos os outros componentes do kit de síntese de proteínas OPP (consulte a Tabela de Materiais) estejam em temperatura ambiente (RT), antes de iniciar o experimento.
3. Prepare 1x tampão de reação OPP diluindo uma alíquota da garrafa do Componente C 1:10 com água deionizada. Após o uso, armazene qualquer solução 1x restante a 2-8 °C.
4. Semeie 0,1-2 x 10⁶ células por poço de placa de fundo redondo de 96 poços para cada condição (Co / DG / O / DGO) em 100 μL de IMDM completo (para células T CD4 de camundongo) ou RPMI completo (para PBMCs humanos) ou qualquer meio completo de escolha. Mantenha a placa na incubadora o máximo possível.
5. Adicione 1x inibidores de soluções estoque (5 μL de 20x DG, Co), (2,5 μL de 40x O) e incube por 15 min a 37 ° C, 5% CO₂. As concentrações finais nas células são 100 mM DG e 1 μM O. Misture os inibidores com as células cuidadosamente com uma pipeta. Para facilitar, alíquota os inibidores em uma placa de 96 poços e adicione células aos inibidores e misture bem pipetando para cima e para baixo algumas vezes.
6. Na amostra DGO, adicione 1x de DG (5 μL), misture cuidadosamente com uma pipeta e incube por 10 min a 37 °C, 5% de CO₂. Em seguida, adicione 1x O (2,5 μL), pipete algumas vezes e incube por 5 min a 37 °C, 5% de CO₂.
7. Sem lavar os inibidores, adicione 5 μL de OPP da solução estoque 20x (400 μM) a cada amostra para que a concentração seja de 20 μM nas células, pipete para cima e para baixo várias vezes e incube 30 min a 37 ° C, 5% CO₂. Para facilitar, alíquota de OPP em uma placa de 96 poços, adicione células com inibidores ao reagente OPP e misture bem.
   NOTA: Para células menos metabolicamente ativas e células isoladas diretamente ex vivo, aumente o tempo de incubação após a adição de OPP. O tempo de incubação com OPP precisa ser padronizado para cada tipo de célula.
8. Após a incubação com OPP, adicione 100-150 μL de tampão FACS gelado (2% de FBS e 1 mM de EDTA em 1x PBS). Centrifugue a 750 x g por 2 min a 4°C. Rejeitar o sobrenadante e repetir o passo de lavagem.
9. Células coradas com marcadores de superfície apropriados, anticorpo CD4 de camundongo (usado em diluição de 1/200) ou anticorpo anticorpo CD4 humano (usado em diluição de 1/50), reagente vivo/morto (usado em diluição de 1/600), na presença de Fc Block (usado em diluição de 1/200). Incubar durante 25-30 min a 4 °C no escuro.
10. Lave a placa com 150-200 μL de tampão FACS e centrifugue a 750 x g por 2 min a 4 °C. Agite suavemente a placa para descartar o sobrenadante e repita a etapa de lavagem. Nesta fase, as células são coradas na superfície.
11. Ressuspenda as células em PFA a 1% em PBS, misture bem e incube por 10-15 min a 4 ° C. Proteja da luz.
12. Lave com FACS Buffer e centrifugue a 750 x g por 2 min a 4 °C e repita a lavagem.
13. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão de permeabilização de saponina 1x frio (0,1% (peso / vol) de saponina + 3% de FBS em 1x PBS). Incubar em RT, protegido da luz por 5-15 min. As células são fixadas e permeabilizadas neste momento.
14. Prepare 1x aditivo tampão de reação OPP (Componente E) diluindo a solução 10x 1:10 em água deionizada. Prepare esta solução fresca e use-a no mesmo dia.
15. Prepare o coquetel de reação OPP de acordo com a Tabela 1. Use o coquetel de reação dentro de 15 minutos após a preparação.
16. Centrifugue as amostras da etapa 3.13 a 750 x g por 2 min. Descarte o sobrenadante. Lave as células 2x com 200 μL de 1x tampão de permeabilização de saponina. Gire e descarte o sobrenadante.
17. Adicione 50-100 μL de coquetel de reação OPP (preparado na etapa 3.12) a cada poço e misture bem. Incubar por 30 min em RT, protegido da luz. Em seguida, gire as placas a 750 x g ou 2 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
18. Ressuspenda o pellet em 200 μL de tampão de permeabilização de saponina 1x e centrifugue amostras a 750 x g por 2 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
19. Ressuspenda em 50 μL de tampão de enxágue de reação (Componente F) por poço e centrifugue a 750 x g por 2 min a 4 ° C. Ressuspenda as células coradas em 200 μL de tampão FACS.
20. Analisar as amostras por citometria de fluxo (ver figura suplementar 1) no mesmo dia ou armazenar as células no escuro a 4 °C e analisá-las no dia seguinte.

4. Análise do ensaio metabólico

1. Medir a incorporação de puromicina (OPP) como substituto da síntese proteica nas seguintes condições: 1) condição de controle (Co); 2) em células onde a via glicolítica é bloqueada por 2-DG; 3) em células onde a via mitocondrial OXPHOS é bloqueada por O; e 4) em células onde as vias glicolítica e mitocondrial são bloqueadas por inibidores (DGO), avaliando a intensidade média de fluorescência (MFI) de OPP (Figura 2).
2. Analise a dependência das células em relação a uma via específica, observando o MFI de OPP em cada condição. Avalie diretamente o MFI como uma medida da síntese de proteínas. Calcule a dependência de glicose, capacidade glicolítica, oxidação de ácidos graxos (FAO) e capacidade de oxidação de aminoácidos (AAO) e dependência mitocondrial de acordo com¹⁰.

Resultados

Células T CD4⁺ virgens foram isoladas do baço e linfonodos de camundongos e diferenciadas para linhagens Th0 ou não polarizadas (NP) por 72 h. As células foram colhidas após 0 h, 48 h e 72 h de cultivo, e a incorporação de OPP foi medida observando o MFI do OPP. As células T CD4 ⁺ virgens eram menos sintéticas do que as células T ativadas, como visto pelo MFI do OPP (Figura 3). As células virgens eram parcialmente dependentes da glicólise, mas mais ainda da via OXPHOS, ...

Discussão

Este trabalho fornece um método para estudar o metabolismo em células linfóides por citometria de fluxo, baseado na tecnologia SCENITH, mas usando marcação química de puromicina incorporada. Embora tenhamos nos concentrado nos linfócitos, este protocolo pode ser ajustado para estudar o metabolismo em qualquer tipo de célula. Este método também é vantajoso para estudar o metabolismo em populações raras de células e amostras de pacientes, onde outras técnicas, como o Seahorse, requerem um ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol	Thermo Fisher	21985-023
Alexa Fluor 488 anti-Puromicina Anticorpo	Biolegend	381506	Diluição usada: 1/100
Alexa Fluor 647 anti-humano CD4 Anticorpo	Biolegend	357422	Diluição usada:  1/50
BD Horizon BUV737 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	612761	Diluição usada:
Kit de Ensaio de Síntese de Proteínas Alexa Fluor 488 Click-iT Plus OPP	Thermo Fisher	C10456
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
Soro Humano	Millipore	Sigma H4522
IMDM, Suplemento GlutaMAX, 500 ml	Thermo Fisher	31980030
InVivoMAb anti-mouse CD28, Clone:  37.51	BioXcell	BE0015-1
InVivoMAb anti-mouse CD3ε, Clone:  145-2C11	BioXcell	BE0001-1
InVivoMAb anti-mouse IFNγ, Clone:  XMG1.2	BioXcell	BE0055
InVivoMAb anti-mouse IL-12 p40, Clone:  C17.8	BioXcell	BE0051
InVivoMAb anti-mouse IL-4, Clone:  11B11	BioXcell	BE0045
L-Glutamina (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Aqua Fixável, para excitação de 405 nm	Thermo Fisher	L34966	Diluição usada:  Meio
separação de linfócitos LSM	MP Biomedicals	50494X
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)	Thermo Fisher	11140050
Mitomicina C de Streptomyces caespitosus	Sigma	M0503-10X2MG
Naive CD4 Kit de Isolamento, camundongo	Miltenyi Biotec	130-104-453
Paraformaldeído 16% Solução Aquosa	Ciências de Microscopia Eletrônica	15710
PBS (1X), pH 7.4, 500 mL	Quality Biologicals	114-058-101
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL). 100mL	Thermo Fisher	15140122
Fitohemaglutinina-L (PHA-L)	Millipore Sigma	11249738001
Soro Fetal Bovino de Grau Premium (FBS)	Avantor	97068-085
RPMI 1640 Médio, sem glutamina	Thermo Fisher	21870076
Saponina	Thermo Fisher	A18820.22
Piruvato de Sódio (100 mM)	Thermo Fisher	11360070

1/200 de 1/600 de Grau EM