Artigo de método

Espectroscopia óptica correlativa e metodologia de imagem por espectrometria de massa para visualizar a distribuição de medicamentos em uma seção de tecidos moles

DOI:

10.3791/67383

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20 de junho de 2025

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1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

Neste artigo

Resumo

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Este estudo apresenta um método para imagens correlativas de drogas em tecidos moles usando espectroscopia óptica não linear e imagens de espectrometria de massa. A combinação de imagens de pele de alta resolução com detecção de medicamentos sensíveis oferece uma abordagem valiosa para estudar a distribuição de medicamentos na pele, crítica para o desenvolvimento de produtos tópicos superiores.

Resumo

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Uma nova metodologia de imagem correlativa que combina resolução espacial submicrônica com detecção sensível de drogas por espectroscopia óptica e espectrometria de massa foi desenvolvida para visualizar a distribuição química após a aplicação de drogas em tecidos moles. Neste exemplo, o método foi testado em tecido cutâneo excisado após a aplicação tópica in vitro de um medicamento anti-inflamatório não esteróide comercial por 16 horas. Métodos espectroscópicos ópticos não destrutivos, incluindo espalhamento Raman estimulado, geração de segundo harmônico e microscopias de fluorescência de dois fótons, foram empregados pela primeira vez para mapear a estrutura e morfologia da pele. Posteriormente, as mesmas amostras de tecido da pele foram analisadas por espectrometria de massa de íons secundários por tempo de voo (ToF-SIMS), o que permitiu maior sensibilidade para a detecção de diclofenaco nas camadas mais externas da pele - epiderme e derme. Métodos de registro de imagem foram desenvolvidos para integrar os dados ópticos e espectrométricos de massa. Essa abordagem combina visualização de alta resolução e sem marcação da estrutura do tecido com detecção química sensível e representa uma ferramenta valiosa para investigar a distribuição de medicamentos na pele e, potencialmente, em outros tecidos biológicos moles.

Introdução

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Compreender a taxa, a extensão e os impulsionadores da distribuição de ingredientes farmacêuticos ativos nos tecidos biológicos moles após sua aplicação tópica ou sistêmica é crucial para elucidar os mecanismos subjacentes à absorção, metabolismo e depuração de medicamentos específicos do tecido (ou seja, uma compreensão mais profunda da farmacocinética do medicamento). Aqui, apresentamos um novo método de imagem correlativo que integra espectroscopias ópticas não lineares e imagens de espectroscopia de massa para visualização sem marcação da estrutura do tecido e a distribuição de medicamentos tópicos na mesma amostra de tecido1.

A espectroscopia Raman (RS) surgiu como uma ferramenta valiosa para mapear a distribuição de fármacos dentro de células e tecidos com alta resolução espacial e especificidade molecular2. O RS depende do espalhamento inelástico da luz3 por uma amostra de interesse, permitindo uma caracterização química detalhada por meio dos modos vibracionais característicos das moléculas nela contidas, sem a necessidade de marcadores externos. No entanto, os longos tempos de aquisição para produzir imagens de alta resolução podem comprometer a integridade de amostras biológicas sensíveis. Além disso, ao sondar camadas mais profundas do tecido, o espalhamento e a absorção de luz pelo tecido podem atenuar o sinal Raman, limitando ainda mais sua sensibilidade. A microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS) representa um avanço significativo em relação ao RS convencional, aproveitando a excitação do laser pulsado e a detecção do sinal Raman estimulado4. A microscopia SRS permite a aquisição rápida de imagens 2-D e 3-D com alta resolução espacial e - quando realizada em conjunto com microscopias de geração de segundo harmônico (SHG) e fluorescência excitada por dois fótons (TPEF) - pode fornecer uma imagem abrangente dos tecidos conjuntivos, colágeno e elastina 1,5,6,7,8,9 . A microscopia SHG é uma técnica óptica não linear que se baseia na interação da luz com estruturas não centrossimétricas em uma amostra, gerando um sinal na metade do comprimento de onda da luz incidente. É particularmente útil para imagens de estruturas ordenadas como colágeno em tecidos biológicos. TPEF é outra técnica de microscopia não linear em que dois fótons de baixa energia excitam simultaneamente um fluoróforo, fazendo com que ele emita fluorescência. O TPEF permite imagens de tecidos profundos com fotodano reduzido, pois a luz de excitação está na faixa do infravermelho próximo, que penetra mais profundamente nas amostras biológicas.

A imagem por espectrometria de massa (MSI) é uma técnica analítica poderosa que combina os recursos da espectrometria de massa com informações espaciais, permitindo a identificação sem marcação de uma ampla gama de moléculas 10,11,12. A espectrometria de massa de íons secundários por tempo de voo (ToF-SIMS) opera bombardeando a superfície da amostra com íons primários de alta energia, causando a ejeção de íons secundários da superfície. Esses íons secundários são então acelerados em direção a um analisador de tempo de voo, onde suas relações massa-carga são determinadas. Essa análise permite a identificação de fragmentos moleculares e variações isotópicas com alta sensibilidade e resolução. Aplicações valiosas de ToF-SIMS foram demonstradas em pesquisas biológicas e farmacêuticas para o estudo de produtos químicos e biomoléculas em células13, tecidos14,15 e órgãos15.

Tanto o SRS quanto o ToF-SIMS foram usados independentemente para estudar a distribuição de medicamentos em diferentes modelos de pele. No entanto, é mais valioso usar essas técnicas em combinação para se beneficiar de sua complementaridade. Neste estudo, descrevemos um fluxo de trabalho para combinar as microscopias ópticas (SRS, TPEF e SHG) com ToF-SIMS para obter imagens da morfologia da pele com resolução espacial submicrônica (fornecida pelos métodos ópticos) sobreposta ao sinal do medicamento detectado com sensibilidade superior (fornecido pelo ToF-SIMS). A abordagem foi usada para abordar o exemplo desafiador de visualizar a distribuição de diclofenaco em tecidos cutâneos excisados tratados com uma formulação tópica comercial (gel Voltaren). Os critérios de sucesso incluíram alta sensibilidade química para detectar diclofenaco em sua concentração terapêutica e resolução espacial suficiente para resolver a estrutura da pele. Embora o conteúdo de diclofenaco em diferentes camadas da pele possa ser quantificado após o tratamento tópico por meio de métodos trabalhosos e tecnicamente exigentes, como remoção de fita seguida de quantificação16, ou por meio de microperfusão de fluxo aberto17, essas abordagens não podem elucidar a partição, penetração, retenção e distribuição de profundidade do diclofenaco dependente do excipiente nas camadas individuais da pele, que são fatores essenciais que auxiliam a fase de desenvolvimento do produto.

Antes da metodologia de medição descrita abaixo, o gel Voltaren Forte (contendo 2,32% de diclofenaco dietilamônio) ou um gel placebo correspondente (fornecido pela Haleon CH SARL) foi aplicado na superfície da pele por diferentes períodos (4, 12, 16 ou 24 h). Após a remoção de qualquer formulação residual, foram realizadas medições de SRS e ToF-SIMS nas mesmas amostras de pele; Detalhes completos da metodologia estão descritos no manuscrito original1.

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Protocolo

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Declaração ética: Amostras de pele humana foram obtidas da Tissue Solutions Ltd, Glasgow, Reino Unido, pela Charles River Laboratories (CRL) em Edimburgo, Reino Unido. Todas as amostras anônimas foram adquiridas de acordo com os padrões legais e éticos do país de coleta, com aprovação ética e consentimento informado dos doadores ou de seus parentes mais próximos.

1. Seccionamento da pele

Um criostato foi usado para produzir seções dos tecidos da pele.

  1. Transporte os discos de pele tratados para fora do freezer a -20 °C e corte um pequeno pedaço (~1.0 cm x 1.0 cm) do centro do disco.
  2. Monte a amostra no mandril no criostato sobre uma gota de água congelada. Não use composto de temperatura de corte ideal (OCT) ou outro meio de incorporação.
  3. Ajuste a temperatura da lâmina e da amostra em - 20 °C e - 16 °C, respectivamente.
  4. Seção de seção de 30 μm de espessura em uma lamínula de vidro (# 1.5, Fisher Scientific).
  5. Execute SRS e ToF-SIMS imediatamente ou, alternativamente, a amostra pode ser embalada a vácuo para armazenamento a -80 °C.
  6. Dessece por 20 min antes de usar.

2. Imagem SRS

A microscopia SRS, SHG e TPEF foi realizada usando um microscópio Raman coerente. Dois pulsos de laser de picossegundos foram gerados por um feixe de Stokes de 1031,2 nm, sobrepostos espacial e temporalmente com um feixe de bomba ajustável. O feixe de Stokes, modulado em 20 MHz, facilitou a detecção de sinais de perda Raman estimulados via transmissão. Um detector à base de silício, acoplado a um amplificador de bloqueio, foi utilizado para detecção de sinal. Outro canal foi empregado para coletar sinais de fluorescência de segundo harmônico e emitido, empregando um tubo fotomultiplicador para detecção.

  1. Instale lentes objetivas e condensadoras adequadas para imagens de tecidos multifotônicos, neste caso uma lente de ampliação de 40x de imersão em água (1,1 NA) em conjunto com uma lente condensadora de ar de curta distância de trabalho (0,9 NA).
  2. Coloque a seção de tecido montada no microscópio SRS sample stage para que o tecido fique na mesma face da lâmina do microscópio que a lente do condensador. Foque a lente objetiva na seção de tecido e, em seguida, otimize a altura do condensador.
  3. Defina a potência do laser para valores apropriados para obter uma boa relação sinal-ruído sem danificar o tecido. Neste exemplo, aproximadamente 10 mW para o feixe da bomba e 30 mW para o feixe de Stokes foram aplicados na amostra. Consulte Tsikritsis et al para considerações práticas para medições de SRS4.
  4. Adquira uma imagem em mosaico de toda a seção com resolução de 512 x 512 pixels correspondente a 290 μm x 290 μm no zoom X1 com uma velocidade de imagem de 400 Hz e média de linha de 1 a 2850 cm-1 correspondente ao alongamento CH2 .
  5. Dentro da imagem em mosaico de todo o corte, escolha uma região de interesse (ROI) com as seguintes considerações: (i) ela está posicionada no centro, evitando os 20% mais externos do perímetro da amostra, onde poderia haver pele não dosada que foi pinçada no aparelho de células de Franz; ii) é suficientemente plano para ser examinado dentro do mesmo nível de profundidade óptica; iii) tem características estruturais distintas que ajudariam à sua identificação visual quando a amostra é transferida para o ToF-SIMS.
  6. Aplique configurações de ganho consistentes em todo o estudo para detectores SRS e SHG/fluorescência e adquira imagens (i) na região de alongamento CH (a 2945 cm-1, 2850 cm-1 e 2650 cm-1 correspondendo a CH3, CH2 e controle fora de ressonância, respectivamente); (ii) a região da impressão digital (a 1666 cm-1 e 1723 cm-1 correspondendo à Amida I e ao controle de ressonância, respectivamente); (iii) o número de onda correspondente à ressonância on-line e off-resonância relacionada ao fármaco aplicado; neste exemplo, a 1586 cm-1 e 1530 cm-1 correspondendo a C = C e off-ressonância, respectivamente.

Após a imagem SRS, transfira imediatamente a amostra para a configuração ToF-SIMS para análise.

3. Imagem ToF-SIMS

A imagem de espectrometria de massa de íons secundários por tempo de voo foi realizada usando um feixe de íons primários Bi3+ de 30 keV com uma corrente de 0,2 pA.

  1. Escolha as configurações de aquisição apropriadas; Neste exemplo, a polaridade negativa do íon foi usada, com um tempo de ciclo de trabalho de 100 ms, uma faixa de massa de m/z 0-900 e um diâmetro de feixe de 5 μm. Um canhão de inundação de elétrons de 20 eV a 5 μA foi usado para compensação de carga.
  2. Adquira uma imagem geral pelo modo raster macro do estágio para mapear toda a seção do tecido com um campo de visão dependendo das dimensões do tecido (no nosso caso, usamos 2,5 a 3,0 mm x 8,5 a 9,0 mm). Esta imagem geral é formada a partir de um mosaico de imagens menores. Neste exemplo, cada um tinha um campo de visão de 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pixels) com 1 feixe de íons disparado por pixel, resultando em uma dose de íons de 8,18 x 108 íons/cm2.
  3. Utilize o mesmo método para capturar imagens do ROI selecionando um campo de visão apropriado; Neste caso, foi de 1,0 mm x 0,5 mm, com 4 disparos por pixel por quadro e 10 quadros por patch, correspondendo a uma dose de íons de 1,31 x 1011 íons/cm2.
  4. Para garantir o controle de qualidade, analise amostras de homogeneizado de tecido imediatamente antes e depois de examinar cada seção de pele. Use um campo de visão de 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pixels) com 1 foto por pixel e 1 quadro por varredura, realizando um total de 15 varreduras. Esta configuração corresponde a uma densidade de dose de íons de 3,27 x 1010 íons/cm2.
  5. Após a aquisição, os espectros de massa resultantes podem ser calibrados usando íons H−, C−, C2− e C3−.
  6. A aquisição e extração dos dados foram realizadas por meio do software Surface Lab 7.1.

4. Registro de imagens e análise de dados usando MATLAB

  1. Reduza as imagens SIMS e SRS para 3 dimensões, cada uma usando fatoração de matriz não negativa para serem visualizadas como canais de cores vermelho, verde e azul.
  2. Escolha os recursos correspondentes entre essas duas imagens de fatoração não matricial selecionando a ferramenta de seleção de ponto de controle Matlab "cpselect" (Matlab, Mathworks, 2019b e Image Processing Toolbox).
  3. Utilizar as funções "cp2tform" e "imtransform" para realizar o registro, aplicando uma transformação afim com os dados do SIMS como imagens fixas e os dados da espectroscopia óptica como imagens em movimento.
  4. Quando vários picos são detectados nos dados ToF-SIMS para o medicamento de interesse, some as intensidades desses picos para criar uma intensidade combinada de íons do medicamento.
  5. Extraia a contagem total média de íons dos dois conjuntos de dados homogeneizados (antes e depois) para cada amostra de tecido cutâneo correspondente. Usando esse valor correspondente, normalize as intensidades nos dados ToF-SIMS do íon da droga em cada imagem de pele.
  6. Após o registro, crie uma sobreposição dos dados de espectroscopia óptica e SIMS atribuindo as respectivas imagens aos canais RGB: vermelho (imagem SRS para CH2), verde (imagem SHG para colágeno) e azul (imagem SIMS para diclofenaco, incluindo sinais de vários íons em m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 e 296.01).

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Resultados

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A Figura 1 apresenta os resultados do registro de imagem baseado em características, exibindo as imagens de sobreposição registradas de SRS, SHG e SIMS para duas amostras de pele - uma tratada com placebo (Figura 1a) e as demais com gel Voltaren por 4 horas (Figura 1b) e 16 horas (Figura 1c). Nesta imagem, o sinal de intensidade do medicamento somado (das medições ToF-SI...

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Discussão

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Este método permite imagens correlativas com espectroscopia óptica não linear e espectrometria de massa para detectar a distribuição de drogas em tecidos moles com resolução espacial submicrônica e alta sensibilidade. É importante ressaltar que a imagem é obtida sem o uso de rótulos potencialmente interferentes que seriam necessários para microscopias baseadas em fluorescência. A validação adicional do fluxo de trabalho envolveu a coloração convencional de hematoxilina e eosina (H&E) de ...

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Divulgações

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MBB é funcionário da Haleon CH SARL, a instituição financiadora do estudo.

Agradecimentos

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Este estudo foi financiado pela Haleon CH SARL. As contribuições da NAB e do RHG foram parcialmente apoiadas pela Food and Drug Administration (FDA) do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA (HHS) por meio de um prêmio de assistência financeira (1-U01-FD006533). Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Negócios, Energia e Estratégia Industrial do Reino Unido por meio dos projetos NMS/ID74 e NMS/ST18 do Sistema Nacional de Medição do Reino Unido. O conteúdo deste artigo é de responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais, nem um endosso da FDA/HHS ou do governo dos EUA. A NAB agradece o apoio da Comunidade de Ciência de Medição Analítica para o Prêmio CAMS Fellowship 2020, financiado pelo Fundo Fiduciário de Química Analítica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio Raman coerente Leica Microsystemshttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
Amostras de pele humana Tissue Solutions Ltd, Glasgow
Leica CM 1850 Criostato Leica Biosystemshttps://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/
Sistema de laser PicoEmerald-SAPE Berlinhttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5
descontinuado

Referências

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