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Artigo de método

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

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⸱

DOI:

10.3791/67385

⸱

18 de outubro de 2024

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Resumo

A (macro)autofagia representa uma via fundamental de degradação celular. Nesse processo, vesículas de membrana dupla conhecidas como autofagossomos engolfam o conteúdo citoplasmático, fundindo-se posteriormente com os lisossomos para degradação. Além do papel canônico, os genes relacionados à autofagia também modulam uma via secretora envolvendo a liberação de moléculas inflamatórias, fatores de reparo tecidual e vesículas extracelulares (EVs). Notavelmente, o processo de disseminação de proteínas patológicas entre as células, particularmente em doenças neurodegenerativas que afetam o cérebro e a medula espinhal, ressalta a importância de entender esse fenômeno. Pesquisas recentes sugerem que a proteína de ligação ao DNA de resposta transativa 43 kDa (TDP-43), um jogador-chave na esclerose lateral amiotrófica e na degeneração lobar frontotemporal, é liberada de maneira dependente da autofagia por meio de EVs enriquecidas com as proteínas associadas aos microtúbulos marcadores autofagossômicos 1A / 1B de cadeia leve 3B-II (LC3-II), especialmente quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Para elucidar o mecanismo subjacente à formação e liberação de EVs positivas para LC3-II, é imperativo estabelecer um método acessível e reprodutível para avaliar vesículas positivas para LC3-II intracelulares e extracelulares. Este estudo apresenta um protocolo detalhado para avaliação dos níveis de LC3-II via immunoblotting em frações celulares e EV obtidas por centrifugação diferencial. A bafilomicina A1 (Baf), um inibidor da fusão autofagossomo-lisossomo, serve como um controle positivo para aumentar os níveis de vesículas positivas para LC3-II intracelulares e extracelulares. O gene de suscetibilidade tumoral 101 (TSG101) é usado como marcador para corpos multivesiculares. Aplicando este protocolo, demonstra-se que o knockdown da sintaxina-6 mediado por siRNA (STX6), um fator de risco genético para a doença de Creutzfeldt-Jakob esporádica, aumenta os níveis de LC3-II na fração EV de células tratadas com Baf, embora não mostre efeito significativo nos níveis de TSG101. Esses achados sugerem que o STX6 pode regular negativamente a liberação extracelular de LC3-II via EVs, particularmente sob condições em que a fusão autofagossomo-lisossomo é prejudicada. Combinado com métodos estabelecidos para avaliar a autofagia, este protocolo fornece informações valiosas sobre o papel de moléculas específicas na formação e liberação de EVs positivos para LC3-II.

Introdução

A proteína de ligação ao DNA 43 (TDP-43) é uma ribonucleoproteína nuclear heterogênea amplamente expressa, envolvida na regulação do splicing de exons, transcrição gênica e estabilidade de mRNA, todas vitais para a sobrevivência celular 1,2. Em condições neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA) e degeneração lobar frontotemporal (FTLD), uma proteína nuclear TDP-43 se acumula anormalmente no citoplasma. Essa mudança resulta em uma perda da função do TDP-43 no núcleo e um ganho tóxico de função no citoplasma. O acúmulo patológico de TDP-43 começa em regiões específicas do cérebro e da medula espinhal, espalhando-se por essas áreas de forma semelhante a um príon, um processo intimamente associado à progressão da doença3. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a patologia TDP-43 se espalha pelo cérebro e pela medula espinhal permanece desconhecido.

O TDP-43 é secretado através de vesículas extracelulares (EVs), e níveis elevados de TDP-43 são detectados no plasma e no líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com ELA e FTLD-TDP 4,5,6. O LCR de pacientes diagnosticados com ELA e FTLD induz a má localização intracelular e a agregação de TDP-43 endógeno em células de glioma humano7. Assim, o TDP-43 liberado extracelularmente via EVs pode mediar a disseminação célula a célula da patologia TDP-43.

A autofagia é um mecanismo de degradação celular bem preservado que envolve o invólucro de substâncias indesejadas dentro de vesículas de membrana dupla, conhecidas como autofagossomos, que são marcadas por LC3. Esses autofagossomos se fundem com lisossomos positivos para proteína de membrana 1 associada a lisossomos (LAMP1) para formar autolisossomos (LC3+/LAMP1+), levando à degradação de seu conteúdo8. Análises histológicas indicam que autofagossomos que englobam inclusões se acumulam nos neurônios de pacientes esporádicos com ELA9. Alguns genes causais de ELA familiar e FTLD-TDP estão ligados à regulação da autofagia 10,11,12. Esses achados sugerem que a autofagia é suprimida em pacientes com ELA e FTLD-TDP.

O estudo anterior indicou que o TDP-43 é secretado via EVs positivos para o marcador de autofagossomo LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida13. A desregulação da via autofagia-lisossomo pode causar não apenas o acúmulo intracelular de TDP-43, mas também a liberação extracelular de TDP-43 via EVs14. No entanto, ainda não se sabe como os EVs positivos para LC3-II são liberados e quão significativo isso é na disseminação da patologia TDP-43.

Os EVs são classificados em EVs grandes (100 a 1000 nm de diâmetro), que são produzidos a partir do brotamento da superfície celular, e EVs pequenos (50 a 150 nm de diâmetro), que são produzidos a partir do brotamento das membranas endossômicas em direção ao interior do endossomo (conhecido como exossomos) e o aparelho de Golgi. Para coletar separadamente EVs grandes e pequenos, realizamos centrifugação sequencial e coletamos pellets por centrifugação a 20.000 × g e 110.000 × g, respectivamente. A fração P1 EV (pellets de 20.000 × g ) está preparada para coletar EVs grandes, e a fração EV P2 (pellets de 110.000 × g ) está preparada para coletar EVs pequenos15. A metodologia para avaliar os níveis de CL3-II em EVs grandes e pequenas derivadas da centrifugação sequencial por immunoblotting é estável e reprodutível16. Além de analisar os níveis de LC3-II em EVs, a análise da formação de autolisossomos e ômegassomos aumenta a compreensão de como a desregulação da autofagia leva à liberação de EVs positivos para LC3-II. Aqui, o presente estudo mostra o papel supressor da sintaxina 6 (STX6), uma proteína SNARE, que promove o movimento de vesículas de transporte para membranas-alvo17, na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

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Protocolo

1. Preparação da célula, fração P1 e P2 EV do meio cultivado de células HeLa

  1. Preparação da fração P1 e P2 EV a partir do meio cultivado de células HeLa
    1. Dia 1
      1. Conte as células usando um contador de células e semeie 1 × 106 células em uma placa de 6 cm contendo um meio de cultura composto de DMEM High Glucose, 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
    2. Dia 2 (opcional)
      1. Preparar uma solução de siRNA a 20 μM.
      2. Misture 100 μL de meio sérico reduzido e 3 μL de siRNA em um tubo de baixa retenção para preparar a solução A.
      3. Misture 100 μL de meio sérico reduzido e 5 μL de reagente de transfecção em um tubo de baixa retenção para preparar a solução B.
      4. Misture a solução A e a solução B e, em seguida, incube a mistura à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
      5. Adicione a mistura das soluções A e B ao meio usado para cultivar células HeLa. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
    3. Dia 3
      1. Lave as células com PBS e exponha-as a 500 μL de tripsina a 0,25% e solução de EDTA 1 mM a 37 °C com CO5% 2 e umidade controlada por 5 min.
      2. Adicione 2,5 mL do meio de cultura às células e use uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 200 μL acoplada para preparar uma suspensão de célula única.
      3. Conte as células usando um contador de células e semeie 1 × 106 células em uma placa de 10 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
        NOTA: É necessário preparar pelo menos 1 × 106 células para coletar EVs do meio de cultura necessário para a análise de immunoblotting.
    4. Dia 4
      1. Preparar o meio de cultura (ver passo 1.1.1.1) contendo veículo (DMSO) ou Bafilomicina A1 100 nM (Baf).
      2. Expor as células ao meio que contém veículo ou 100 nM Baf e incubá-las a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
    5. Dia 5
      1. Recolha todo o meio de cultura da placa de 10 cm, transfira-o para um tubo de 15 ml e centrifugue-o a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C para remover os restos celulares.
        NOTA: As células restantes na placa de 10 cm serão usadas na seção 1.2.1.
      2. Para o isolamento da fracção P1 EV, transferir o sobrenadante após centrifugação a 3 000 × g para um tubo de centrifugação e, em seguida, centrifugá-lo a 20 000 × g a 4 °C durante 1 h.
      3. Para o isolamento da fracção P2 EV, transferir o sobrenadante após centrifugação a 20.000 × g para um tubo de ultracentrifugação e, em seguida, centrifugá-lo a 110.000 × g a 4 °C durante 1 h.
      4. Depois de limpar o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório, ressuspenda os pellets restantes no tubo de centrifugação em 50 μL de tampão de amostra 2x [2,5% SDS, tampão Tris-HCl 125mM (pH 6,8), 30% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol, 0,4% Azul de Bromofenol] para preparar a fração P1 EV.
      5. Remova o sobrenadante por decantação, limpe o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório e, em seguida, ressuspenda os grânulos restantes no tubo de ultracentrifugação em 50 μL de tampão de amostra 2x para preparar a fração P2 EV.
      6. Incubar as frações EV P1 e P2 a 100 °C num bloco de calor durante 10 min.
        NOTA: Não agite os tubos após centrifugação a 20.000 × g e 110.000 × g para evitar descartar acidentalmente os pellets restantes. Depois de inclinar o tubo para transferir o sobrenadante, mantenha a posição do tubo para evitar que o pellet seja novamente imerso no sobrenadante restante.
  2. Preparação da fracção celular a partir de células HeLa cultivadas
    1. Dia 5
      1. Após a transferência do meio de cultura da placa de 10 cm para um tubo de 15 ml, lavar as células na placa de 10 cm com PBS e expô-las a 2 ml de tripsina a 0,25% e 1 mM de solução de EDTA a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 5 min.
      2. Adicione 8 mL de meio de crescimento às células e, em seguida, use uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 200 μL para pipetar as células e preparar uma suspensão unicelular.
      3. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml e centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C.
      4. Remova o sobrenadante por um aspirador, adicione PBS ao pellet da célula e centrifugue a 1.000 × g por 5 min a 4 ° C.
      5. Remova o PBS usando um aspirador e sonice o pellet celular em 1 mL de tampão A68 [tampão Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,8 M, 1 mM de etilenoglicol bis (éter β-aminoetílico) -N, N, N, N-ácido tetracético (EGTA)] contendo 1% de sarkosil.
      6. Meça a concentração de proteína do lisado celular usando um kit de ensaio de proteína BCA.
      7. Misture 300 μL do lisado celular com 100 μL de tampão de amostra 4x e incube a mistura a 100 ° C em um bloco de calor por 10 min para preparar a fração celular.

2. Análise de immunoblotting

  1. Separar quantidades equivalentes de proteínas nas amostras por SDS-PAGE18.
  2. Transfira as proteínas separadas para as membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
  3. Após a transferência, bloqueie as membranas com o agente bloqueador por 20 min.
  4. Incube a membrana bloqueada durante a noite com o anticorpo primário indicado em tampão Tris contendo 10% (v/v) de soro de bezerro em RT.
  5. Lave a membrana com tampão Tris por 5 s e depois incube-a com um anticorpo secundário conjugado com biotina em RT por 2 h.
  6. Lave a membrana com tampão Tris por 5 s e, em seguida, incube-a com tampão Tris contendo 0,4% (v / v) das soluções A e B do kit em RT por 1 h.
  7. Lave a membrana com PBS e, em seguida, incube-a com PBS contendo 0,04% (p / v) de diaminobenzidina, 0,8% (p / v) de NiCl2 · 6H2O e 0,3% (v / v) H2O2 para detecção colorimétrica de bandas.
    NOTA: Para a detecção de sinais, um método de quimioluminescência também é aceitável.
  8. Digitalize a imagem da membrana por um scanner e submeta-a à análise de densitometria usando Fiji.
    1. Abra a imagem digitalizada usando Fiji e converta a imagem colorida RGB em uma imagem de 8 bits clicando em Imagem | Tipo | 8 bits.
    2. Clique na ferramenta retângulo e ajuste o tamanho do retângulo arrastando-o para cercar as faixas. Identifique a banda a ser analisada clicando em Analisar | Géis | Selecione Primeira faixa.
    3. Posicione o retângulo na segunda banda e nas subsequentes e identifique as bandas para análise clicando em Analisar | Géis | Selecione Próxima faixa.
    4. Depois de reconhecer a banda final, meça a densitometria no retângulo clicando em Analisar | Géis | Traçar pistas.
    5. Cerque a área do sinal da banda com uma linha reta, clique na ferramenta varinha e clique na área para calcular a intensidade do sinal da banda.

3. Análise do número de autofagossomos e autolisossomos

  1. Dia 1
    1. Conte o número de células HeLa usando um contador de células e semeie 1 × 105 células HeLa expressando LAMP1-GFP e mCherry-LC3 em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
  2. Dia 2 (opcional)
    1. Execute os passos descritos na seção 1.1.2 em pratos de 3,5 cm.
  3. Dia 3
    1. Descarte o meio de cultura dos pratos de 3,5 cm.
    2. Lave as células com PBS, exponha-as a 400 μL de tripsina a 0,25% e solução de EDTA 1 mM e incube a 37 ° C com 5% de CO2 e umidade controlada por 5 min.
    3. Adicione 1,6 mL do meio de crescimento às células e pipete-as com uma pipeta de transferência Pasteur para preparar uma suspensão unicelular.
    4. Conte o número de células usando o contador de células e semeie 1 × 104 células em uma lamínula de 8 câmaras. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
      NOTA: Dois poços da lamínula com câmara são preparados para células de controle e knockdown STX6, respectivamente, após o tratamento com DMSO ou Baf, conforme descrito na seção 3.4.2.
  4. Dia 4
    1. Prepare o meio de crescimento sem vermelho de fenol (DMEM sem vermelho de fenol, 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina), contendo veículo (DMSO) ou 100 nM de Baf dissolvido em DMSO.
    2. Substituir o meio de cultura pelo meio sem vermelho de fenol, contendo veículo ou 100 nM Baf, e incubar durante 4 h.
      NOTA: Para avaliar o efeito de Baf nos números de autofagossomas e autolisossomas, prepare células tratadas com veículo como controles.
    3. Manchar os núcleos com 0,33 μg/ml Hoechst 33342 durante 30 min antes da observação.
    4. Realize imagens de células vivas usando uma lente objetiva de 60x em um microscópio confocal a laser e capture dez quadros diferentes.
      1. Abra a imagem mesclada RGB em Fiji e divida-a nos respectivos componentes de imagem vermelho, verde e azul clicando em Imagem | Cor | Canais divididos.
      2. Defina um limite constante para os sinais vermelho e verde em cada imagem clicando em Imagem | Ajustar | Limite para cada experimento.
      3. Conte o número de áreas positivas para sinais vermelhos ou verdes clicando em Analisar | Analisar partículas. Marque a caixa Resumir e clique em OK. Registre os valores da contagem para identificar vesículas associadas a autofagossomos e lisossomos.
      4. Para sobrepor a imagem verde à imagem vermelha, defina o modo de transferência como E clicando em Editar | Controle de colagem. Copie a imagem verde e cole-a na imagem vermelha para mesclá-las, destacando as áreas que são positivas para sinais vermelhos e verdes.
      5. Para identificar números de autolisossomos, conte o número de áreas positivas para sinais vermelho e verde clicando em Analisar | Analisar partículas. Marque a caixa Resumir , clique em OK e registre os valores na seção Contagem para identificar vesículas associadas a autofagossomos e lisossomos.
    5. Divida o número total de autolisossomos e autofagossomos pelo número total de células para calcular o número de autolisossomos e autofagossomos por célula.
      NOTA: Conte pelo menos 35 células em cada um dos três experimentos independentes.

4. Análise para a formação de óssomas

  1. Dia 1
    1. Conte o número de células HeLa usando um contador de células e semeie 1 × 105 células em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
  2. Dia 2 (opcional)
    1. Execute as etapas descritas na seção 1.1.2.
  3. Dia 3
    1. Preparar uma suspensão unicelular conforme descrito nos passos 3.3.1 a 3.3.2.
    2. Conte as células usando o contador de células e semeie 1 × 105 células em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
  4. Dia 4
    1. Misture 1 μg de pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL do reagente de transfecção de DNA e 100 μL de meio de soro reduzido em um tubo de baixa retenção. Incube a mistura por 20 min e adicione-a ao meio cultivado.
    2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
  5. Dia 5
    1. Tripsinize as células conforme descrito nas etapas 3.3.1-3.3.2.
    2. Adicione 2,5 mL do meio de crescimento às células. Pipetar a mistura utilizando uma pipeta de transferência Pasteur para preparar uma suspensão unicelular.
    3. Conte as células usando o contador de células e semeie 1 × 104 células em uma lamínula de 8 câmaras. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 e humidade controlada durante 24 h.
  6. Dia 6
    1. Siga as etapas 3.4.1-3.4.4 para realizar imagens de células vivas das células da etapa 4.5.3 usando um microscópio confocal a laser. Capture dez quadros diferentes de imagens.
      1. Siga as etapas 3.4.4.1-3.4.4.3 para dividir as imagens mescladas RGB nos respectivos componentes de imagem vermelho, verde e azul, defina um limite constante para os sinais verdes em cada imagem e determine a intensidade do sinal GFP. Registre os valores da seção Área Total para determinar a intensidade do sinal de GFP-ATG13.
      2. Divida a intensidade total do sinal pelo número de células examinadas para calcular a intensidade do sinal por célula.
        NOTA: Conte pelo menos 34 células em cada um dos três experimentos independentes.

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Resultados

Como mostrado em estudos anteriores, o tratamento com Baf aumentou os níveis de TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR19) e LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR19) na fração rica em EV. Notavelmente, o tratamento com Baf também aumentou os níveis de STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR19) na...

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Discussão

O estudo de immunoblotting revelou os níveis de LC3-II e TSG101 na fração celular, na fração P1 EV rica em microvesículas e na fração P2 EV rica em exossomos. A imagem de células vivas foi usada para examinar autofagossomos, autolisossomos e ômegassomos, fornecendo informações sobre se o knockdown de STX6 influencia a autofagia. Esses resultados combinados sugerem que o knockdown de STX6 afeta a liberação de EVs positivos para LC3-II, potencialmente ligados à desregulaç...

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Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por financiamento para Y.T. da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência KAKENHI [Grant Number 23K06837] (Tóquio, Japão) e Takeda Science Foundation (Osaka, Japão). Os autores agradecem ao Dr. David C. Rubinsztein (Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, Reino Unido) por fornecer células HeLa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina EDTAFujifilm Wako201-16945
Prato de 10 cmThermo Fisher Scientific150464
Tubo de 15 mLThermo Fisher Scientific339650
200 μ Ponta de Pipeta LNippon GeneticsFG-301pipetagem
2-MercaptoetanolNacalai Tesque21417-52um material para
solução tampão de amostra
3,3'-Diaminobenzidina TetracloridratoNacalai Tesque11009-41um material para solução DAB
3.5 cm Prato Prato Thermo Fisher Scientific150460
6 cm TrueLineTR4001
Banhos termostáticos de bloco de alumínio (termobanhos secos)EYELA273860
AspiradorSANSYOSAP-102solução inalatória
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomicina A1AdipogenBVT-0252
Vetor de anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado com biotina Laboratórios BA-10002º anticorpo para immunoblotting
Anticorpos IgG para Cavalos Conjugados com Biotina IgG Antibody VectorLaboratories BA-20002º anticorpo para immunoblotting
Bloqueando umNacalai Tesque03953-95um material para immunoblotting
Bromophenol BlueNacalai Tesque05808-61um material para
solução tampão de amostra
Calf SerumcytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Scanner
Centrífuga 5702 Reppendolf5703000039
Contando Lâminas Câmara DuplaBio-Rad1450015Jcontagem de células
Sonifier Digital 450BRANSON
Dimetil Sulfóxidonacalai tasque09659-14veículo
DMEM Alta GlicoseNacalai Tesque08458-45meio de cultura
DMEM sem Fenol VermelhoNacalai Tesque08489-45meio de cultura
EGTADojindo 348-01311um material para solução A68
ExcelMicrosoftversão 16.16.27análise satisfatória
EZRReferência nº 24versão 1.68análise satisfatória
FBSSigma173012Meio de cultura
FijiNIHFerramenta de análise de imagem
GlicerolNacalai Tesque09886-05um material para
solução tampão de amostra
Hoehst33342Dojindo H342
Peróxido de hidrogênioFujifilm Wako080-0186um material para solução DAB
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011limpeza lenço
baixa retenção Tubo de baixa retençãoNippon GeneticsFG-MCT015CLBsiRNA e transfecção de DNA
LSM780 Microscópio a laser confocalCarl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 AnticorpoMBLM186-31º anticorpo para immunoblotting
Cloreto de Níquel (II) HexahidratadoFujifilm Wako149-01041um material para solução DAB
N-Lauroilsarcosina Sal de SódioNacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 UltracentrífugaBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Soro Reduzido MeioThermo Fisher Scientific31985-070siRNA e transfecção de DNA
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
Penicilina/EstreptomicinaNacalai Tesque26253-84Meio de cultura
Pierce BCA Protein Assay KitsThermo Fisher Scientific23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNABioAcademia70-0801º anticorpo para imunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 AnticorpoProteinTech10841-1-AP1º anticorpo para immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 AnticorpoProteinTech28283-1-AP1º anticorpo para immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1ProteinTech20986-1-AP1º anticorpo para immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride MembranaMillioreIPVH00010um material para immunoblotting
RR desenvolvimento equipe principalversão 4.4.1análise satisfatória
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA reagente de transfecção
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604 siRNA para transfecção
Cloreto de sódioNacalai Tesque31320-05um material para tampão Tris
e solução A68
Dodecil Sulfato de SódioFujifilm Wako192-13981um material para
solução tampão de amostra
SPARK Microplate ReaderTECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GCThermo Fisher Scientific12935300transfecção de siRNA
SacaroseFujifilm Wako193-00025um material para solução A68
TC20 Contador de células automatizado com impressora térmicaBio-Rad1450109J1contagem de células
ThermobathTOKYO RIKAKIKAIMG-3100incubação
TransIT-293Mirus BioMIR 2700Reagente de transfecção de DNA
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300reagente
de transfecção de DNATris(hidroximetil)aminometanoNacalai Tesque35406-75um material para tampão Tris, tampão de amostra e solução A68
Corante Azul de Tripano 0.40%Bio-Rad1450021contagem de células
Tubo Aberto Ultra-Clear, 16 x 96mm Beckman Coulter361706coleta para a fração P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Coulter344059coleta para a fração P2
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Referências

  1. Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
  2. Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).
  3. Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
  4. Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
  5. Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
  6. Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
  7. Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
  8. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  9. Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
  10. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  11. Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
  12. Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).
  13. Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).
  14. Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
  15. Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  16. Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).
  17. Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
  18. Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
  19. Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
  20. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  21. Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550(2016).
  22. Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
  23. Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
  24. Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

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