Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Resumo

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Resumo

A (macro)autofagia representa uma via fundamental de degradação celular. Nesse processo, vesículas de membrana dupla conhecidas como autofagossomos engolfam o conteúdo citoplasmático, fundindo-se posteriormente com os lisossomos para degradação. Além do papel canônico, os genes relacionados à autofagia também modulam uma via secretora envolvendo a liberação de moléculas inflamatórias, fatores de reparo tecidual e vesículas extracelulares (EVs). Notavelmente, o processo de disseminação de proteínas patológicas entre as células, particularmente em doenças neurodegenerativas que afetam o cérebro e a medula espinhal, ressalta a importância de entender esse fenômeno. Pesquisas recentes sugerem que a proteína de ligação ao DNA de resposta transativa 43 kDa (TDP-43), um jogador-chave na esclerose lateral amiotrófica e na degeneração lobar frontotemporal, é liberada de maneira dependente da autofagia por meio de EVs enriquecidas com as proteínas associadas aos microtúbulos marcadores autofagossômicos 1A / 1B de cadeia leve 3B-II (LC3-II), especialmente quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Para elucidar o mecanismo subjacente à formação e liberação de EVs positivas para LC3-II, é imperativo estabelecer um método acessível e reprodutível para avaliar vesículas positivas para LC3-II intracelulares e extracelulares. Este estudo apresenta um protocolo detalhado para avaliação dos níveis de LC3-II via immunoblotting em frações celulares e EV obtidas por centrifugação diferencial. A bafilomicina A1 (Baf), um inibidor da fusão autofagossomo-lisossomo, serve como um controle positivo para aumentar os níveis de vesículas positivas para LC3-II intracelulares e extracelulares. O gene de suscetibilidade tumoral 101 (TSG101) é usado como marcador para corpos multivesiculares. Aplicando este protocolo, demonstra-se que o knockdown da sintaxina-6 mediado por siRNA (STX6), um fator de risco genético para a doença de Creutzfeldt-Jakob esporádica, aumenta os níveis de LC3-II na fração EV de células tratadas com Baf, embora não mostre efeito significativo nos níveis de TSG101. Esses achados sugerem que o STX6 pode regular negativamente a liberação extracelular de LC3-II via EVs, particularmente sob condições em que a fusão autofagossomo-lisossomo é prejudicada. Combinado com métodos estabelecidos para avaliar a autofagia, este protocolo fornece informações valiosas sobre o papel de moléculas específicas na formação e liberação de EVs positivos para LC3-II.

Introdução

A proteína de ligação ao DNA 43 (TDP-43) é uma ribonucleoproteína nuclear heterogênea amplamente expressa, envolvida na regulação do splicing de exons, transcrição gênica e estabilidade de mRNA, todas vitais para a sobrevivência celular ^1,2. Em condições neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA) e degeneração lobar frontotemporal (FTLD), uma proteína nuclear TDP-43 se acumula anormalmente no citoplasma. Essa mudança resulta em uma perda da função do TDP-43 no núcleo e um ganho tóxico de função no citoplasma. O acúmulo patológico de TDP-43 começa em regiões específicas do cérebro e da medula espinhal, espalhando-se por essas áreas de forma semelhante a um príon, um processo intimamente associado à progressão da doença³. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a patologia TDP-43 se espalha pelo cérebro e pela medula espinhal permanece desconhecido.

O TDP-43 é secretado através de vesículas extracelulares (EVs), e níveis elevados de TDP-43 são detectados no plasma e no líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com ELA e FTLD-TDP ^4,5,6. O LCR de pacientes diagnosticados com ELA e FTLD induz a má localização intracelular e a agregação de TDP-43 endógeno em células de glioma humano⁷. Assim, o TDP-43 liberado extracelularmente via EVs pode mediar a disseminação célula a célula da patologia TDP-43.

A autofagia é um mecanismo de degradação celular bem preservado que envolve o invólucro de substâncias indesejadas dentro de vesículas de membrana dupla, conhecidas como autofagossomos, que são marcadas por LC3. Esses autofagossomos se fundem com lisossomos positivos para proteína de membrana 1 associada a lisossomos (LAMP1) para formar autolisossomos (LC3⁺/LAMP1⁺), levando à degradação de seu conteúdo⁸. Análises histológicas indicam que autofagossomos que englobam inclusões se acumulam nos neurônios de pacientes esporádicos com ELA⁹. Alguns genes causais de ELA familiar e FTLD-TDP estão ligados à regulação da autofagia 10,11,12. Esses achados sugerem que a autofagia é suprimida em pacientes com ELA e FTLD-TDP.

O estudo anterior indicou que o TDP-43 é secretado via EVs positivos para o marcador de autofagossomo LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida¹³. A desregulação da via autofagia-lisossomo pode causar não apenas o acúmulo intracelular de TDP-43, mas também a liberação extracelular de TDP-43 via EVs¹⁴. No entanto, ainda não se sabe como os EVs positivos para LC3-II são liberados e quão significativo isso é na disseminação da patologia TDP-43.

Os EVs são classificados em EVs grandes (100 a 1000 nm de diâmetro), que são produzidos a partir do brotamento da superfície celular, e EVs pequenos (50 a 150 nm de diâmetro), que são produzidos a partir do brotamento das membranas endossômicas em direção ao interior do endossomo (conhecido como exossomos) e o aparelho de Golgi. Para coletar separadamente EVs grandes e pequenos, realizamos centrifugação sequencial e coletamos pellets por centrifugação a 20.000 × g e 110.000 × g, respectivamente. A fração P1 EV (pellets de 20.000 × g ) está preparada para coletar EVs grandes, e a fração EV P2 (pellets de 110.000 × g ) está preparada para coletar EVs pequenos¹⁵. A metodologia para avaliar os níveis de CL3-II em EVs grandes e pequenas derivadas da centrifugação sequencial por immunoblotting é estável e reprodutível¹⁶. Além de analisar os níveis de LC3-II em EVs, a análise da formação de autolisossomos e ômegassomos aumenta a compreensão de como a desregulação da autofagia leva à liberação de EVs positivos para LC3-II. Aqui, o presente estudo mostra o papel supressor da sintaxina 6 (STX6), uma proteína SNARE, que promove o movimento de vesículas de transporte para membranas-alvo¹⁷, na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Protocolo

1. Preparação da célula, fração P1 e P2 EV do meio cultivado de células HeLa

1. Preparação da fração P1 e P2 EV a partir do meio cultivado de células HeLa
   1. Dia 1
      1. Conte as células usando um contador de células e semeie 1 × 10⁶ células em uma placa de 6 cm contendo um meio de cultura composto de DMEM High Glucose, 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
   2. Dia 2 (opcional)
      1. Preparar uma solução de siRNA a 20 μM.
      2. Misture 100 μL de meio sérico reduzido e 3 μL de siRNA em um tubo de baixa retenção para preparar a solução A.
      3. Misture 100 μL de meio sérico reduzido e 5 μL de reagente de transfecção em um tubo de baixa retenção para preparar a solução B.
      4. Misture a solução A e a solução B e, em seguida, incube a mistura à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
      5. Adicione a mistura das soluções A e B ao meio usado para cultivar células HeLa. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
   3. Dia 3
      1. Lave as células com PBS e exponha-as a 500 μL de tripsina a 0,25% e solução de EDTA 1 mM a 37 °C com CO_{5% 2} e umidade controlada por 5 min.
      2. Adicione 2,5 mL do meio de cultura às células e use uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 200 μL acoplada para preparar uma suspensão de célula única.
      3. Conte as células usando um contador de células e semeie 1 × 10⁶ células em uma placa de 10 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
         NOTA: É necessário preparar pelo menos 1 × 10⁶ células para coletar EVs do meio de cultura necessário para a análise de immunoblotting.
   4. Dia 4
      1. Preparar o meio de cultura (ver passo 1.1.1.1) contendo veículo (DMSO) ou Bafilomicina A1 100 nM (Baf).
      2. Expor as células ao meio que contém veículo ou 100 nM Baf e incubá-las a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
   5. Dia 5
      1. Recolha todo o meio de cultura da placa de 10 cm, transfira-o para um tubo de 15 ml e centrifugue-o a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C para remover os restos celulares.
         NOTA: As células restantes na placa de 10 cm serão usadas na seção 1.2.1.
      2. Para o isolamento da fracção P1 EV, transferir o sobrenadante após centrifugação a 3 000 × g para um tubo de centrifugação e, em seguida, centrifugá-lo a 20 000 × g a 4 °C durante 1 h.
      3. Para o isolamento da fracção P2 EV, transferir o sobrenadante após centrifugação a 20.000 × g para um tubo de ultracentrifugação e, em seguida, centrifugá-lo a 110.000 × g a 4 °C durante 1 h.
      4. Depois de limpar o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório, ressuspenda os pellets restantes no tubo de centrifugação em 50 μL de tampão de amostra 2x [2,5% SDS, tampão Tris-HCl 125mM (pH 6,8), 30% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol, 0,4% Azul de Bromofenol] para preparar a fração P1 EV.
      5. Remova o sobrenadante por decantação, limpe o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório e, em seguida, ressuspenda os grânulos restantes no tubo de ultracentrifugação em 50 μL de tampão de amostra 2x para preparar a fração P2 EV.
      6. Incubar as frações EV P1 e P2 a 100 °C num bloco de calor durante 10 min.
         NOTA: Não agite os tubos após centrifugação a 20.000 × g e 110.000 × g para evitar descartar acidentalmente os pellets restantes. Depois de inclinar o tubo para transferir o sobrenadante, mantenha a posição do tubo para evitar que o pellet seja novamente imerso no sobrenadante restante.
2. Preparação da fracção celular a partir de células HeLa cultivadas
   1. Dia 5
      1. Após a transferência do meio de cultura da placa de 10 cm para um tubo de 15 ml, lavar as células na placa de 10 cm com PBS e expô-las a 2 ml de tripsina a 0,25% e 1 mM de solução de EDTA a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 5 min.
      2. Adicione 8 mL de meio de crescimento às células e, em seguida, use uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 200 μL para pipetar as células e preparar uma suspensão unicelular.
      3. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml e centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C.
      4. Remova o sobrenadante por um aspirador, adicione PBS ao pellet da célula e centrifugue a 1.000 × g por 5 min a 4 ° C.
      5. Remova o PBS usando um aspirador e sonice o pellet celular em 1 mL de tampão A68 [tampão Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,8 M, 1 mM de etilenoglicol bis (éter β-aminoetílico) -N, N, N, N-ácido tetracético (EGTA)] contendo 1% de sarkosil.
      6. Meça a concentração de proteína do lisado celular usando um kit de ensaio de proteína BCA.
      7. Misture 300 μL do lisado celular com 100 μL de tampão de amostra 4x e incube a mistura a 100 ° C em um bloco de calor por 10 min para preparar a fração celular.

2. Análise de immunoblotting

1. Separar quantidades equivalentes de proteínas nas amostras por SDS-PAGE¹⁸.
2. Transfira as proteínas separadas para as membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
3. Após a transferência, bloqueie as membranas com o agente bloqueador por 20 min.
4. Incube a membrana bloqueada durante a noite com o anticorpo primário indicado em tampão Tris contendo 10% (v/v) de soro de bezerro em RT.
5. Lave a membrana com tampão Tris por 5 s e depois incube-a com um anticorpo secundário conjugado com biotina em RT por 2 h.
6. Lave a membrana com tampão Tris por 5 s e, em seguida, incube-a com tampão Tris contendo 0,4% (v / v) das soluções A e B do kit em RT por 1 h.
7. Lave a membrana com PBS e, em seguida, incube-a com PBS contendo 0,04% (p / v) de diaminobenzidina, 0,8% (p / v) de NiCl₂ · 6H₂O e 0,3% (v / v) H₂O₂ para detecção colorimétrica de bandas.
   NOTA: Para a detecção de sinais, um método de quimioluminescência também é aceitável.
8. Digitalize a imagem da membrana por um scanner e submeta-a à análise de densitometria usando Fiji.
   1. Abra a imagem digitalizada usando Fiji e converta a imagem colorida RGB em uma imagem de 8 bits clicando em Imagem | Tipo | 8 bits.
   2. Clique na ferramenta retângulo e ajuste o tamanho do retângulo arrastando-o para cercar as faixas. Identifique a banda a ser analisada clicando em Analisar | Géis | Selecione Primeira faixa.
   3. Posicione o retângulo na segunda banda e nas subsequentes e identifique as bandas para análise clicando em Analisar | Géis | Selecione Próxima faixa.
   4. Depois de reconhecer a banda final, meça a densitometria no retângulo clicando em Analisar | Géis | Traçar pistas.
   5. Cerque a área do sinal da banda com uma linha reta, clique na ferramenta varinha e clique na área para calcular a intensidade do sinal da banda.

3. Análise do número de autofagossomos e autolisossomos

1. Dia 1
   1. Conte o número de células HeLa usando um contador de células e semeie 1 × 10⁵ células HeLa expressando LAMP1-GFP e mCherry-LC3 em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
2. Dia 2 (opcional)
   1. Execute os passos descritos na seção 1.1.2 em pratos de 3,5 cm.
3. Dia 3
   1. Descarte o meio de cultura dos pratos de 3,5 cm.
   2. Lave as células com PBS, exponha-as a 400 μL de tripsina a 0,25% e solução de EDTA 1 mM e incube a 37 ° C com 5% de CO₂ e umidade controlada por 5 min.
   3. Adicione 1,6 mL do meio de crescimento às células e pipete-as com uma pipeta de transferência Pasteur para preparar uma suspensão unicelular.
   4. Conte o número de células usando o contador de células e semeie 1 × 10⁴ células em uma lamínula de 8 câmaras. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
      NOTA: Dois poços da lamínula com câmara são preparados para células de controle e knockdown STX6, respectivamente, após o tratamento com DMSO ou Baf, conforme descrito na seção 3.4.2.
4. Dia 4
   1. Prepare o meio de crescimento sem vermelho de fenol (DMEM sem vermelho de fenol, 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina), contendo veículo (DMSO) ou 100 nM de Baf dissolvido em DMSO.
   2. Substituir o meio de cultura pelo meio sem vermelho de fenol, contendo veículo ou 100 nM Baf, e incubar durante 4 h.
      NOTA: Para avaliar o efeito de Baf nos números de autofagossomas e autolisossomas, prepare células tratadas com veículo como controles.
   3. Manchar os núcleos com 0,33 μg/ml Hoechst 33342 durante 30 min antes da observação.
   4. Realize imagens de células vivas usando uma lente objetiva de 60x em um microscópio confocal a laser e capture dez quadros diferentes.
      1. Abra a imagem mesclada RGB em Fiji e divida-a nos respectivos componentes de imagem vermelho, verde e azul clicando em Imagem | Cor | Canais divididos.
      2. Defina um limite constante para os sinais vermelho e verde em cada imagem clicando em Imagem | Ajustar | Limite para cada experimento.
      3. Conte o número de áreas positivas para sinais vermelhos ou verdes clicando em Analisar | Analisar partículas. Marque a caixa Resumir e clique em OK. Registre os valores da contagem para identificar vesículas associadas a autofagossomos e lisossomos.
      4. Para sobrepor a imagem verde à imagem vermelha, defina o modo de transferência como E clicando em Editar | Controle de colagem. Copie a imagem verde e cole-a na imagem vermelha para mesclá-las, destacando as áreas que são positivas para sinais vermelhos e verdes.
      5. Para identificar números de autolisossomos, conte o número de áreas positivas para sinais vermelho e verde clicando em Analisar | Analisar partículas. Marque a caixa Resumir , clique em OK e registre os valores na seção Contagem para identificar vesículas associadas a autofagossomos e lisossomos.
   5. Divida o número total de autolisossomos e autofagossomos pelo número total de células para calcular o número de autolisossomos e autofagossomos por célula.
      NOTA: Conte pelo menos 35 células em cada um dos três experimentos independentes.

4. Análise para a formação de óssomas

1. Dia 1
   1. Conte o número de células HeLa usando um contador de células e semeie 1 × 10⁵ células em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
2. Dia 2 (opcional)
   1. Execute as etapas descritas na seção 1.1.2.
3. Dia 3
   1. Preparar uma suspensão unicelular conforme descrito nos passos 3.3.1 a 3.3.2.
   2. Conte as células usando o contador de células e semeie 1 × 10⁵ células em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
4. Dia 4
   1. Misture 1 μg de pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL do reagente de transfecção de DNA e 100 μL de meio de soro reduzido em um tubo de baixa retenção. Incube a mistura por 20 min e adicione-a ao meio cultivado.
   2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
5. Dia 5
   1. Tripsinize as células conforme descrito nas etapas 3.3.1-3.3.2.
   2. Adicione 2,5 mL do meio de crescimento às células. Pipetar a mistura utilizando uma pipeta de transferência Pasteur para preparar uma suspensão unicelular.
   3. Conte as células usando o contador de células e semeie 1 × 10⁴ células em uma lamínula de 8 câmaras. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
6. Dia 6
   1. Siga as etapas 3.4.1-3.4.4 para realizar imagens de células vivas das células da etapa 4.5.3 usando um microscópio confocal a laser. Capture dez quadros diferentes de imagens.
      1. Siga as etapas 3.4.4.1-3.4.4.3 para dividir as imagens mescladas RGB nos respectivos componentes de imagem vermelho, verde e azul, defina um limite constante para os sinais verdes em cada imagem e determine a intensidade do sinal GFP. Registre os valores da seção Área Total para determinar a intensidade do sinal de GFP-ATG13.
      2. Divida a intensidade total do sinal pelo número de células examinadas para calcular a intensidade do sinal por célula.
         NOTA: Conte pelo menos 34 células em cada um dos três experimentos independentes.

Resultados

Como mostrado em estudos anteriores, o tratamento com Baf aumentou os níveis de TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR¹⁹) e LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR¹⁹) na fração rica em EV. Notavelmente, o tratamento com Baf também aumentou os níveis de STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR¹⁹) na fração EV (Figura 1A), sugerindo que STX6 pode ser um componente de EVs. O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) não foi observado na fração EV. O immunoblotting de STX6 na fração celular revelou que os níveis de STX6 diminuíram pela metade com seu knockdown de siRNA (Figura 1B). O knockdown de STX6 não afetou os níveis de TSG101 nas frações celular e EV em condições tratadas com veículo e Baf (Figura 1C). No entanto, o knockdown de STX6 aumentou os níveis de LC3-II na fração celular sob a condição tratada com veículo, mas não sob a condição tratada com Baf. O knockdown de STX6 também aumentou os níveis de LC3-II na fração EV sob a condição tratada com Baf (Figura 1D). Esses achados sugerem que os métodos usados para detectar LC3-II em EVs por immunoblotting são suficientemente sensíveis, mesmo que a eficiência de knockdown não seja substancial. Além disso, esses resultados indicam que o knockdown de STX6 aumenta o número de autofagossomos intracelulares e aumenta a liberação extracelular de vesículas associadas a autofagossomos sob tratamento com Baf.

Para investigar ainda mais se o knockdown de STX6 influencia os números intracelulares de autofagossomos e autolisossomos, autofagossomos e lisossomos foram visualizados usando o marcador de autofagossomo mCherry-LC3 e o marcador de lisossomo LAMP1-GFP. A imagem confocal de células vivas revelou vesículas positivas para GFP e mCherry em células HeLa expressando LAMP1-GFP e mCherry-LC3 (Figura 2A). Os autolisossomos foram identificados como vesículas positivas para GFP e mCherry, enquanto os autofagossomos foram identificados como vesículas positivas para GFP e mCherry. O knockdown de STX6 aumentou o número de autofagossomos e autolisossomos sob a condição tratada pelo veículo ( Figura 2B , C ). No entanto, o knockdown de STX6 não afetou os números de autofagossomos e autolisossomos sob a condição tratada com Baf ( Figura 2B , C ).

Para determinar se o aumento no número de autofagossomos intracelulares devido ao knockdown de STX6 resultou do aumento da formação de autofagossomos, a formação de ômegassomos, um processo necessário para a formação de autofagossomos, foi examinada usando o marcador de ômegassomo GFP-ATG13 intensidade do sinal. A imagem confocal de células vivas forneceu uma imagem montada de GFP-ATG13, indicando a formação de ômegassomos (Figura 3A). O knockdown de STX6 diminuiu a intensidade do sinal GFP-ATG13 (P = 0,023, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR¹⁹). Embora o knockdown do STX6 não tenha influenciado significativamente a intensidade do sinal GFP-ATG13 sob a condição tratada pelo veículo, ele diminuiu significativamente o sinal sob as condições tratadas com Baf (Figura 3B). Coletivamente, esses achados indicam que o knockdown de STX6 aumenta a liberação de vesículas positivas para LC3-II ligadas ao acúmulo de vesículas associadas ao autofagossomo.

Figura 1: Resultados de immunoblotting das frações celulares, P1 e P2 de células HeLa transfectadas com siRNA controle ou STX6 sob tratamento com veículo ou Baf. As células HeLa foram tratadas com veículo (DMSO) ou 100 nM Baf por 24 h após a transfecção com controle ou siRNA STX6 . As frações célula, P1 (pellet de 20.000 × g ) e P2 (pellet de 110.000 × g ) foram isoladas. (A) Imagens representativas de immunoblotting de cada fração mostrando STX6, TSG101, LC3 e PCNA. (BD) A análise densitométrica para (B) STX6, (C) TSG101 e (D) LC3-II foi realizada a partir das imagens de immunoblot. As intensidades de sinal foram normalizadas para as células controle ou transfectadas por siRNA STX6 tratadas com veículo ou Baf. Os gráficos de barras representam valores médios ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0,05 por um teste t não pareado bicaudal no Excel. Abreviaturas: STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsulfóxido; TSG101 = gene 101 de suscetibilidade tumoral; LC3 = proteínas associadas aos microtúbulos 1A/1B de cadeia leve 3B; PCNA = antígeno nuclear de proliferação celular; S.E.M. = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise de imagem confocal de células HeLa co-expressando Lamp1-GFP e mCherry-LC3 transfectadas com controle ou siRNA STX6 sob a condição tratada com veículo e Baf. (A) Imagens confocais de células HeLa expressando de forma estável LAMP1-GFP e mCherry-LC3 foram transfectadas com controle ou siRNA STX6 por 48 h, seguidas de exposição a DMSO ou 400 nM Baf por 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B,C) A qunatificação de (B) autofagossomos (pontos negativos LAMP1-GFP e positivos mCherry-LC3) e (C) autolisossomos (pontos duplo-positivos LAMP1-GFP e mCherry-LC3) foi realizada usando o software Fiji. Os dados nos gráficos de barras são apresentados como valores médios ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0,05, com base em um teste t não pareado bicaudal no Excel. Abreviaturas: Lamp1 = proteína de membrana 1 associada a lisossomos; LC3 = proteínas associadas aos microtúbulos 1A/1B de cadeia leve 3B; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicina A1; GFP = proteína fluorescente verde; S.E.M. = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem confocal de células HeLa expressando GFP-ATG13, transfectadas com siRNA controle ou STX6 e submetidas a tratamento com veículo ou Baf. (A) As células HeLa foram transfectadas com controle ou siRNA STX6 , seguidas de transfecção pEGFP-C1-hAtg13 e tratadas com DMSO ou 400 nM Baf por 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B) As intensidades relativas do sinal foram determinadas normalizando o sinal em cada condição para o das células transfectadas com siRNA de controle tratadas com Baf. O gráfico de barras mostra os dados como médias ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0,05 pelo teste t não pareado bicaudal no Excel. Abreviaturas: hAtg13 = gene 13 relacionado à autofagia humana; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsulfóxido; S.E.M. = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Análise de immunoblot das frações celulares, P1 e P2 de células HeLa transfectadas com siRNA controle e tratadas com Baf. As células HeLa foram transfectadas com siRNA controle e expostas a 100 nM de Baf por 24 h. Em seguida, foram preparadas frações: célula, P1 (pellet de 20.000 × g ) e P2 (pellet de 110.000 × g ). Imagens representativas de immunoblot de ULK1 e PCNA, mostrando seus níveis em cada fração para comparação. Abreviaturas: Baf = bafilomicina A1; ULK1 = unc-51 como quinase ativadora de autofagia 1; PCNA = antígeno nuclear de células em proliferação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O estudo de immunoblotting revelou os níveis de LC3-II e TSG101 na fração celular, na fração P1 EV rica em microvesículas e na fração P2 EV rica em exossomos. A imagem de células vivas foi usada para examinar autofagossomos, autolisossomos e ômegassomos, fornecendo informações sobre se o knockdown de STX6 influencia a autofagia. Esses resultados combinados sugerem que o knockdown de STX6 afeta a liberação de EVs positivos para LC3-II, potencialmente ligados à desregulação da via de autofagia. Uma das principais vantagens desse método é sua capacidade de distinguir entre EVs grandes e pequenos originários de diferentes fontes. A análise de citometria de fluxo usando marcadores específicos para microvesículas, exossomos ou o aparelho de Golgi pode esclarecer ainda mais como o knockdown de STX6 influencia a liberação de vesículas positivas para LC3-II.

No entanto, uma limitação do estudo de immunoblotting é que ainda não está claro se o aumento observado nos níveis de LC3-II na fração EV após o knockdown de STX6 sob tratamento com Baf é devido a um aumento no número de vesículas positivas para LC3-II sendo liberadas ou um aumento nos níveis de LC3-II por EV. Para distinguir entre essas possibilidades, a contagem de vesículas usando análise de rastreamento de nanopartículas ou análise de citometria de fluxo pode ajudar a determinar se o número de vesículas positivas para LC3-II está aumentado ou se os níveis de LC3-II por vesícula estão elevados.

Uma etapa crítica no protocolo é o fracionamento do meio cultivado para preparar a fração EV. Os EVs são observados como minúsculos pellets no tubo de centrifugação. Para preparar uma fração EV comparável, é importante transferir ou descartar cuidadosamente o sobrenadante após a centrifugação para evitar diluir a concentração de proteína dos pellets EV. Para examinar a contaminação da fração celular na fração EV, os níveis de uma proteína citoplasmática, quinase ativadora de autofagia semelhante a unc-51 (ULK1) e uma proteína nuclear, PCNA, foram comparados entre as frações neste estudo (Figura Suplementar S1). A concentração de proteína na fração celular geralmente reflete o número de células, mas a concentração de proteína celular é influenciada pelos estágios do ciclo celular²⁰ ou distúrbios na proteostase²¹. A autofagia é crucial para a manutenção da proteostase²². A desregulação da autofagia pelo knockdown de STX6 ou tratamento com Baf pode alterar a concentração de proteínas, independentemente do número de células.

O knockdown de STX6 é obtido por meio de transfecção de siRNA e a superexpressão de GFP-ATG13 é realizada por transfecção de DNA. A eficiência da transfecção é influenciada pelo tipo, densidade e número de células. O alinhamento eficiente das sequências de siRNA também pode afetar a eficiência do knockdown. Ajustes são necessários quando a eficiência da transfecção é baixa.

Os presentes resultados indicam que o knockdown de STX6 aumentou os níveis do marcador autofagossomo LC3-II na fração EV sob condições tratadas com Baf, mas não afetou os níveis de TSG101. Isso sugere que o STX6 suprime a liberação de vesículas derivadas de autofagossomos, mas não de MVBs, quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

O knockdown de STX6 também aumentou os níveis celulares de LC3-II em condições de crescimento, sugerindo que STX6 regula a autofagia. De fato, o knockdown do STX6 aumentou o número de autofagossomos e autolisossomos, embora não tenha aumentado a formação de ômegassomos. A maturação dos autolisossomos causa reforma autofágica dos lisossomos²³. É possível que o STX6 medeia o processo de maturação dos autolisossomos, e sua perda de função pode aumentar o número de autolisossomos imaturos, levando à desregulação da fusão autofagossomo-lisossomo devido à supressão da reforma autofágica dos lisossomos.

O tratamento com Baf aumentou os níveis de STX6 na fração EV, mesmo quando sua expressão foi regulada negativamente. Estudos anteriores sugeriram que as vesículas associadas ao autofagossomo são liberadas como EVs quando a função lisossômica é inibida^13,14. Sabe-se que o STX6 se localiza em vesículas associadas a autofagossomos, como os vacúolos semelhantes a autofagossomos contendo Streptococcus do Grupo A (GAS)²⁴. Portanto, o STX6 pode estar localizado em vesículas associadas ao autofagossomo que são liberadas como EVs quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

A disseminação da patologia TDP-43 está intimamente ligada à progressão da ELA e FTLD-TDP³. Embora ainda não esteja claro como a patologia TDP-43 se espalha pelo cérebro e pela medula espinhal, a via EV pode mediar sua disseminação. Estudos anteriores indicaram que a desregulação da via autofagia-lisossomo resulta na liberação de EVs positivos para LC3-II contendo TDP-43¹³. O presente estudo sugere um papel para STX6 na regulação da liberação de EV quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida. A metodologia para avaliar os níveis de LC3-II nas frações celular e EV por immunoblotting deve ser útil em estudos futuros.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Tripsina EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
Prato de 10 cm	Thermo Fisher Scientific	150464
Tubo de 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μ Ponta de Pipeta L	Nippon Genetics	FG-301	pipetagem
2-Mercaptoetanol	Nacalai Tesque	21417-52	um material para solução tampão de amostra
3,3'-Diaminobenzidina Tetracloridrato	Nacalai Tesque	11009-41	um material para solução DAB
3.5 cm Prato	Prato Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm	TrueLine	TR4001
Banhos termostáticos de bloco de alumínio (termobanhos secos)	EYELA	273860
Aspirador	SANSYO	SAP-102	solução inalatória
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomicina A1	Adipogen	BVT-0252
Vetor de anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado com biotina	Laboratórios	BA-1000	2º anticorpo para immunoblotting
Anticorpos IgG para Cavalos Conjugados com Biotina IgG Antibody Vector	Laboratories	BA-2000	2º anticorpo para immunoblotting
Bloqueando um	Nacalai Tesque	03953-95	um material para immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	um material para solução tampão de amostra
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrífuga 5702 R	eppendolf	5703000039
Contando Lâminas Câmara Dupla	Bio-Rad	1450015J	contagem de células
Sonifier Digital 450	BRANSON
Dimetil Sulfóxido	nacalai tasque	09659-14	veículo
DMEM Alta Glicose	Nacalai Tesque	08458-45	meio de cultura
DMEM sem Fenol Vermelho	Nacalai Tesque	08489-45	meio de cultura
EGTA	Dojindo	348-01311	um material para solução A68
Excel	Microsoft	versão 16.16.27	análise satisfatória
EZR	Referência nº 24	versão 1.68	análise satisfatória
FBS	Sigma	173012	Meio de cultura
Fiji	NIH		Ferramenta de análise de imagem
Glicerol	Nacalai Tesque	09886-05	um material para solução tampão de amostra
Hoehst33342	Dojindo	H342
Peróxido de hidrogênio	Fujifilm Wako	080-0186	um material para solução DAB
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	limpeza lenço
baixa retenção Tubo de baixa retenção	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA e transfecção de DNA
LSM780 Microscópio a laser confocal	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Anticorpo	MBL	M186-3	1º anticorpo para immunoblotting
Cloreto de Níquel (II) Hexahidratado	Fujifilm Wako	149-01041	um material para solução DAB
N-Lauroilsarcosina Sal de Sódio	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrífuga	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Soro Reduzido Meio	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA e transfecção de DNA
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicilina/Estreptomicina	Nacalai Tesque	26253-84	Meio de cultura
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA	BioAcademia	70-080	1º anticorpo para imunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Anticorpo	ProteinTech	10841-1-AP	1º anticorpo para immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Anticorpo	ProteinTech	28283-1-AP	1º anticorpo para immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1	ProteinTech	20986-1-AP	1º anticorpo para immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrana	Milliore	IPVH00010	um material para immunoblotting
R	R desenvolvimento equipe principal	versão 4.4.1	análise satisfatória
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA reagente de transfecção
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific		HSS115604 siRNA para transfecção
Cloreto de sódio	Nacalai Tesque	31320-05	um material para tampão Tris e solução A68
Dodecil Sulfato de Sódio	Fujifilm Wako	192-13981	um material para solução tampão de amostra
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	transfecção de siRNA
Sacarose	Fujifilm Wako	193-00025	um material para solução A68
TC20 Contador de células automatizado com impressora térmica	Bio-Rad	1450109J1	contagem de células
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubação
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	Reagente de transfecção de DNA
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	reagente
de transfecção de DNATris(hidroximetil)aminometano	Nacalai Tesque	35406-75	um material para tampão Tris, tampão de amostra e solução A68
Corante Azul de Tripano 0.40%	Bio-Rad	1450021	contagem de células
Tubo Aberto Ultra-Clear, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	coleta para a fração P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	coleta para a fração P2
EV Kit Padrão Vectastain ABC	Vector Laboratories	Garrafa de lavagem de PK-4000	immunoblotting
ibidi	80806		do poço da lavagem do membraneμ-Slide 8
		lavagem	1-4640-02