Artigo de método

A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos

DOI:

10.3791/67405

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7 de fevereiro de 2025

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1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada que oferece informações abrangentes sobre o glicoproteoma heterogêneo em microambientes tumorais complexos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

Resumo

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A glicosilação é uma modificação proteica comum e estruturalmente diversa que afeta uma ampla gama de processos tumorigênicos. A glicômica e a glicoproteômica orientadas por espectrometria de massa surgiram como abordagens poderosas para analisar glicanos liberados e glicopeptídeos intactos, respectivamente, oferecendo uma compreensão mais profunda do glicoproteoma heterogêneo no microambiente tumoral (TME). Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada, que primeiro emprega glicômica baseada em carbono poroso grafitizado LC-MS / MS para elucidar as estruturas glicânicas e sua distribuição quantitativa no glicoma de tecidos tumorais, populações de células ou fluidos corporais que estão sendo investigados. Isso permite uma análise glicômica comparativa para identificar glicosilação alterada em grupos de pacientes, estágios de doenças ou condições e, mais importante, serve para aprimorar a análise glicoproteômica a jusante da(s) mesma(s) amostra(s), criando uma biblioteca de estruturas de glicanos conhecidas, reduzindo assim o tempo de pesquisa de dados e a taxa de identificação incorreta de glicoproteínas. Com foco no perfil de N-glicoproteoma, as etapas de preparação da amostra para o método glicoproteômico guiado por glicômica são detalhadas neste protocolo e os principais aspectos da coleta e análise de dados são discutidos. O método glicoproteômico guiado por glicômica fornece informações quantitativas sobre as glicoproteínas presentes no TME e seus locais de glicosilação, ocupação do local e estruturas de glicanos específicos do local. Resultados representativos são apresentados a partir de tecidos tumorais fixados em formalina e embebidos em parafina de pacientes com câncer colorretal, demonstrando que o método é sensível e compatível com seções de tecido comumente encontradas em biobancos. A glicoproteômica guiada por glicômicos, portanto, oferece uma visão abrangente da heterogeneidade e dinâmica do glicoproteoma em TMEs complexos, gerando dados bioquímicos robustos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

Introdução

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A glicosilação de proteínas é um tipo prevalente e complexo de modificação co- e pós-traducional de proteínas produzidas por espécies em toda a árvore filogenética da vida 1,2,3. Os glicanos ligados a proteínas são conhecidos por impactar uma ampla gama de processos biológicos importantes para a saúde humana, incluindo mediação e regulação de interações celulares e eventos de comunicação 4,5. Acredita-se que a glicosilação de proteínas aberrantes seja uma causa de transformação maligna, progressão tumoral e disseminação 6,7,8. Isso implica glicanos nos principais processos tumorigênicos no microambiente tumoral (TME) e oferece um potencial considerável e amplamente inexplorado para a descoberta de biomarcadores baseados em glicanos e aplicações terapêuticas. A glicobiologia está, portanto, recebendo cada vez mais atenção na pesquisa do câncer e nas ciências da vida9.

Impulsionados pelos principais desenvolvimentos em glicoanalítica e informática na última década 10,11,12,13,14,15,16,17, a glicômica e a glicoproteômica orientadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) foram estabelecidas como ferramentas poderosas para o perfil de todo o sistema de glicanos liberados e glicopeptídeos intactos de misturas complexas de glicoproteínas extraídas diretamente de suas origens de amostras biológicas, como vários tipos de espécimes de pacientes com câncer (por exemplo, tecidos tumorais, populações de células, fluidos corporais)3,13,18,19,20.

A glicômica fornece informações sobre a estrutura e a quantidade do repertório de glicanos (o glicoma), que é produzido dinamicamente por células, tecidos e até organismos inteiros. Por outro lado, a glicoproteômica fornece informações quantitativas sobre os transportadores de proteínas e seu(s) sítio(s) de glicosilação, as taxas de ocupação do sítio (macroheterogeneidade), as composições de glicanos específicos do sítio e seu padrão de distribuição de sítios (microheterogeneidade) com informações estruturais limitadas de glicanos (muitas vezes limitadas à composição de glicanos)15,16,21. Assim, a glicômica e a glicoproteômica são abordagens complementares para o levantamento dos detalhes bioquímicos do glicoproteoma22.

Uma miríade de desenhos metodológicos e estratégias analíticas para glicômica e glicoproteômica foi desenvolvida e aplicada em todos os laboratórios, dependendo do glicoanalito de interesse (por exemplo, ligado a N-/O-/C, glicano/glicopeptídeo/glicoproteína, marcado/não marcado), a natureza da amostra (por exemplo, células, tecidos, fluidos corporais), quantidade (níveis de nanograma/micrograma/miligrama de proteína) e o instrumento analítico disponível23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Apesar dos benefícios reconhecidos de seu uso paralelo, a glicômica e a glicoproteômica não são comumente aplicadas juntas, mas sim como abordagens autônomas em estudos de pesquisa glicobiológica e de câncer devido à sua alta demanda por conhecimento analítico e instrumentação especializada.

Reconhecendo essa lacuna tecnológica, há mais de uma década, introduzimos o método glicoproteômico assistido por glicômica, que é capaz de integrar dados glicômicos e glicoproteômicos obtidos de espécimes biológicos complexos33. Em suma, a tecnologia glicoproteômica assistida por glicômica (ou guiada por glicômica como neste protocolo) traça o perfil dos N- e/ou O-glicanos por meio de um método LC-MS/MS de carbono grafitizado poroso (PGC) estabelecido34,35, que são então usados para a análise de dados intactos de N- e/ou O-glicopeptídeo adquiridos da(s) mesma(s) amostra(s), definindo os limites do espaço de busca de glicanos36. PGC-LC-MS / MS é um método glicômico particularmente poderoso, pois fornece informações quantitativas sobre o glicoma com alta sensibilidade e resolução estrutural, produzindo informações sobre topologia (sequência de monossacarídeos e padrão de ramificação) e ligações glicosídicas de glicanos, mesmo dentro de misturas complexas35 , 37 , 38. O fluxo de trabalho de glicoproteômica envolve geração de peptídeos, marcação opcional de peptídeos, multiplexação e pré-fracionamento, bem como enriquecimento antes da análise de LC-MS/MS de fase reversa que emprega idealmente diferentes métodos de fragmentação, incluindo energia de colisão escalonada/dissociação colisional de alta energia (sceHCD, para N-glicopeptídeos) e transferência de elétrons/dissociação colisional de alta energia (EThcD, para O-glicopeptídeos) para identificação de analitos. Para a análise de N-glicoproteoma, a de-N-glicoproteômica paralela pode orientar a análise de dados de N-glicopeptídeos intactos, definindo o espaço de busca de proteínas/peptídeos e fornecendo mais detalhes sobre os locais de N-glicosilação ocupados e sua taxa de ocupação do local, enquanto a análise paralela de peptídeos não modificados revela quaisquer alterações no nível de proteína entre as condições estudadas.

Este artigo fornece um protocolo passo a passo detalhado e fácil de seguir para o método glicoproteômico guiado por glicômica (consulte a Figura 1 para obter uma visão geral do fluxo de trabalho). O protocolo fornece detalhes experimentais das etapas de preparação da amostra e dos experimentos de glicômica e glicoproteômica baseados em LC-MS / MS e apresenta resultados representativos que demonstram a aplicação do método a seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) de tumores ressecados de pacientes com câncer colorretal (CRC), permitindo insights sobre a glicobiologia do TME em um valioso tipo de amostra que está arquivado em biobancos de câncer em todo o mundo. A análise e integração de dados glicômicos e glicoproteômicos também são brevemente discutidas.

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Figura 1: Visão geral do método glicoproteômico guiado por glicômica. A visão geral mostra etapas experimentais detalhadas em fluxos de trabalho de glicômica (esquerda) e glicoproteômica (direita), com uma visão geral das informações obtidas (negrito) e como as duas abordagens são integradas por meio de análise e interpretação aprimoradas de dados. Inserir: Microcolunas SPE caseiras usadas para os fluxos de trabalho (i) glicômica e (ii-iii) glicoproteômica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

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O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana (Ciências Médicas) da Universidade Macquarie, Sydney, Austrália (Protocolo 5201800073).

NOTA: O método glicoproteômico guiado por glicômica pode ser aplicado a um conjunto diversificado de amostras biológicas que variam de baixa a extrema complexidade de glicoproteína. Para abordagens glicoproteômicas sem marcação (nas quais o agrupamento de amostras não é realizado), aproximadamente 100-200 μg de proteína total de misturas complexas são necessários como material de partida para garantir alta cobertura de glicoproteoma após o enriquecimento para glicopeptídeos que podem constituir apenas 1% -10% da população de peptídeos. Devido a restrições de espaço, a extração inicial de proteínas de células ou tecidos é deixada de fora, e os leitores são encaminhados para outros recursos15. A glicômica consome conservadoramente ~ 10-20 μg de proteína por análise para perfil profundo de glicoma, deixando a maior parte do extrato de proteína para glicoproteômica. Se não for declarado o contrário, as concentrações finais foram mencionadas e os produtos químicos devem ser dissolvidos em água de ultra-alta qualidade para fazer soluções aquosas no protocolo abaixo.

1. Preparação de proteínas

  1. Determine a concentração de proteína dos extratos usando um método estabelecido (por exemplo, ácido bicinconínico ou ensaios de proteína de Bradford). Ajustar a concentração de proteínas para 10 μg/μL em TEAB 50 mM (pH 8,5).
  2. Reduza as ligações dissulfeto incubando amostras com 10 mM DTT por 45 min a 56 °C. Grupos tióis livres de alquilato incubando subsequentemente amostras com IAA 40 mM no escuro por 30 min a 20-25 °C. Extinguir a reação de alquilação com excesso de DTT (~40 mM).
  3. Divida cada amostra de proteína. Deixe aproximadamente 10-20 μg de proteína total para glicômica e 100-200 μg de proteína total para o fluxo de trabalho de glicoproteômica.
    NOTA: Além da(s) amostra(s) de proteína de interesse, inclua um modelo conhecido de glicoproteína (por exemplo, fetuína bovina) ou mistura de proteínas (por exemplo, lisado de linha celular, plasma) para avaliar a eficiência e reprodutibilidade dos procedimentos e monitorar o desempenho de LC-MS/MS.

2. Fluxo de trabalho N-glicômico

  1. Imobilização de proteínas em uma membrana de PVDF
    1. Use um perfurador de furo único para cortar o encaixe da membrana de PVDF com o número de amostras de proteína a serem detectadas.
    2. Umedeça as membranas excisadas com etanol ou metanol e, em seguida, transfira as membranas para uma placa de fundo plano de 96 poços.
    3. Quando as membranas estiverem quase secas, deposite as amostras de proteína em um volume máximo de 2,5 μL por ponto para minimizar a área de superfície da amostra de proteína depositada. Reposicione as amostras, se necessário, para que a quantidade total de proteína imobilizada no local seja de ~ 10-20 μg. Para fazer isso, deixe a mancha secar ao ar antes de repetir o procedimento de mancha.
      NOTA: Durante a manchagem, pode ser necessário umedecer novamente a membrana com etanol ou metanol para evitar que as membranas sequem até a conclusão.
    4. Seque as membranas ao ar a 20-25 °C durante pelo menos 3 h, de preferência durante a noite. Evite qualquer contaminação das membranas durante a secagem.
      NOTA: Como uma etapa opcional de controle de qualidade, as proteínas identificadas nas membranas podem ser visualizadas por coloração com solução Direct Blue 71, conforme descrito anteriormente34.
  2. Liberação de N-glicanos ligados a proteínas
    1. Adicione 100 μL de PVP40 a 1% (p / v) em metanol a cada poço contendo as membranas manchadas. Certifique-se de que o lado da membrana em que a amostra de proteína foi manchada esteja voltado para cima durante a preparação da amostra.
    2. Agite a placa na solução de PVP40 por 5 min a 20-25 °C e, em seguida, descarte a solução de PVP40.
      NOTA: A solução de PVP40 bloqueia as membranas de PVDF e os poços para evitar a ligação não específica da PNGase F (e quaisquer exoglicosidases que possam ser aplicadas para obter informações específicas de ligação em experimentos paralelos; consulte a discussão abaixo) nas etapas subsequentes.
    3. Lave cada poço contendo as manchas de proteína bloqueadas com 100 μL de água ultrapura e agite a placa por 5 min. Repita esta etapa 3x. Certifique-se de que a água seja completamente descartada após cada lavagem.
    4. Adicione 15 μL de solução de PNGase F (0,5 U / μL, diluída em água ultrapura da solução estoque de 10 U / μL) a cada poço, assumindo que 15 μg de proteína por amostra foram depositados.
    5. Adicione água aos poços vazios circundantes para evitar a desidratação da amostra durante as etapas subsequentes da incubação e use filme transparente para selar a placa com cuidado. Incubar a placa durante, pelo menos, 8 h a 37 °C.
    6. Sonice a placa por 5 min para ajudar as gotículas evaporadas na lateral dos poços a se acumularem no fundo da placa.
    7. Transfira as amostras de N-glicano liberadas cuidadosamente para tubos de microcentrífuga individuais (1,5 mL). Lave os poços de amostra 2x com 20 μL de água ultrapura, dispense e aspire várias vezes. Combine qualquer amostra restante de cada poço nos tubos de microcentrífuga contendo as amostras de N-glicano.
      NOTA: Evite usar tubos de baixa ligação para o N-glicomics sample preparação, pois os glicanos hidrofílicos podem se ligar irreversivelmente aos tubos revestidos.
    8. Adicione 10 μL de acetato de amônio 100 mM pH 5,0 e incube as amostras por 1 h a 20-25 °C.
      NOTA: Esta etapa hidroxila os resíduos de N-acetilglucosamina aminados na extremidade redutora dos N-glicanos liberados, permitindo uma redução exaustiva na etapa subsequente. Ajuste o acetato de amônio de 100 mM para pH 5,0, pois as altas taxas de conversão de glicosilamina em hidroxila na extremidade redutora dos N-glicanos destacados dependem da fraca acidez da solução.
    9. Seque as amostras de N-glicano em um sistema concentrador a vácuo.
  3. Redução de N-glicanos liberados
    1. Adicione 20 μL de 1 M NaBH4 em 50 mM KOH recém-preparado às amostras secas de N-glicano e misture bem.
      NOTA: O NaBH4 deve ser preparado na hora em KOH no dia em que for usado.
    2. Fechar bem as tampas de cada tubo e incubar as amostras durante 3 h a 50 °C.
      NOTA: Os N-glicanos sofrem uma redução, que converte os α e β-anômeros da extremidade redutora em uma única forma de alditol, levando a um único pico cromatográfico na análise PGC-LC-MS/MS.
    3. Após a incubação, gire os tubos de amostra em uma microcentrífuga para levar o líquido ao fundo dos tubos.
    4. Adicione 100 μL de água ultrapura a cada amostra. Adicione 2 μL de ácido acético glacial para neutralizar as amostras alcalinas de N-glicano. Gire os tubos de amostra em uma microcentrífuga para trazer as amostras para o fundo dos tubos.
      NOTA: O ácido acético glacial neutraliza as amostras alcalinas, o que leva à formação de gás hidrogênio (H2) e subsequente efervescência durante a reação.
  4. Dessalinização de N-glicanos usando PGC-C18-SPE
    1. Prepare microcolunas PGC-C18-SPE caseiras conforme descrito abaixo.
      1. Usando uma seringa adequada, conecte e transfira os discos C18 para pontas de pipeta adequadas (10 μL).
        NOTA: Aqui, microcolunas comerciais C18-SPE também podem ser usadas.
      2. Pipetar 10 μL de pasta de resina PGC suspensa em 50% (v/v) de metanol nas microcolunas C18-SPE. Coloque as microcolunas em tubos de 2 mL equipados com adaptadores de microcentrífuga. Gire os tubos para criar microcolunas PGC-C18-SPE com uma altura de coluna de ~0,5 cm (consulte a Figura 1i). Preparar uma microcoluna PGC-C18-SPE para cada amostra.
        NOTA: O uso de adaptadores garante que as microcolunas fiquem suspensas no centro do tubo.
      3. Para as etapas subsequentes de lavagem e carregamento de amostras, defina uma centrífuga de bancada para 6.000 rpm (~2.000 x g) e gire por 60 s para facilitar a passagem das fases móveis pelas microcolunas PGC-C18-SPE. Lave e condicione cada microcoluna PGC-C18-SPE sequencialmente com 50 μL 0,1% (v/v) de TFA em ACN três vezes, seguido de 50 μL 0,1% (v/v) de TFA três vezes.
        NOTA: As microcolunas PGC-SPE podem ser preparadas com horas de antecedência, mas devem ser armazenadas hidratadas em temperatura ambiente antes do uso.
    2. Aplique as amostras de N-glicano nas microcolunas PGC-C18-SPE em um volume de carga de até 40 μL e gire a 6.000 rpm (~2.000 x g) por 60 s após cada adição. Repita a etapa de carregamento até que toda a amostra de N-glicano tenha sido aplicada à microcoluna.
      NOTA: Embora as frações de fluxo não devam conter glicanos, recomendamos manter essas frações até que os dados glicômicos tenham sido adquiridos com sucesso no caso de retenção incompleta nas microcolunas PGC-C18-SPE.
    3. Lave as microcolunas PGC-C18-SPE com 20 μL de água ultrapura. Transfira as microcolunas PGC-C18-SPE para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL em preparação para a eluição de N-glicano.
    4. Eluir os N-glicanos adicionando 40 μL de TFA a 0,1% em ACN a 50% (ambos v/v) a cada microcoluna PGC-C18-SPE e, em seguida, centrifugar. Repita este procedimento e combine o eluído.
      NOTA: É importante monitorar as microcolunas após cada centrifugação para garantir que a solução tenha sido completamente girada, pois isso facilitará a eluição eficiente.
    5. Secar os N-glicanos dessalinizados num sistema concentrador de vácuo.
  5. Aquisição de PGC-LC-MS/MS
    1. Prepare os solventes LC conforme descrito abaixo.
      1. Solvente A: Prepare 100 mL de solução estoque de bicarbonato de amônio 100 mM (NH4HCO3) em água ultrapura. Filtrar a solução de reserva através de um disco de filtro de nylon de 0,2 μm utilizando uma unidade de filtração a vácuo para remover as partículas. Em seguida, prepare 1 L de solução 10 mM NH4HCO3 (solvente A) diluindo 100 mL de solução estoque 100 mM NH4HCO3 em 900 mL de água ultrapura. Sonicar o solvente A durante 15 min para desgaseificar a solução. O solvente A pode ser armazenado por 1 semana a 20-25 °C, enquanto a solução estoque de NH4HCO3 100 mM pode ser armazenada por 1 mês a 4 °C.
      2. Solvente B: Preparar 1 L de 10 mM NH4HCO3 em ACN a 70% (v/v) em água ultrapura (solvente B) adicionando 100 ml de solução-mãe NH4HCO3 100 mM (ver passo 2.5.1.2 anterior) a 700 ml de ACN e diluir até um volume total de 1 L com água ultrapura. Sonicar o solvente B durante 15 min para desgaseificar. O solvente B pode ser armazenado por 2 semanas a 20-25 °C.
    2. Ressuspenda os N-glicanos dessalinizados em 10 μL de água ultrapura e misture bem. Gire as amostras a 14.000 x g por 5 min e, em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para frascos de amostra MS, deixando aproximadamente 0,5 μL para trás para evitar a transferência de partículas e detritos visíveis ou invisíveis que danifiquem o sistema LC-MS/MS.
    3. Injectar e separar os N-glicanos numa coluna capilar de PGC-LC aquecida a 50 °C utilizando um gradiente linear de 60 min (ou de outro modo adequado) de 0%-70% (v/v) do solvente B no solvente A num sistema de HPLC. Certifique-se de que o sistema HPLC esteja conectado ao espectrômetro de massa e opere com uma vazão constante de 20 μL/min (ajuste a vazão para corresponder à geometria da coluna PGC-LC).
    4. Detecte os N-glicanos separados usando um espectrômetro de massa quadrupolo de armadilha de íons linear (ou outro sistema MS de baixa ou alta resolução adequado) instalado com uma fonte de íons por eletrospray e operando no modo de polaridade de íons negativos.
    5. Defina o intervalo de varredura de aquisição MS1 para m/z 150-2.000 com uma largura de pico de varredura de zoom de m/z 0,25 largura total meio máximo (FWHM) em m/z 200. Defina a fonte voltage para 3.2 kV. Para varreduras MS1, defina o controle automático de ganho (AGC) para 5 x 104 íons com um tempo máximo de acumulação de 50 ms (ou configurações apropriadas).
      NOTA: O baixo m/z inicial deve incluir a detecção de mono e di-sacarídeos que geralmente contribuem para o N- e O-glicoma.
    6. Para MS/MS, defina a resolução para m/z 0.25 FWHM em m/z 200, o AGC para 2 x 104 íons e o tempo máximo de acumulação para 300 ms. Habilite a aquisição dependente de dados (DDA) e selecione os cinco precursores mais abundantes em cada varredura completa MS1 para fragmentação usando ativação de ressonância (armadilha de íons), dissociação induzida por colisão (CID) a uma energia de colisão normalizada (NCE) de 33%. Desmarque a exclusão dinâmica para evitar a perda de isômeros isobáricos de N-glicano de eluição próxima.
  6. Análise de dados de dados glicômicos de LC-MS/MS
    1. Navegue pelos dados brutos de LC-MS/MS gerados usando o software apropriado para garantir alta qualidade de dados após confirmar a largura estreita do pico de LC, separação efetiva de isômeros de N-glicano, alta precisão de MS, resolução e sinal-ruído e alta eficiência de fragmentação de CID-MS/MS.
    2. Identifique manualmente os N-glicanos na amostra com base em sua massa precursora monoisotópica, padrão de fragmentação CID-MS/MS e tempo de retenção relativo e absoluto de PGC-LC.
      NOTA: RawMeat v2.1, GlycoMod e GlycoWorkBench v2.1 podem auxiliar no processo de identificação conforme descrito26. Restrições biossintéticas conhecidas e parentesco estrutural entre os analitos observados também podem adicionar mais confiança nos N-glicanos identificados26. Alternativamente, a identificação semiautomática de glicanos e a anotação espectral podem ser feitas usando software comercial.
    3. Para quantificação relativa de N-glicanos, gere uma lista de transição contendo o precursor monoisotópico m / z de todos os isômeros de N-glicanos identificados e use um software comercial para determinar os valores de área sob a curva (AUC) com base em cromatogramas de íons extraídos (EICs) de todos os íons precursores de N-glicanos, conforme descrito26.

3. Fluxo de trabalho de N-glicoproteômica

  1. Digestão da mistura de proteínas
    1. Digerir 100-200 μg do extracto proteico reduzido e alquilado (da parte 1) adicionando tripsina (relação enzima:proteína 1:50, p/p) e/ou outras proteases à escolha a cada amostra.
      NOTA: Ao contrário da preparação da amostra de glicômica, use, se possível, tubos de microcentrífuga de baixa ligação para as etapas de preparação da amostra de glicoproteômica para recuperação máxima de peptídeos.
    2. Incubar as amostras durante 8-12 h a 37 °C. Certifique-se de que o pH seja ~ 8,5, pois uma solução levemente alcalina melhora a eficiência da digestão da tripsina.
      NOTA: Proteases específicas que produzem padrões de clivagem previsíveis e deixam a maioria dos N-glicopeptídeos com um único sequon (local de glicosilação), como tripsina e Lys-C, são preferidas. Evite incubar excessivamente as amostras para reduzir clivagens não específicas de proteínas por tripsina ou outras proteases.
    3. Interromper a digestão por acidificação (para evitar clivagens inespecíficas induzidas por digestão prolongada) pela adição de 1% (v/v) de TFA.
  2. Dessalinização de peptídeos usando Oligo R3-C18-SPE
    1. Prepare microcolunas Oligo R3-C18-SPE caseiras conforme descrito abaixo.
      1. Usando uma seringa adequada, conecte e transfira os discos C18 para pontas de pipeta de 10 μL.
        NOTA: Aqui, microcolunas comerciais C18-SPE também podem ser usadas.
      2. Deposite uma pasta de resina Oligo R3 suspensa em ACN puro nas microcolunas C18-SPE. Coloque as microcolunas em tubos de 2 mL equipados com adaptadores de microcentrífuga para garantir que as microcolunas estejam suspensas no centro do tubo e gire para criar microcolunas Oligo R3-C18-SPE com uma altura de coluna de ~ 1 cm (ver Figura 1ii). Preparar uma microcoluna de oligonucleonucleico R3-C18-SPE para cada amostra.
    2. Para as etapas subsequentes de lavagem e carregamento de amostras, ajuste uma centrífuga de bancada para 6.000 rpm (~2.000 x g) e gire por 60 s para permitir que as fases móveis passem pelas microcolunas Oligo R3-C18-SPE. Lave e condicione cada microcoluna Oligo R3-C18-SPE sequencialmente com 50 μL de ACN puro, 3x, e depois 50 μL de TFA a 0,1% (v/v), 3x.
      NOTA: As microcolunas Oligo R3-C18-SPE podem ser preparadas com antecedência e armazenadas hidratadas por horas em temperatura ambiente antes do uso.
    3. Coloque as microcolunas Oligo R3-C18-SPE condicionadas em novos tubos de 1.5 mL junto com adaptadores de microcentrífuga. Aplique as misturas de peptídeos digeridos por tripticos nas microcolunas Oligo R3-C18-SPE e gire a 2.000 x g por 60 s. Várias rodadas de carregamento podem ser necessárias para volumes de amostra maiores que 50 μL.
    4. Lave as microcolunas Oligo R3-C18-SPE com 50 μL de TFA a 0,1% (v/v), 3x. Transfira as microcolunas de Oligo R3-C18-SPE para novos tubos de 1,5 mL em preparação para a eluição dos peptídeos dessalinizados.
    5. Eluir os peptídeos dessalinizados aplicando 50 μL de TFA a 0,1% em ACN a 50% (v/v), seguido de 50 μL de TFA a 0,1% em ACN a 70% (ambos v/v) a cada microcoluna de Oligo R3-C18-SPE. Gire após cada etapa.
      NOTA: É importante monitorar as microcolunas após cada centrifugação para garantir que a solução tenha sido completamente girada, pois isso facilitará a eluição eficiente.
    6. Colete, combine e seque os peptídeos dessalinizados em um sistema concentrador a vácuo.
      NOTA: Se estiver realizando proteômica paralela e de-N-glicoproteômica (consulte Discussão), divida as amostras de peptídeos dessalinizados e reserve frações separadas antes de secar.
  3. Enriquecimento de N-glicopeptídeo usando ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Prepare microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE caseiras conforme descrito abaixo.
      1. Usando uma seringa adequada, conecte e transfira os discos C8 para pontas de pipeta de 10 μL.
      2. Depositar uma pasta de resina ZIC-HILIC suspensa em metanol nas microcolunas C8-SPE. Coloque as microcolunas em tubos de 2 mL equipados com adaptadores de microcentrífuga para garantir que as microcolunas estejam suspensas no centro do tubo e gire para criar microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE com uma altura de coluna de ~ 1 cm (consulte a Figura 1iii). Preparar uma microcoluna ZIC-HILIC-C8-SPE para cada amostra.
    2. Para as etapas subsequentes de lavagem e carregamento de amostras, ajuste uma centrífuga de bancada para 6.000 rpm (~2.000 x g) e gire por 60 s para permitir que as fases móveis passem pelas microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE. Lave e condicione cada microcoluna ZIC-HILIC-C8-SPE sequencialmente com 50 μL de metanol, 3x, e depois 50 μL de água ultrapura, 3x, e finalmente 50 μL de TFA a 1% em 80% (ambos v/v) ACN, 3x.
      NOTA: As microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE podem ser preparadas com horas de antecedência, mas devem ser armazenadas hidratadas à temperatura ambiente antes do uso.
    3. Ressuspenda as misturas de peptídeos secos designadas para enriquecimento de N-glicopeptídeos em 50 μL de TFA a 1% em ACN a 80% (ambos v / v) e misture bem.
      NOTA: Se os peptídeos forem difíceis de dissolver novamente no solvente de carregamento HILIC, os peptídeos podem ser primeiro dissolvidos novamente em TFA a 10% (v / v) e, em seguida, rapidamente diluídos em ACN para atingir as concentrações do solvente de carregamento HILIC. Evite aquecer a amostra enquanto estiver em alta concentração de TFA para evitar a indução de hidrólise.
    4. Coloque as microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE condicionadas em novos tubos de 1.5 mL junto com adaptadores de microcentrífuga. Aplique as misturas de peptídeos ressuspensos nas microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE e gire a 2.000 x g por 60 s. Várias rodadas de carregamento podem ser necessárias para volumes de amostra maiores que 50 μL.
    5. Recolha a(s) fração(ões) de escoamento e volte a aplicar a(s) fração(ões) na mesma microcoluna ZIC-HILIC-C8-SPE. Repita a reaplicação 2x e mantenha os tubos de fluxo.
    6. Lave as microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE 2x com 50 μL de TFA a 1% em ACN a 80% (v/v), gire e combine esse fluxo com o fluxo da etapa 3.3.4.
      NOTA: A fração de fluxo combinada normalmente contém ~ 90% do material peptídico total, formando efetivamente a fração peptídica não modificada que, portanto, pode ser usada para análise separada a jusante (em vez de realizar um experimento do tipo proteômica separado).
    7. Transfira as microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE para novos tubos de microcentrífuga de baixa ligação de 1,5 mL. Eluir os N-glicopeptídeos retidos sequencialmente com 50 μL de TFA a 0,1% (v/v), seguidos por 50 μL de bicarbonato de amônio a 25 mM e, em seguida, 50 μL de ACN a 50% (v/v). Gire a 2.000 x g por 60 s após cada etapa.
      NOTA: O eluído normalmente contém ~ 10% do material peptídico total, a maioria dos quais deve ser N-glicopeptídeos se for alcançada alta eficiência de enriquecimento. É importante monitorar as microcolunas após cada centrifugação para garantir que a solução tenha sido completamente girada, pois isso facilitará a eluição eficiente.
    8. Coletar, combinar e secar os N-glicopeptídeos enriquecidos e (se necessário) o fluxo de peptídeos não modificados através de frações em um sistema concentrador de vácuo.
  4. LC-MS/MS de fase reversa de N-glicopeptídeos intactos
    1. Prepare os solventes LC conforme descrito abaixo.
      1. Solvente A: Prepare 1 L de ácido fórmico a 0,1% (v / v) em água ultrapura. Sonicar durante 15 min para desgaseificar o solvente. O solvente A pode ser armazenado por um mês a 20-25 °C.
      2. Solvente B: Prepare 1 L de ácido fórmico a 0,1% em 99,9% (ambos v/v) ACN. Sonicate por 15 min para desgaseificar. O solvente B pode ser armazenado por um mês a 20-25 °C.
    2. Ressuspenda as frações peptídicas secas em ácido fórmico a 0,1% (v / v) a uma concentração de aproximadamente 0,2-0,5 μg de peptídeo / μL e misture bem. Gire as amostras a 14.000 x g por 5 min e, em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para frascos de amostra MS, deixando aproximadamente 0,5 μL para trás para evitar a transferência de partículas e detritos indesejados.
    3. Para cada amostra, injetar ~0,5-1 μg de peptídeo total em uma coluna de armadilha C18-LC e separar os peptídeos em uma coluna analítica C18-LC a uma taxa de fluxo constante de 250 nL/min usando um sistema UPHLC conectado ao espectrômetro de massa com um gradiente de 2%-30% de solvente B durante 100 min, 30%-50% B durante 18 min, 50%-95% B em 1 min e 9 min a 95% (todos v/v) B no solvente A (ou uma configuração apropriada).
    4. Detecte os peptídeos com um espectrômetro de massa de alta resolução acoplado ao sistema nanoLC equipado com uma fonte de íons nano-eletrospray e operando no modo de polaridade de íons positivos.
    5. Para MS1, use uma faixa de varredura de aquisição de m/z 350-1.800, alta resolução de 60.000-120.000 FWHM a m/z 200 e uma tensão de fonte de ~2,5 kV. Defina o AGC para 3 x 106 íons com um tempo máximo de acumulação de 50 ms (ou configurações apropriadas).
    6. Para MS/MS, selecione os 20 íons precursores mais abundantes de cada varredura completa do MS1 para fragmentação usando o modo DDA empregando HCD-MS/MS com um NCE fixo de 35% ou sceHCD com NCE de 25%, 35% e 45%. É importante ressaltar que fixe o valor m /z mais baixo em 110 (por exemplo, faixa de varredura m/z 110 - 1.800) para observar todos os íons oxônio de baixa massa em cada espectro de fragmento.
    7. Selecione precursores que carreguem mais de 2 cargas (Z ≥ 2) para fragmentação. Adquira espectros (sce)HCD-MS/MS com resolução de 30.000-45.000 FWHM em m/z 200 com um AGC de 1 x 105 íons e tempo de acumulação de 90 ms usando uma janela de isolamento de precursor de ± 1,0 Th. Habilite a exclusão dinâmica de 30 s após o isolamento e fragmentação únicos de um determinado íon precursor.
      NOTA: Se o ETD estiver disponível, considere também adquirir EThcD-MS/MS de amostras de N-glicopeptídeos intactas usando o disparo de íons dependente do produto. Execute esta etapa quando os íons glicano oxônio diagnósticos (por exemplo, m / z 138.0545, 204.0867 e 366.1396) estiverem entre os 20 principais íons de fragmento dentro de cada espectro HCD-MS / MS39. Detecte os fragmentos de EThcD-MS/MS com resolução de 30.000-45.000 FWHM em m/z 200 com um AGC de 4 x 105 íons, tempo de injeção de 250 ms, HCD NCE de 15% e uma largura de isolamento do precursor de 1,6 Th.
  5. Análise de dados de glicoproteômica LC-MS/MS
    1. Confirmar o enriquecimento dos dados brutos de LC-MS/MS com N-glicopeptídeos, verificando se a maioria dos espectros de HCD-MS/MS contém íons de glicano oxônio (por exemplo, m/z 138.0545, 204.0867 e 366.1396) e (para estratégias de rotulagem) apresentam separação de linha de base dos íons repórteres TMT de baixa massa, alta eficiência de fragmentação nos espectros MS/MS e largura de pico LC estreita e alta precisão de MS, resolução e sinal-ruído.
    2. Usando um mecanismo de pesquisa (vários estão disponíveis; veja abaixo), pesquise os dados de MS/MS em busca de N-glicopeptídeos intactos em um banco de dados de proteínas/peptídeos adequado direcionado à amostra que está sendo investigada (por exemplo, obtido de um experimento de de-N-glicoproteômica) ou em todas as proteínas humanas UniProtKB revisadas. Adapte a pesquisa contra a N-glicosilação do peptídeo pesquisando peptídeos com Asn localizado em sequon. É importante ressaltar que selecione um banco de dados de N-glicanos informado por glicômica, ou seja, glicanos identificados a partir de dados glicômicos na etapa 2, para restringir o espaço de pesquisa a glicanos conhecidos na(s) amostra(s).
      NOTA: Pesquisas paralelas usando um amplo banco de dados de N-glicanos predefinido podem ser consideradas para descartar a existência de composições adicionais de N-glicanos nos dados.
    3. Adapte as variáveis de pesquisa restantes de acordo com a amostra que está sendo estudada, os procedimentos específicos de manuseio de amostras realizados e as configurações de MS empregadas e a instrumentação usada. As configurações de pesquisa comuns para a pesquisa de dados N-glicoproteômica incluem:
      Tolerância de massa do precursor e do produto: 10 ppm e 20 ppm
      Especificidade da protease: Totalmente específica e/ou semiespecífica (N-irregular)
      Clivagens perdidas permitidas: 2
      Modificações corrigidas: Cys carbamidometilação (+57.021 Da)
      Modificações variáveis: Oxidação met (+15,994 Da) (comum 1)
      Modificações variáveis permitidas por peptídeo: 1 ou 2
      Modificações de glicanos: banco de dados de glicanos informados por Glycomics (raro 1)
      Banco de dados de iscas e contaminantes de proteínas: Ativado
    4. Filtre todas as pesquisas para <1% de taxa de descoberta falsa (FDR) no nível da proteína e no nível do peptídeo. Considere apenas N-glicopeptídeos identificados com alta confiança (por exemplo, pontuações PEP 2D < 0,001) e execute anotação/curadoria manual da saída filtrada para reduzir ainda mais a taxa de identificação incorreta de N-glicopeptídeos, conforme discutido 36,40,41.
      NOTA: Glicopeptídeos com N-glicanos sialilados e multifucosilados e glicopeptídeos carregando outras modificações variáveis além dos glicanos (ou seja, oxidação de Met e desamidação de Asn / Gln) são particularmente propensos a interpretações errôneas pelos mecanismos de pesquisa41. Deve ser dada especial atenção à validação desses candidatos antes da apresentação de relatórios.

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Resultados

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Os resultados representativos do método glicoproteômico guiado por glicômica aplicado a uma lâmina de tecido FFPE de um paciente que sofre de CCR no estágio II são fornecidos nesta seção.

Para obter material de partida proteico suficiente para o protocolo, extratos de proteínas de duas lâminas (pilhas z) foram combinados do mesmo bloco de tecido FFPE seguindo um protocolo publicado e uma abordagem de marcação TMT foi aplicada para aumentar a sensibilidade do experimento de glicoproteômica (vej...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etapas críticas no protocolo
Neste artigo de protocolo, descrevemos passo a passo o método glicoproteômico guiado por glicômica, que fornece uma visão abrangente da heterogeneidade e dinâmica do glicoproteoma no TME complexo.

Uma etapa crítica no protocolo é garantir a proteólise completa sem digerir demais a mistura de proteínas. Clivagens inespecíficas de proteínas aumentam inerentemente o espaço de busca de peptídeos, levando a tempos de...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O THC é apoiado por uma bolsa de estudos do Programa Internacional de Treinamento em Pesquisa financiada pelo governo australiano. NB é apoiado por Bolsas de Estudo de Excelência em Pesquisa da Universidade Internacional Macquarie financiadas pela Universidade Macquarie. A AC é apoiada por uma bolsa de estudos do Programa de Treinamento em Pesquisa financiada pelo governo australiano. RK foi apoiado pelo Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul (ECF181259). O MTA recebeu uma bolsa de estudos do Conselho de Pesquisa Australiano (FT210100455).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos Químicos
amônio Sigma AldrichA1542Alternativas disponíveis
Bicarbonato de amônio, pureza ≥ 99.0%Sigma AldrichA6141Alternativas disponíveis
Acetonitrila anidra (ACN), grau LC-MS SigmaAldrich34851Alternativas disponíveis
Fetuin bovinoSigma AldrichF3004Alternativas disponíveis
Ditiotreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternativas disponíveis
EtanolSigma AldrichE7023Alternativas disponíveis
Ácido fórmico, grau LC-MSSigma Aldrich00940Alternativas disponíveis
Ácido acético glacialSigma AldrichA6283Alternativas disponíveis
Iodoacetamida (IAA)Sigma AldrichI1149Alternativas disponíveis
MetanolSigma AldrichM1775Alternativas disponíveis
Peptídeo-N-glicosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) expresso recombinantemente em Escherichia coli;
Polivinilpirrolidona 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternativas disponíveis
Hidróxido de potássio (KOH)Sigma Aldrich484016Alternativas disponíveis
Tripsina suína de grau de sequenciamento PromegaV5113Alternativas disponíveis
Borohidreto de sódio (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternativas disponíveis
Bicarbonato de trietilamônio (TEAB), grau LC-MSSigma AldrichT7408Alternativas disponíveis
Ácido trifluoroacético (TFA), grau LC-MS SigmaAldrichT6508Alternativas disponíveis
Ferramentas/Materiais
C18 discosEmpore66883-U
Discos C8Empore66882-U
Placa de polipropileno de fundo plano de 96 poços Corning3364
Immobilon-PSQ membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF)MilliporeIPVH20200Tamanho dos poros: 0,45 μ m 
MicrocentrífugaEppendorf5452000069Alternativas disponíveis
Adaptadores de microcentrífuga O Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Column Collar, vem com Microspin Columns
Oligo R3 resinaThermo1133903Tamanho de partícula 30 μ m
ParafilmParafilm MPM996
Tubos Protein LoBind 1,5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind tubos 2,0 mLEppendorf0030108442
Tubos Safe-lock 1,5 mLEppendorf0030120086
Tubos Safe-lock 2,0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternativas disponíveis
Furador de furo únicoSwingline74005
Concentrador SpeedVacMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternativas disponíveis
Supelclean ENVI-Carb Resina SPESupelco57088Tamanho de partícula 120-400 mesh. A resina pode ser extraída manualmente dos cartuchos e pode ser armazenada a longo prazo em 50% (v/v) de metanol em água MilliQ
Seringa 5 mLSigma AldrichZ116866Alternativas disponíveis
Incubadora com temperatura controladaThermolineE7.30Alternativas disponíveis
Banho ultrassônicoUnisonicsFXPAlternativas disponíveis
Resina ZIC-HILICMerck150455Tamanho da partícula/poro, 5 μ m/200 Å. A resina pode ser extraída manualmente da coluna LC e pode ser armazenada a longo prazo em 50% (v/v) de metanol em
micro-colunas de extração em fase sólida (SPE) ZipTip C18 da MilliQ water MilliporeZTC18S096Alternativamente, as micro-colunas C18-SPE caseiras podem substituir o produto comercial
LC-MS/MS Analysis
1260 Sistema de HPLC Capilar Infinito AgilentAlternativas disponíveis
Coluna LC analítica pré-embalada com resina ReproSil-Pur C18 AQDr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemanhar13.aq.s2570Tamanho da partícula/poro: 3 μ m/120 Å, comprimento/diâmetro interno: 25 cm/75 μm. Colunas comerciais C18 nano-LC também disponíveis/ 
Sistema Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC ThermoAlternatives disponíveis
HyperCarb KAPPA PGC coluna capilar LC descontinuado termicamente, 3 μ m/250 Å; comprimento da coluna, 30 mm; diâmetro interno, 0,180 mm. Geometrias maiores das colunas HyperCarb PGC-LC, produzindo dados de qualidade semelhantes, estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Thermo # 35003-031030). Coluna SupelTMCarb LC da Merck com tamanho de partícula/poro, 2,7 μ m/200 e com diferentes comprimentos de coluna e diâmetro interno também estão disponíveis (por exemplo, Merck #59994-U). 
Acetonitrila de grau LCMSLiChrosolv100029Alternativas disponíveis
Armadilha linear quadrupolo (LTQ) Espectrômetro de massa de armadilha de íons Velos Pro (glicômica) ThermoAlternativas disponíveis
Espectrômetro de Massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (glicoproteômica)ThermoOutros sistemas MS de alta resolução com ou sem ETD (necessários apenas para O-glicoproteômica) também estão disponíveis (por exemplo, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker ou espectrômetros de massa de alto desempenho semelhantes de outros fornecedores)
Frascos de parafuso de vidro transparente de recuperação total 0,9 mLThermoTHC11093563Alternativas disponíveis
Total Recovery Frascos de parafuso de vidro transparente tampas correspondentesThermoTHC09150869Alternativas disponíveis
Coluna Trap LC embalada internamente com resina ReproSil-Pur C18 AQ Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemanhar15.aq.s0202Tamanho da partícula/poro: 5 μ m/120 Å, comprimento/diâmetro interno: 2 cm/100 μm. Colunas LC de armadilha C18 comerciais também estão disponíveis.
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 ou superiorMotor de busca comercial de glicopeptídeos e PTM, aceitando dados brutos LC-MS/MS da maioria dos fornecedores de MS
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 ou superiorSoftware comercial para inspeção manual de candidatos a glicopeptídeos e anotação automática de espectros de glicano MS/MS
GlycoModExpasySoftware de acesso aberto, auxiliando na anotação de dados glicômicos (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Software de acesso aberto, auxiliando na anotação de dados glicômicos e no desenho de desenhos animados de glicanos
RawMeatVAST Scientificv2.1Software de acesso aberto, extraindo m/z de íons precursores de glicanos a partir de dados espectrais brutos
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 ou superiorSoftware de acesso aberto para quantificação relativa de glicanos
XcaliburThermov2.2 ou superiorPara navegar em dados brutos de LC-MS/MS
Acetato de Tamanho de partícula/poro

Referências

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